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微生物与发酵工程 本章知识结构及教学要求 第四节酶工程简 介（选学） 第三节发酵工程简 介 第二节微生物的营 养、代谢和生长 第一节微生物的类 群 酶制剂的生产（A知道） 酶制剂的应用（A知道） 生物工程各分支领域的关系（A知 道） 细菌、放线菌病毒的结构和繁殖（B识 记） 发酵工程的概念和 内容 （A知道 ） 发酵工程的应用（A知道） 营养物质来源及功能（D应用） 培养基的种类和配制原则（D应用） 代谢产物的种类和主要功能（C理解） 微生物代谢调节方式以及在生产实践中如何人工控制微生物代 谢（D） 发酵概念和种类（C理解） 微生物群体生长规律及其在生产中的应用（C理解） 测定微生物群体生长的方法（B识记） 温度、PH和氧等因素对微生物生长的影响（C理解） 微生物的类群 微生物？ 魏泰克的五界说 原核生物界:细菌、放线菌等 原生生物界:藻类、原生动物等 真菌界:酵母、霉菌 植物界 动物界 病毒 无细胞结构：病 毒 有细胞结构 真核生物 微生物 细菌 放线菌 蓝藻 支原体 真菌：霉菌、酵母菌、食用真菌 原生生物：藻类、原生动物等 细菌 一、形态 球状 杆状 螺旋状 基本形态 1、细胞壁 如果将杆菌接入浓度为0.2mol/L的蔗糖等 渗溶液和盛有玻璃珠的三角瓶中加以摇 动，可以使细胞壁破裂，细胞内含物流 出，这样就可以得到细胞壁的空壳。空 壳成杆状，而细胞内含物却是圆的。 原生质体 在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而 抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、 对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。 特点： 对环境条件变化敏感，低渗透压、振荡、离心甚至 通气等都易引起其破裂； 五肽交联桥 五个甘氨酸 聚糖骨架 G：N-乙酰葡萄胺 M：N-乙酰胞壁酸 四肽侧链 L-丙、D-谷、L-赖、D-丙 主要成分 肽聚糖 G+ 菌肽聚糖结构: 细 胞 壁 2 细胞膜 证明细胞膜的存在（质壁分离、选择性染 色、原生质体破裂或电镜观察等方法） 细胞膜的生理功能： 选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送； 合成细胞壁和糖被的各种组分（肽聚糖、磷壁酸、 荚膜多糖等）的重要基地； 膜上含有氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢的酶系， 是细胞的产能场所； 含有抗药性基因、固氮基因、抗生素生 成基因 3 细菌质粒 4核糖体 不同于真核生物。链霉素等抗生素通常作 用于核糖体从而抑制蛋白质的合成，但对 人核糖体不起作用。所以可用链霉素治疗 由细菌引起的疾病。 a. 主要成分是多糖、多肽或蛋白质，尤以多糖居多。 经特殊的荚膜染色，特别是负染色（又称背景染色） 后可在光学显微镜清楚地观察到它的存在。 b. 荚膜等并非细胞生活的必要结构，但它对细菌在环境 中的生存有利。 荚膜 某些细菌在 其生长发育后期 ，在细胞内形成 一个圆形或椭圆 形、厚壁、含水 量极低、抗逆性 极强的休眠体， 称为芽孢(内生孢 子）。 芽孢 细菌芽孢的特点 整个生物界中抗逆性最强的生命体，是否能消灭芽孢 是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。 芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变 成为营养态细胞；产芽孢细菌的保藏多用其芽孢。 芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和 鉴定中的重要指标。 6 细菌的二分裂 放线菌是具有菌丝、以孢子进行繁殖的一类原核微生物 。 放线菌 形态与结构 t单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成； t菌丝直径与杆菌类似，约1mm； t细胞壁组成与细菌类似； t细胞的结构与细菌基本相同， 按形态和功能可分为营养、气生和孢子丝三种。 1、营养菌丝 匍匐生长于培养基内，吸收营养，也称基内菌丝。一般无隔膜， 直径0.2-0.8 mm，长度差别很大 2、气生菌丝 营养菌丝发育到一定阶段，伸向空间形成气生菌丝，叠生于营养 菌丝上，可覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下观察，颜色较深 ，直径较粗（1-1.4 mm），有的产色素。 3、孢子丝 气生菌丝发育到一定阶段，其上可分化出形成孢子的菌丝，即孢 子丝，又称产孢丝或繁殖菌丝。其形状和排列方式因种而异，常 被作为对放线菌进行分类的依据。 分布特点及与人类的关系 放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界， 土壤中最多，其代谢产物使土壤具有特殊的泥腥味。 能产生大量的、种类繁多的抗生素（其中90%由链霉 菌产生） 少数寄生型放线菌可引起人、动物（如皮肤、脑、肺和脚 部感染）的疾病。 蓝细菌 也称蓝藻或蓝绿藻，是一类含有叶绿素a、能以水作为 供氢体和电子供体、通过光合作用将光能转变成化学能 、同化CO2为有机物质的光合细菌。 以前曾归于藻类，因为它和高等植物一样具有光和色素 -叶绿素a，能进行产氧型光合作用。 典型病毒粒的构造 基本成分 核酸位于中心，称为核心 蛋白质包围在核心周围，形成衣壳 核心和衣壳合称核衣壳，为病毒的基本结构。有些复 杂的病毒在衣壳的外面包裹着一层由脂类、蛋白质和多糖组成 的囊膜。有的囊膜上还长有刺突。 8 病毒 8 病毒 学生提出的问题： 囊膜的成分为什么与细胞膜的成分相同？ 囊膜上的蛋白质是否决定病毒抗原特异性？ 囊膜的作用是什么？ 刺突的作用？ 病毒粒子并无个体的生长过程，而只有其两种基本成分 的合成和装配，即： 核酸复制+蛋白质合成核蛋白（病毒粒子） 一般可分五个阶段，即 1) 吸附 2) 侵入 3) 增殖（复制与生物合成） 4) 成熟（装配） 5) 裂解（释放） 病毒繁殖 艾 滋 病 毒 侵 染 1 病毒特点 无细胞结构，专性活细胞内寄生； v 没有酶或酶系统极不完全，不能进行代谢活动 ； v 个体极小，能通过细菌滤器； v 对抗生素不敏感，对干扰素敏感。 小结 2 细菌、放线菌和病毒的比较表 碳源、氮源、生长因子、无机盐和水 能源 1.碳源 微生物生长过程中能为微生物提供碳素来源的物质 碳源谱 有机碳 无机碳 异养微生物 自养微生物 微生物营养 目前在微生物工业发酵中所利用的碳源物质主 要是单糖、淀粉、麸皮、米糠等。 对于为数众多的化能异养微生物来说，碳源 是兼有能源功能营养物。 微生物利用的碳源物质主要有糖类、有机酸、 醇、脂类、烃、CO2及碳酸盐等。 凡是能被用来构成菌体物质中或代谢产物 中氮素来源的营养物质称为氮源。 1.氮源 氮源谱 有机氮 无机氮 NH3 铵盐 硝酸盐 N2 蛋白质 核酸 氨基酸 尿素 氮源 (1)微生物的氮源谱也很广,大大广于动物或植物的 (2) 氨基酸自养型生物-绿色植物、很多微生物 (尿素、铵盐、硝酸盐和氮气 ) 氨基酸异养型生物-动物、大量异养微生物 (3) “NCHO”类营养物常是异养微生物的能源、碳源 兼氮源 3 生长因子 事实： 问题：如何证明某种物质是某种微生 物的生长因子? 微生物种类生长因子需要量 肠膜乳状杆菌胱氨酸5 g 白喉棒杆菌-丙氨酸1.5g 破伤风梭状芽孢杆菌 尿嘧啶0-4g 阿拉伯聚糖乳杆菌泛酸0.02g 粪链球菌叶酸200g 干酪乳杆菌生物素1g 几种微生物所需的生长因子 生长因子小结 对微生物正常代谢必不可少 有机物 需要量一般很少 生长因子种类：维生素、碱基、卟啉及其衍生物、 甾醇、胺类、C4C6的分枝或直链脂肪酸，氨基酸 总结：微生物的营养类型 分类标准营养类型 以能源分 光能营养型 化能营养型 以碳源分 自养型 异养型 以合成氨基酸能力分 氨基酸自养型 氨基酸异养型 营养类型能源氢的供体基本碳源微生物举例 光能自养型光无机物二氧化碳 蓝细菌，绿硫 细菌，藻类 光能异养型光有机物 二氧化碳及简 单有机物 紫色无硫细菌 化能自养型无机物*无机物二氧化碳 硝化细菌，氢 细菌、铁细菌 化能异养型有机物有机物有机物 绝大多数细菌 和全部真核微 生物 光能自养型 以无机物如H2、H2S、S等作为供氢体或电子 供体，使CO2还原为细胞物质； 例如，藻类及蓝细菌等和植物一样，以水为电子供体 （供氢体），进行产氧型的光合作用，合成细胞物质 。而红硫细菌，以H2S为电子供体，产生细胞物质， 并伴随硫元素的产生。 CO2+ 2H2S 光能 光合色素 CH2O + 2S+ H2O 光能异养型 以有机物作为供氢体，利用光能将CO2还原为细 胞物质； 例如，红螺菌属中的一些细菌能利用异丙醇作为供氢体 ，将CO2还原成细胞物质，同时积累丙酮。 CHOH + CO2 H3C H3C 2 光能 光合色素 2 CH3C0CH3 + CH2O + H2O 培养基的配制原则 一、目的明确 二、营养协调 三、物理化学条件适宜 目的明确 何菌？ 何目的？ 例如：发酵产物 生产次级代谢产物B12加Co 1 营养物质浓度合适： 过低，不能满足正常生长； 过高，可能对微生物生长起抑制作用。 2 营养物质间比例。C/N 营养协调 C/N 培养基中所含的C源中C原子的摩尔数 / N源中N原子的摩尔数 例如：谷氨酸发酵 C/N=4：1 菌体大量繁殖，产生的谷氨酸少 C/N=3：1 菌体繁殖抑制，产生的谷氨酸多 三、物理化学条件适宜 PH 微生物种类 最适PH(一般 ) 放线菌 7.58.5 细菌 6.57.5 霉菌 4.05.8 酵母菌 3.86.0 为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中 加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱 。 培养基的种类 据物理性质分：液体培养基 半固体培养基（+凝固剂琼脂） 固体培养基（+凝固剂琼脂） 据用途的不同：选择培养基 鉴别培养基 教法：自学表格归纳 琼脂 主要成分：多聚半乳糖的硫酸酯 特性：极难分解，无营养价值（起支撑作用 ） 透明度好；粘着力强，耐加压 三种培养基的比较 种 类是否含凝固剂用途 固体培养基 半固体培养 基 液体培养基 用途分 种 类 原理用途实例 选择培 养基 鉴定培 养基 分离 微生物的特殊营养 要求或对其某化学 、物理因素抗性 某种指示剂与某一 菌的无色代谢产物 发生显色反应 鉴别 选择培养基参考资料 加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌（抑制细菌、放线菌 ） 加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌（抑制多种细菌） 不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物 加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基 分离杂交瘤细胞 鉴别培养基 伊红美蓝乳糖培养基（EMB）机理 染料抑制G+。在低酸度时，结合形成沉淀，起 着产酸指示剂的作用。 用途：多种肠道菌鉴别 微生物的代谢 资料1.若干微生物和动物、植物组织的呼吸速率 生物材料消耗O2ul/mg生物干重/h azotobacter固氮菌2000 Acetobacter醋杆菌1800 面包酵母110 肾和肝组织10-20 根和叶组织0.5-4 代谢特点 资料2 发酵乳糖的细菌在1小时内可分解其自重 100010000倍的乳糖。 产朊假丝酵母合成蛋白质的能力比大豆强 100倍，比食用牛强10万倍 结论：代谢旺盛 探究其原因? 体积小，面积大。 （有利于吸收、排泄和信息的交换） 初级代谢产物和次级代谢产物的不同 教法：自学 表格 交流 微生物代谢的调节（重点） 微生物细胞代谢的调节主要是通过控制 酶的作用来实现的 调 节 类 型 酶合成调节 酶活性调节 通过酶分子结构的改变来调节 变构调节，可逆性 。 通过调节酶的合成进而调节代 谢速率的调节机制 ，是在遗 传学水平上发生的 酶合成的调节和酶活性的调节的比较 酶合成的调节酶活性的调节 调节对 象诱导酶的合成酶的活性 调节机制对基因表达的调控 反馈性调节(代谢 调节) 特点间接、缓慢快速、精细 意义避免物质和能量的 浪费，增强适应 避免代谢产物的 积累 合成条件 基因和诱导物 只基因控制 调节教法建议 实例1谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的调节 实例2大肠杆菌合成半乳糖苷酶的调节 微生物代谢调节的两种主要方式 总结比较表 问题：半糖苷酶为什么在葡萄糖和乳糖 同时存在时不能合成？ 酶合成调节有两种形式： 诱导和阻遏。 葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合 成，称为葡萄糖效应-阻遏。 微生物代谢的人工控制（重难点） 措 施：改变微生物的遗传特性：例如诱变处理 控制发酵条件：例如改变细胞膜的透性 控制细胞膜的渗透性- 加入亚适量生物素（培养条件控制） 在谷氨酸发酵生产中，生物素的浓度对谷氨酸的累 积量有明显的影响，只有把生物素的浓度控制在亚适量 的情况下，才能分泌大量的谷氨酸。 因此控制生物素的含量可以改变细胞膜的成分 ，进而改变膜的透性、谷氨酸的分泌和反馈调节。 高丝氨酸缺陷型菌株不能合成高丝氨酸酶， 故不能合成高丝氨酸，也不能合成苏氨酸和甲硫 氨酸，在补给适量的高丝氨酸就可产生大量的赖 氨酸。 示图：协同抑制 现象 及结果 控制目的？ 原理？ 方法？ 微生物的生长 细菌数目的对数 时间 1 2 3 4 群体生长的实质是包含着个体细胞生长 与繁殖交替进行的过程 在保持整个培养液体积不变条件 下，以时间为横坐标，以菌数为 纵坐标，根据不同培养时间时细 菌数量的变化，可以作出一条反 映细菌在整个培养期间菌数变化 规律的曲线。 生长曲线 调整期（延迟期、适应期 ）特点：菌数不立即增加，或增加很少，生长速度 接近于零。代谢活跃 通过遗传学方法改变种的遗传特性使之缩短； 利用对数生长期的细胞作为“种子”； 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大 ； 适当扩大接种量等方式缩短，克服不良的影响。 在工业发酵和科研中通常采取一定的措施缩短延滞期： 对数期 细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致， 代谢旺盛、生长迅速、代时稳定， 是研究微生物基本代谢的良好材料。 在生产上用作种子 以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加， 稳定期 营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化 ，逐步不适宜于细菌生长， 原因 ： 采取措施 ： 补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条 件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等 生长速率降零 代谢产物大量积累的产物如外毒素、内毒素、抗生素 、以及芽胞等 衰亡期 细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放 出一些产物。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞 大小悬殊。 该时期死亡的细菌以对数方式增加 现象： 【教法建议】 给出某种细菌的生长曲线 得到此曲线需要的条件？ 如何测定？（请参考教师教学用书） 分析各期的特点和成因，分析其的实践意义。 参考问题如下： （1）调整期的特点是什么？如何缩短？ （2）对数期有何特点？处于此期的微生物有何 实际应用？ （3）稳定期有何特点？为什么在对数期后，如 果不创造特殊条件，就必然进入稳定期？ 在工业发酵过程，需要延长稳定期，以提高代 谢产物的产量。如何解决？ 连续培养 连续培养的基本原则：微生物培养 过程中不断的补充营养物质和以同 样的速率移出培养物 优点：缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定； 缺点：杂菌污染和菌种退化 环境因素对微生物的影响 影响因素： 氧 温 度 PH 值 (一) 温 度 微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为嗜 冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热和超嗜热等五种不同的 类型。 最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速 率最高时的培养温度 (二)