毕业设计(微波辅助法提取金银花中的绿原酸).doc

东北林业大学毕业论文中华人民共和国教育部东北林业大学 毕 业 论 文 论文题目： 微波辅助法提取金银花中的绿原酸 学 生： 王彦飞 指导教师： 史瑞欣 讲师 学 院： 理学院 专 业： 化学工程与工艺2006级1班 2010年6月东北林业大学毕 业 论 文 任 务 书论文题目 微波辅助法提取金银花中的绿原酸 指导教师 史瑞欣 讲师 专 业 化学工程与工艺2006级1班 学 生 王彦飞 2009年12月28日题目名称：微波辅助法提取金银花中的绿原酸任务内容（包括内容、计划、时间安排、完成工作量与水平具体要求）研究内容：针对金银花中绿原酸的现行提取工艺及单方提取的弊端，本课题将在天然产物提取方面具有被提取活性物质不被破坏、快速高效的微波新型提取技术应用于金银花中绿原酸的提取研究，着重探讨了微波功率、微波辐射时间、乙醇浓度、料液比等因素对金银花中的绿原酸提取率的影响，确定了最佳提取工艺。计划与时间安排：1、2009年12月28日2010年1月7日：查阅文献；2、2010年3月3日2010年3月14 日：实验方案设计；3、2010年3月17日2010年3月20日：准备实验所用器材和原料；4、2010年3月20日2010年5月31日：采用微波辅助的方法提取金银花中绿原酸的提取工艺进行；5、2010年6月1日2010年6月6日：处理实验数据和分析实验结果，找出最佳提取工艺条件；6、2010年6月6日2010年6月16日：撰写毕业论文，准备答辩； 完成工作量与水平具体要求：以金银花为原料，以绿原酸提取率为评价指标，考察微波功率,提取时间,乙醇浓度，溶媒比等因素对绿原酸提取率的影响，从而确定最佳提取工艺条件。 其中： 参考文献篇数：中文20篇（其中，外文文献3篇以上） 论 文 字 数： 10000字左右 外文翻译： 专业负责人意见签名：年 月 日微波辅助法提取金银花中的绿原酸摘 要本文采用微波乙醇辅助法提取金银花中的绿原酸，所制得的绿原酸提取液用双光束紫外分光光度计测定含量，以绿原酸的提取率作为评价指标，考察微波辐射时间、提取时间、乙醇溶液浓度、溶媒比等因素对绿原酸得率的影响，采用正交试验法确定了绿原酸的最优提取工艺条件：微波功率为300W,提取时间为1min，乙醇溶液浓度为50%，溶媒比为9，在此条件下绿原酸得率为32.690mg/g。关键词：金银花；绿原酸；微波乙醇法；正交试验 Extraction of Chlorogenic Acid from Flos Lonicerae byMicrowave-Assisted ExtractionAbstractChlorogenic acid was extracted from flos lonicerae by microwave-assisted extraction in this essay. Ultraviolet (UV) ray was used to estimate the extraction yield of chlorogenic acid from flos lonicerae. The effect of the factors such as miacrowave radiation time, extraction time, ethanol concentration and the ratio of the volume of the solvent to the weight of the flos lonicerae on the extraction yield of chlorogenic acid were studied. Orthogonal experiment was employed to investigate the optimum technological conditions and the results are as follows, microwave power is 300 W, extraction time is 1min, the concentration of ethanol is 50%, the ratio is 9:1, the extraction yield of chlorogenic acid under the conditions is 32.690mg/g. Key words：flos lonicerae；chlorogenic acid；microwave-assisted extraction；Orthogonal experiment目 录摘要Abstract1 绪论11.1 金银花中绿原酸提取工艺研究的必要性11.2 金银花简介11.2.1 挥发油成分21.2.2 皂苷类21.2.3 黄酮类21.2.4 有机酸类21.3 绿原酸的理化性质21.4 提取绿原酸的一般方法21.4.1 煎煮法21.4.2 乙醇回流提取法31.4.3 水体石灰乳沉淀法31.4.4 旋流提取法31.4.5 渗漉法31.4.6 超声波辅助提取发31.4.7 微波辅助提取法31.5 影响中药提取的因素41.5.1 被提取物质的理化性质41.5.2 预处理方法41.5.3 提取条件41.6 研究目的与研究内容52 实验部分62.1 实验药品62.2 实验仪器62.3 实验设计62.3.1 实验流程图设计62.3.2 微波辅助乙醇提取法实验方案设计72.3.2.1 预实验设计72.3.2.2 正交试验设计72.3.3 离心分离实验72.3.4 绿原酸含量测定82.3.5 金银花中绿原酸提取液的检测82.4 实验步骤82.4.1 预处理.82.4.1.1 粉碎82.4.1.2 预浸泡82.4.2 微波辅助法提取实验82.4.3 绿原酸含量的测定82.4.3.1 绿原酸标准曲线的绘制82.4.3.2 提取液中绿原酸含量的测定82.4.4 金银花中绿原酸提取液的检测92.4.4.1 紫外光谱扫描检测92.4.4.2 高效液相色谱扫描93 实验结果与讨论103.1 预实验结果分析103.2 微波辅助提取法正交试验结果分析103.2.1 实验数据处理113.2.2 因素与绿原酸提取率趋势图123.2.3 绿原酸提取液的检测133.2.3.1 紫外扫描法检测133.2.3.1 液相色谱扫描法检测144 结论15参考文献致谢东北林业大学毕业论文微波辅助法提取金银花中的绿原酸1 绪论1.1金银花中绿原酸提取工艺研究的必要性植物是许多天然药物的重要来源，中草药及其粗提物制剂的大量开发，使得植物药市场正以大于10%的速度增长。我国加入WTO后，促进了中药行业更好的与国际接轨，有利于引进先进技术和设备，然而中药发展也面临着严峻的挑战。我国的中药企业存在一小（规模小），二多（企业数量多，产品重复多），三低（科技含量低，管理水平低，自动化生产低）的弊端，中药剂型落后，各个环节（药材种植，炮制，制剂，包装，运输等）缺乏国际认可的标准规范控制，提取率较低，产品质量稳定性较差等问题，与我国的中药大国的地位极不相称1。一些中草药由于提取工艺的落后，不仅耗时费力，而且提取效果差。诸如金银花中绿原酸的提取过程中，需要提取3h，但是提取率仅为15。提取技术在中药、中药提取物、半成品及成品生产和质量控制中起着非常重要的作用，现在之所以很多质量标准无法制定，检测无法进行，主要是提取手段相对落后。长期以来形成的固有模式，设备陈旧等因素，不仅使中药的提取物粗糙，提取利用不完全，造成很大的资源浪费，而且给质量控制也带来很多的困难2。 中药及其产业发展即要克服面临的制约因素，革除传统中药理论与实践中的种种弊端，根本上说要实现中药现代化，引入现代科学理论，其中提取技术创新是重要内容。改革中药制剂型和生产工艺，减少药材原料的消耗，提高利用效率，走提取和纯化的道路，通过中药有效成分的浸出、分离和精制，取其精华弃其糟粕，开发出高效、优质、稳定的“三效”（高效，速效，长效）、“三小”（剂量小、毒性小、副作用小）、“三便”（贮存、携带、服用方便）的新型中药。要实现中药生产的专业化和现代化，首先使中药提取成为现代天然产物提取技术的一个组成部分，使各种先进的提取技术应用于中药生产中，以节约能源，缩短时间，更能够提高提取效率为主要目标，从而提高中药制剂中有效成分的含量，清除杂质，保证制剂药理效应，处方的量效关系的均一和稳定，是中药生产发展的必然要求3。因此中药提取技术在中药现代化生产中，尤其对于成分复杂的复方中药的生产来说就显得很重要。1.2金银花简介金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。金银花即忍冬花，其名始见本草纲目忍冬项下。忍冬始载于名医别录，列为上品。陶弘景曰：“处处有之，藤生凌冬不凋，故名忍冬”。李时珍谓：“忍冬，附树延蔓，茎微紫色，对节生叶。叶似薜荔而青，有淌毛。三四月开花，长寸许，一蒂两花二瓣，一大一小，如半边状，长蕊。花初开者，蕊瓣俱白色，经二三日，则色变黄，新旧相参，黄白相映，故呼金银花”，又谓“茎叶及花，功用皆同”4。我国传统医学认为，金银花的性味是甘、寒，归经为肺、心和胃，具有清热解毒，凉散风热的功效。药理实验表明，金银花的提取物具有显著的抗菌作用，其化学成分包括挥发油、有机酸、黄酮类、皂苷类等。1.2.1挥发油成分挥发油中的化学成分因金银花的产地、品种的不同而存在差异，金银花鲜花与干花挥发油成分差异较大。鲜花挥发油大多以低沸点的不饱和萜烯类成分为主，芳樟醇的含量普遍较高；干花挥发油成分以棕榈酸为主5，一般可占挥发油的26以上，芳香醇只占0.39以上。挥发油具有挥发性，不与水互溶，可随水蒸气蒸馏出来。1.2.2皂苷类金银花中有六个糖基的三萜皂苷，皂苷类化合物是糖或糖的衍生物与另一种非糖物质通过糖的端基碳原子连接而成的一类化合物。一般溶于水、稀醇等，难溶于亲脂性有机溶剂，并可以在含水丁醇或戊醇中溶解度较好。1.2.3黄酮类金银花中含有的黄酮类化合物被鉴定为木犀草素-7-o-D-葡萄糖苷等。一般能溶于水，稀醇和乙酸乙脂等极性溶剂中。1.2.4有机酸类绿原酸、异绿原酸、咖啡酸、棕榈酸等均为金银花中的有机酸类成分，其中绿原酸类化合物为金银花的主要有效成分。此类化合物包括绿原酸和异绿原酸。经研究表明，绿原酸是一种苞内物质；异绿原酸为一种混合物，已发现其存在7种异构体。1.3 绿原酸的理化性质绿原酸在植物中分布很广，从高等双叶植物到蕨类植物均有报道6-8，主要存在于忍冬科忍冬属、菊科篙属及杜仲科杜仲属植物中，其中含量较高的植物主要有杜仲、金银花、咖啡与可可树。绿原酸为一种有机酸，是植物有氧呼吸过程中形成的一种苯丙素类物质，即一分子咖啡酸与一分子奎宁酸结合而成的酯，异名咖啡鞣酸，也属于酚类化合物。分子式是C16H18O9，其分子具有邻苯二酚的羧基结构，结构式见图1-1，分子量为354.3。在25水中溶解度为4%，热水中溶解度更大，易溶于乙醇及丙酮，极微溶于乙酸乙酯。图1-1绿原酸的结构式1.4提取绿原酸的一般方法9-13金银花中主要的活性成分为绿原酸，文献表明提取绿原酸的主要方法有：1.4.1煎煮法煎煮法是我国最早使用的传统浸提方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。传统水煎法具有煎煮费时、携带不便、起效缓慢、作用温和等特点。1.4.2乙醇回流提取法应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。溶剂浸过药材表面约(12)cm。在水浴中加热回流，一保持沸腾约1小时，根据不同药物成分的性质选择过滤的温度，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流，分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高大量生产中多采用连续提取法。1.4.3水提石灰乳沉淀法本方法利用绿原酸的酸性特质，提取液加石灰乳使绿原酸类成分生成钙盐而被沉淀。沉淀物用稀硫酸分解，又有硫酸钙产生。过滤从而得到绿原酸。1.4.4旋流提取法采用PT-1型组织搅拌机，搅拌速度为8000r/min。药材不必预先加以粉碎。提取用水温度分别为20和100，处理时间(2030)min。旋流法提取金盏花，对提取液中黄酮类化合物、皂苷等进行分析表明，该法的提取效率较煎煮法高。1.4.5渗漉法 渗漉法是将中药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。小量溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗漉过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止，或当渗滴液颜色极浅，渗涌液的体积相当于原药材重的10倍时，便可认为基本上提取完全，在大量生产中常将收集的稀渗漉液作为另一批新原料的溶剂之用，提取时间一般较长。1.4.6超声波辅助提取法14超声波是一种高频机械波，频率范围为(1530)kHz，一般高于20kHz。其主要特征是波长短，近似作直线传播，在固体和液体内衰减比电磁波小，其传播特性和媒质的性质密切有关。能量集中，能形成高的温度，产生剧烈振动，引起激震波、波体中的空化作用等，结果产生机械、热、光、电、化学及生物等各种效应。对于溶媒的选择，由于水的表面张力相对来讲比较大，因此它是一种效果很好的空化液，若在水中加入乙醇，则空化效果就更好些，掺乙醇会使水的饱和蒸气压大大增加，但同时也会使表面张力下降，不过有饱和蒸气压增大给空化带来的益处远远大于由于表面张力下降所带来的不利效果。且超声波的热效应使水温基本在57,对一些热敏性物质的提取提供了良好的条件。1.4.7微波辅助提取法微波辅助提取法是Ganzler于1986年首先提出来的。微波提取技术主要是基于微波的热特性，而微波加热的原理有两个方面，一是通过“介电损耗”(或称为“介电加热”）。具有永久偶极的分子在2450MHz的电磁场中所能产生的共振频率高达4.9109次/s，使分子超高速旋转，平均动能迅速增加，从而导致温度升高；二是通过离子传导。离子化的物质在超高频电磁场中以超高速运动，因摩擦而产生热效应。热效应的强弱取决于离子的大小、电荷的多少、传导性能及溶剂的相互作用等。一般来讲，具有较大介电常数的化合物如水、乙醇等，在微波辐射作用下会迅速被加热，而极性小的化合物、无静偶极的化合物（如二氧化碳和四氯化碳等）以及高度结晶的物质，对微波辐射能量的吸收性能很差，不易被加热。微波处理这种方法是适用于对热稳定的产物，如寡糖、多糖、核酸、生物碱、黄酮、苷类等中药成分。用此法可以大大提高提取收率，缩短提取时间，的特性和品质。本法已经在生物碱类、有机酸类的提取中得到应用。1.5影响中药提取的因素由于中药原料品种繁多，其组织和成分又极其复杂，造成多个因素影响中药提取过程中的效率。概括起来包括：被提取物质的理化性质，预处理方法，提取条件等。1.5.1被提取物质的理化性质被提取物质的理化性质包括原料结构和原料的化学性质。原料结构：提取溶媒通过多孔的细胞壁进行提取时，溶媒和以分子状态散于溶媒中的化学成分很容易通过薄膜细胞膜溶出。原料的化学性质：由于扩散系数与扩散物质的分子半径成反比，因此在提取过程中，原料中可溶性化学成分分子的半径大小不同，其扩散速度也必然不同。在溶解度相同情况下，分子小的化学成分先溶解，先扩散；大分子成分则后溶解，后扩散。扩散的条件还在于其溶解度的大小15-17。易溶性的化学成分，即使分子大也能尽先扩散。1.5.2预处理方法(1)粉碎粉碎是用机械方法把物料制成适当程度的碎块或细粉的操作过程。多数中药材是植物或动物性的生药，这些生药的细胞组织很紧密，细胞壁也很厚，使溶剂不易渗透或扩散，有效成分或该溶媒中的可溶物很难被浸出来。中药材粉碎是为了增加药材的表面积，使中药材中的有效成分更易浸出，提高浸出速度。但是粉碎的程度也有影响，粒度过小，也会产生负面作用。粉碎度的选择与浸取的方法与设备，浸出溶剂，药材的种类，组成成分等有关。(2)预浸泡中药材的待加工状态多数是干燥状态，在正式浸取前予以适当的浸泡，吸收溶媒，使之组织浸润膨胀，将有利于浸取时溶质的加速溶解和扩散。因为浸取时大多数情况下温度较高，如果中药材原料直接与热溶媒接触，会使表面的蛋白质层受热凝固，从而妨碍后续溶媒对细胞组织的渗透浸润，因此用冷溶媒浸泡待提取原料将会避免这一弊端。1.5.3提取条件(1)提取液的pH值在中药材浸提过程中，往往根据需要调整浸取溶剂的pH值，以利于某些有效成分的提取，增加制剂的稳定性。如用酸性溶媒提取有机酸，用碱性溶媒提取皂苷等。常用的辅助剂有酸、碱、酶及表面活性剂等。浸提溶剂中加碱的目的是增加有机酸、皂苷、黄酮、葸醌和某些酚性成分的溶解度和稳定性。例如在浸提甘草时加入少许氨水，能使甘草酸形成可溶性铵盐，保证甘草酸的完全浸出。常用的碱为氢氧化铵（氨水），因为它是弱碱，对成分的破坏较弱，易于控制其用量，且加热后即可除去，不产生残留。有时也选用碳酸钙、氢氧化钙、碳酸钠等。浸提溶剂中加酸的主要目的：一是使有机酸游离，便于用有机溶剂浸提，除去酸不溶性杂质等；二是促进生物碱的浸出，提高部分生物碱的稳定性。常用的酸有硫酸、盐酸、醋酸、酒石酸等。通常使用10以下的稀酸操作，维持需要的pH值，否则会导致成分的破坏或水解。文献表明8，在弱酸性条件下，咖啡酸和鞣酸较易合成为绿原酸。(2)提取温度溶质在溶剂中的溶解速度及溶解度随温度升高而增加，扩散系数亦随温度升高而增加，故随温度的升高提取速度和提取收率均有提高。同时随温度的升高，杂质混入增多，热敏性组分可能被分解破坏，易挥发性组分损失加大。提取操作时对温度要进行适当的控制。(3)提取时间被浸出物质在不同的浸出时间内其浸出量是不同的。开始是由于药材内部和浸出溶剂之间的浓度差比较大，扩散速度快、浸出速度也较快。随着时间的延长，浓度差趋于缩小，浸出速度逐渐降低，最终达到扩散平衡状态。一方面浸出时间越长，则浸出物的浸出越充分，越彻底，从表面看似乎是有利的，另一方面，当药材中被浸出物的含量降低到一定程度后仍然延长浸取过程，则此后实际得到的有效物质是极少的，反而使各方面消耗增加，设备利用率降低。有效成分长时间受热会导致生物活性的破坏，大量杂质成分溶出，结果得不偿失。因此浸出时间要控制适当，要根据具体情况而有所增减18-20。(4)溶媒的选择溶媒的性质不同，对各种化学成分的溶解性不同，提取出的化学成分也不一样，因此，选择合适的提取溶媒，与提取效果及针剂质量关系密切。理想的提取溶媒应符合下列条件：能最大量的提取中草药的有效成分，而不提取或极少量提取杂质；性质稳定，不应与有效成分发生化学反应；廉价易得，或可以回收；使用方便，操作安全。目前在配制中药针剂中，常用水和乙醇作提取溶媒。(5)溶媒用量与提取次数溶媒选定后，溶媒用量和提取次数对提取效果也有很大影响，对浸取物的质量和收率以及能耗有极大影响。在中药浸出生产过程中，要用最少量的溶剂，得到最高的浸出药量。通过固定药液量控制加水量，即药液量加水量-方药总吸水量-蒸发量，所以只要解决方药总吸水量和蒸发量再由固定的煎药液量，就可得出提取时的加水量，首次提取时的药液量应大于有效溶质溶解所需的溶媒量。对于具体的提取设备，单位时间的水蒸发量是可知的，单位方药饮片的吸水量也可通过实验测定21-22。显然，在定量溶媒的情况下，多次提取较一次提取可提高浸出率。但不适当地增加次数对生产又将增加能耗，而且溶媒用量和提取次数还受药材性质和状态的影响。1.6研究目的与研究内容针对金银花中绿原酸的现行提取工艺及单方提取的弊端，本课题将在天然产物提取方面具有被提取活性物质不被破坏、快速高效的微波新型提取技术应用于金银花中绿原酸的提取研究，着重探讨了微波功率、微波辐射时间、乙醇浓度、料液比等因素对金银花中的绿原酸提取率的影响，确定了最佳提取工艺。2实验部分2.1 实验药品金银花花蕾干制品（海晖大药房）绿原酸对照品（中国药品生物制品鉴定所）无水乙醇（AR） 无水碳酸钠（AR） 38%盐酸溶液2.2 实验仪器仪器名称 规格及型号 生产厂家高速万能粉碎机 FW10 天津市泰斯特仪器有限公司 实验专用微波炉 NJL07-3 南京杰全微波炉设备有限公司 低速台式自动平衡离心机 DT5-2 北京时代北利离心机有限公司 双光速紫外可见分光光度计 TU-1901 北京普析通用仪器有限责任公司 安捷伦高效液相色谱仪 Agilent 1100 江苏舜星科技有限公司 万分之一分析天平 BT224S 赛多利斯科学仪器有限公司2.3实验设计本课题采用正交试验法，以微波乙醇辅助提取法对金银花中的绿原酸进行提取，探索金银花中绿原酸的最佳提取条件。2.3.1实验流程图设计图2-1为提取实验的流程图 金银花花蕾 粉碎 预浸泡 调pH值 第一次微波提取 离心分离 第二次微波提取 调pH值 药渣 离心分离 药渣 调pH值 第三次微波提取 离心分离 滤液 弃去滤渣 滤液 滤液 合并滤液 紫外分光光度计定量图2-1实验的流程图2.3.2微波辅助乙醇提取法实验方案设计 由于微波作用机理的特殊性，乙醇沸点较低的特性，在煎煮法、乙醇回流法、超声波提取法等其他提取法中不能产生显著影响的因素，在微波乙醇辅助提取法中可能就会有影响，因此设计预实验和正交试验综合考察各种因素对微波乙醇辅助提取法的影响，以便于后续实验的顺利有效进行。2.3.2.1预实验设计对于微波提取次数和药材浸泡与否对微波乙醇辅助提取实验中绿原酸得率的影响，文献中的作者得出了不同的结论，因此通过设计预实验来考察微波辅助提取次数和药材浸泡与否对提取金银花中绿原酸得率的影响，根据实验结果来确定实验方案中微波辅助提取次数和选择是否将药材浸泡。金银花入水后的自然pH值为3.54.0，呈酸性，适合提取实验的进行，因此预实验时不做调整。考察微波辅助提取次数的实验为预实验1，预实验2，预实验3，预实验4；考察药材浸泡与否的实验为预实验5，实验条件如表2-1所示。表2-1预实验条件 因素实验提取功率 乙醇浓度 提取时间 溶媒用量 预浸泡时间 提取次数(W) （%） （min） （mL/g） （h）12345250 70 2 10 0 1250 70 2 10 0 2250 70 2 10 0 3250 70 2 10 0 4250 70 2 10 24 42.3.2.2正交试验设计由于酸性提取环境有利于有机酸类成分的提取，因此溶液pH值保持酸性是提取共同满足的条件。在本实验中考察如下因素对绿原酸提取率的影响趋势，正交表选用L25(54),因素水平如表2-2所示。表2-2微波辅助提取法正交试验因素表 因素水平A，微波功率 B，提取时间 C，乙醇浓度 D，溶媒用量 （W） (min) （%） （mL/g）1200 1.0 40 82 250 1.5 50 93 300 2.0 60 104 350 2.5 70 115 400 3.0 80 122.3.3离心分离实验离心分离是利用比重力更强大的离心场力来促进颗粒和液体的运动，不但可以用于液固分离，还可以用于液液分离。药液分离效果的好坏，在于分离因数的大小，分离因数越大药渣与药液的分离效率就越高。对于本实验给定的离心机设备，离心分离机上分离试管的回转半径，重力加速度都是固定的，所以增加角速度是提高分离效果的决定因素。根据实验效果，选择3000r/min，分离5min，分离效果较好。2.3.4绿原酸含量测定取适量绿原酸标准品，配制成标准液，在双光束紫外分光光度计中利用五点法绘制出标准曲线，根据标准曲线测出提取液中绿原酸的含量。2.3.5金银花中绿原酸提取液的检测根据药典规定金银花中的有效成分主要是绿原酸，这也是控制某些含金银花药材的质量指标。金银花经过提取后，需对其中的绿原酸进行检测，以确认实验方案的合理性。本文采用双光束紫外分光光度计TU-1901和安捷伦高效液相色谱仪1100对提取液中的绿原酸进行检测。2.4实验步骤2.4.1预处理2.4.1.1粉碎(1)将粉碎机的进料盖打开，放入一定量的金银花，放入量不宜过多，打开粉碎机开关进行粉碎，待放入的金银花原料全部粉碎后关闭开关；(2)取出粉碎后的金银花粉末倒入烧杯中；(3)检查金银花粉末是否达到20目，未达到应重新进行粉碎；(4)实验结束，清理仪器；2.4.1.2预浸泡(1) 按实验编号称取大约2g的金银花放入烧杯中，加入相应条件下的溶媒，摇匀、测定与调节pH值后，浸泡24h；(2) 浸泡过程中烧杯需用保鲜膜密封，以避免溶媒蒸发，影响实验结果；(3) 浸泡结束，重新调节药液pH值，并将药液置入微波提取装置，准备提取实验。2.4.2微波辅助法提取实验(1)打开微波发生器开关，设定反应所需功率及提取时间，开始实验。(2) 第一次提取完毕，用离心机分离药液与药渣，并将药渣完全回收，加入预定数量的溶媒并进行第二次提取；第二次提取后，用离心机分离药液与药渣，并将药渣完全回收，加入预定数量的溶媒并进行第三次提取，提取完毕后用离心机分离药液与药渣。(3)合并三次提取液，并弃去药渣；(4)实验完成后关闭微波发生器开关。2.4.3绿原酸含量的测定2.4.3.1绿原酸标准曲线的绘制称取绿原酸标准品0.0050 g，用蒸馏水为溶剂定容于100mL棕色容量瓶中，从中分别取 1mL，2mL，3mL，4mL，5mL定容于50mL容量瓶中，绘制标准曲线。2.4.3.2提取液中绿原酸含量测定将提取液定容于250mL容量瓶中，静止片刻后，取5mL定容于250mL容量瓶中，在最大吸收波长处测其含量，从而计算出绿原酸的提取率。2.4.4金银花中绿原酸提取液的检测2.4.4.1紫外光谱扫描检测取适量的绿原酸标准品溶液，绿原酸提取液稀释溶液，用双光束紫外分光光度计TU-1901在200600nm范围内进行扫描。2.4.4.2高效液相色谱扫描采用高效液相色谱法对绿原酸标准品及提取液进行分析，测试条件如表2-3所示表2-3高效液相色谱检测所需色谱条件表项目 检测条件色谱柱 ZORBAX Eclipse柱流动相 18%乙醇溶液检测波长 324nm流速 0.5mL/min柱温 26（室温） 时间 5min 3实验结果分析与讨论3.1预实验结果分析预实验金银花中绿原酸提取率如表3-1所示表3-1预实验实验结果 因素实验微波功率 提取时间 乙醇浓度 溶媒用量 预浸泡时间 提取次数 提取率（W） (min) （%） （mL/g） (h) （mg/g） 1 2 3 4 5250 70 2 10 0 1 11.584250 70 2 10 0 2 13.744250 70 2 10 0 3 14.578250 70 2 10 0 4 14.597250 70 2 10 24 4 15.791 单位质量药材的总外表面积越大，有利于溶剂的渗透及溶质向主体传递，但是金银花系花类药材，质地较松散，在提取时间较长的情况下，药材粉碎与否对提取结果影响不大。从表3-1中可以看出：由于微波辅助法提取时间较短，药材预浸泡对提取结果影响较大，因此在后续工作中对金银花均进行预浸泡。从图3-1中可以看出，随着微波次数的增多，绿原酸的得率不断提高，但当微波次数达到3次以后，绿原酸得率趋于稳定，考虑到后续工作的方便，以后实验中均采取3次微波辅助提取。图3-1微波次数对绿原酸提取率的影响3.2微波辅助提取法正交试验结果分析本实验以金银花中绿原酸的提取率为考核指标，对实验结果进行分析，对实验条件进行评价。3.2.1实验数据处理正交试验结果及极差分析如表3-2所示，方差分析结果如表3-3所示。由极差分析和方差分析结果可知，各因素对绿原酸提取率影响的主次顺序为ADCB，其中因素A即微波提取功率对绿原酸提取率影响最大。最优组合为A3B1C2D2，即微波辅助提取功率为300W，提取时间为1min，以50%的乙醇溶液为溶媒，溶媒比为9。表3-2微波辅助提取法绿原酸提取率正交试验结果极差分析实验号 A B C D 提取率（mg/g）01 1 1 1 1 14.68402 1 2 2 2 16.43003 1 3 3 3 15.23104 1 4 4 4 13.58005 1 5 5 5 13.75706 2 1 2 3 15.31307 2 2 3 4 14.83608 2 3 4 5 18.40809 2 4 5 1 18.62510 2 5 1 2 16.40911 3 1 3 5 16.21512 3 2 4 1 17.36213 3 3 5 2 18.46614 3 4 1 3 19.04815 3 5 2 4 21.81316 4 1 4 2 21.62917 4 2 5 3 17.30718 4 3 1 4 16.01919 4 4 2 5 16.78120 4 5 3 1 16.97221 5 1 5 4 16.01922 5 2 1 5 15.78123 5 3 2 1 15.06324 5 4 3 2 14.85425 5 5 4 3 13.583均值1 14.736 16.722 16.388 16.541 均值2 16.718 16.343 17.080 17.558 均值3 18.581 16.637 15.622 16.096 均值4 17.742 16.578 16.912 16.453 均值5 15.060 16.507 16.835 16.188 极差 3.845 0.429 1.458 1.462 表3-3微波辅助提取法正交试验绿原酸得率方差结果平方和 自由度 方差 方差比 F显著性 A B C D55.400 4 13.85 3.184 * 0.504 4 0.126 0.0296.900 4 1.725 0.3976.789 4 1.697 0.3913.2.2因素与绿原酸提取率趋势图以各因素水平为横坐标，试验指标的平均值为纵坐标，绘制因素与指标趋势图。 图3-2微波功率对提取率影响趋势 图3-3提取时间对提取率影响趋势图3-4溶媒比对提取率影响趋势 图3-5乙醇浓度提取率影响趋势微波提取时间对绿原酸提取率的影响如图3-2所示，绿原酸提取率在提取功率为200300W之间有所上升,在达到300W后绿原酸提取率逐渐下降。这是因为随着微波提取功率的增大，加速有效成分的溶出，烧杯内乙醇溶液温度随微波功率的增大而升高，升温可强化细胞壁内的分子的运动，提高扩散系数。但是当功率继续增加时，温度将继续升高，温度高于80对绿原酸的稳定性造成影响，以及实验因素间的相互作用，造成绿原酸提取率降低。微波功率对绿原酸提取率的影响如图3-3所示，提取时间为1min时，绿原酸提取提取率最高，随着提取时间的增加，提取液温度逐渐升高，造成绿原酸提取率降低。溶媒比对绿原酸提取率的影响如图3-4所示，溶媒比为9时，绿原酸提取提取率最高，原因是溶媒过少，溶液易达到饱和，有效成分不足以提取完全，溶媒过多不利于绿原酸提取，且浪费溶剂。乙醇浓度对绿原酸提取率的影响如图3-5所示,乙醇的体积分数为50%时，绿原酸提取率最高，随着乙醇浓度的升高，提取率下降，因为随着乙醇浓度的增加，一些蛋白质的溶解度较少，粘液质从提取液中沉淀下来，一方面附着在药材表面，阻碍了药材颗粒中绿原酸的溶出，降低了传质效率；另一方面粘液质可能把一部分有效成分连带沉淀下来，造成有效成分的损失。所以当乙醇体积分数进一步增加时，绿原酸得率出现了缓慢下降的趋势这一点在绿原酸的水提醇沉法提取中得到了验证。乙醇是常用的有机溶剂，溶解性好，对植物细胞组织的穿透能力强，而且提取液不易变质。因为中药提取，除了为了尽可能多得提取有效成分外，也需尽量去处无效成分，尽可能增加保存的时间，以保证中药制剂的质量。但是由于乙醇是中性溶剂，对一些中药有效成分的溶解度有一定的限制，对药材的浸润能力不理想，而乙醇和水按一定比例溶在一起，由于亲水性和亲脂性均较好，可以快速充分的浸润药材。3.2.3绿原酸提取液的检测3.2.3.1紫外扫描法检测取适量的绿原酸标准品溶液，绿原酸提取液稀释溶液，用双光束紫外分光光度计TU-1901在200600nm范围内进行扫描，得紫外光谱图。图3-6绿原酸标准品紫外扫描图图3-7绿原酸提取液紫外扫描图图3-6为绿原酸标准品在波长200600nm扫描所得的图谱，可见在324nm波长处出现最大吸收波峰；图3-7为绿原酸提取液在波长200600nm扫描所得的图谱，可见提取液也在324nm波长处出现最大吸收波峰，与绿原酸标准品紫外扫描图谱一致，同时与文献相符，说明提取液中的主要成分为绿原酸。3.2.3.1液相色描法检测图3-8，图3-9分别为绿原酸标准品和绿原酸提取液的液相色谱图。由两图可以明显看出出现主峰的时间相同基本相同，可以断定提取液为绿原酸。图3-8绿原酸标准品液相色谱图 图3-9绿原酸提取液液相色谱图4结论本文对微波辅助法提取金银花中绿原酸的提取工艺进行了研究。采用正交试验法对影响绿原酸提取率的四个主要影响因素：微波功率，微波提取时间