生物化学实验理论教学课件-分光光度计的结构与使用方法.ppt

生物化学实验理论教学课件 第一讲 分光光度计的结构与使用方法 主讲教师：徐文俊 成都大学生物产业学院 2008年6月 教学目的： 1. 掌握分光光度法的定义和在实践中的应用； 2. 掌握分光光度计的基本结构和工作原理； 3. 掌握可见光分光光度计的正确使用方法； 4. 掌握紫外分光光度计正确使用方法； 几个基本概念： 1. 什么叫可见光？白光（复合光）？单色光？ 2. 可见光由哪几种单色光组成？什么叫互补色？ 3. 物质的颜色与可见光选择性吸收有什么内在联系？ （1） 对于固体物质：黑色；白色与彩色 （2） 对于溶液：矿泉水; CuSO4 ; KMnO4溶液等 例如：黄光与 光互补； 绿光与 光互补 ； 红光与 光互补等。 蓝紫 青 教学内容： 1. 分光光度法定义与应用 2. 分光光度计的基本结构和工作原理 3. 以7200可见光分光度计为例，掌握可见 4. 以UV-754型紫外-可见分光光度计为例， 掌握紫外光光度计的正确使用方法 。 光分光度计的正确使用方法 。 1. 分光光度法定义与应用 1.1 定义: 无论物质有无颜色，当一定波长的光 通过该物质的溶液时，根据物质对光的吸收程度， 准确测定物质含量的方法。（什么叫比色法？） 1.2 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组 分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极 少量物质。（10-5 10-6 M) 1.3 应用: 生物化学微量物质定量分析测定研究 中广泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白质，核酸 ，酶等的快速定量检测。 2. 分光光度计的基本结构和工作原理 2.1 分光光度计的分类 2.2 分光光度计工作原理 2.3 分光光度计的基本结构 2.4 分光光度法的测量误差 2.5 显色反应及其影响因素 2.1 分光光度计的分类 分光光度计的分类 红外分光光度计: 可见光分光光度计: 紫外分光光度计: 测定波长范围为大于760 nm的红外光区 测定波长范围为400760 nm的可见光区 测定波长范围为200400 nm的紫外光区 2.2 分光光度计工作原理 人眼可见的光(一种频率较大的电磁波)只占电磁 波谱的很小一部分（400760nm）。电磁波按频率大 小，从频率最小的无线电波到频率最大的-射线排 成一列，即组成电磁波的波谱，如下图所示。 2.2.1 分光光度计的光谱范围 包括波长范围为400760 nm的可见光区和波长 范围为200400 nm的紫外光区。不同的光源都有 其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为 仪器的光源。 钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的400 760nm波长的光谱，光通过三棱镜折射后，可得到 由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱； 该色谱可作为可见光分光光度计的光源。 氢灯的发射光谱：氢灯能发出185400 nm波 长的光谱，可作为紫外光光度计的光源。 2.2.2 物质的吸收光谱（1） 如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此 时在屏上所显示的光谱已不再是原光源的光谱，它 出现了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光 因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为 该溶液的吸收光谱。 不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据物质 最大吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质。 2.2.2 物质的吸收光谱（2） 当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的 强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射或 分散，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只 有一部分光可透过溶液。 入射光 = 反射光 分散光 吸收光 透过光 如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为 “空白”去校正反射、分散等因素造成的入射光的 损失，则： 入射光 = 吸收光 十 透过光 2.2.3 物质吸光度（A）与透射比（T）的关系 设 I0 为经过空白校正后入射光的强度；I 为透过光的强度 。 根据实验得知 I = I0 10c l 式中，c 表示吸收物质的摩尔浓度；l 表示吸收物质的光径 ，用cm表示；表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对 光的吸收特性，不同物质的数值不同。 所以 I / I0 = 10c l 令 T（透射比） = I / I 0 T = 10cl 若以T对吸收物质的浓度作图，则得下图中的曲线。 由上式可得 1g（1 / T） = c l log（l / T）即为物质的吸光度（A） A = c l 2.2.4 Lambert -Beer定律（ A = cl） 上式说明：物质的吸光度与吸收物质的浓度和液 层的厚度成正比。这就是光吸收的基本定律- Lambert-Beer（朗伯-比耳）定律。 物质的浓度与透射比及吸光度的关系 2.3 分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括 ： 光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光 度计各部件的次序如图所示: 5个基本部件 分光光度计的基本部件（1）: 光 源: 分光光度计上常用的光源有两种：钨丝 灯或氢灯，在可见光区、近紫外光区和近红外光区常 用钨丝灯作为光源；在紫外光区多使用氢弧灯。 单色器：把混合光波分解为单波长光的装置。 在分光光度计中多用 作为色散元件。 吸收池：（比色杯、比色皿、比色池）一般由玻 璃、石英或熔凝石英制成，用来盛被测的溶液。在低 于350 nm的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝 石英池。 棱镜或光栅 分光光度计的基本部件（2）: 吸收池（比色皿）必须与光束方向垂直。此外 ，每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误 差。比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著 地影响其透光性，因此在使用前务必彻底清洗。 检测器 测量装置 一般常用的紫外光和可见光分光光度 计有3种测量装置，即电流表、记录器和数字示值 读数单元。现代的仪器常附有自动记录器，可自动 描出吸收曲线。 有光电池、光电管和光电倍增管三种 。 棱镜与光栅 棱 镜： 光波通过棱镜时，不同波长的光折射率 不同；因而能将不同波长的光分开。玻璃对紫外线的 吸收力强，故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计。石 英棱镜可在整个紫外光区传播光，故在紫外光分光光 度计中广为应用。 衍射光栅： 在石英或玻璃表面上刻划许多平行线 (每英寸约刻15 00030 000条)。由于刻线处不透光 ，通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大，较 短的光波偏折角度小，因而形成光谱。 棱镜单色器装置示意图 光源照到棱镜（或光栅）以前，先要经过一个入射狭缝， 再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上。透过棱镜的光再 经另一聚光镜，在此聚光镜的焦面内可得一清楚的光谱图。如 在焦线处放一出射狭缝，转动棱镜使光谱移动，就可以从出射 狭缝射出所需要的单色光。整个装置称为“单色器” 检测器-光电池 光电池 装在一个特制的匣 子里面由3层物质组成的圆形或 长方形薄片。第一层是一种导电 性良好的金属，这是光电池的负 极。中间极薄的一层是半导体硒 ，第3层是铁，这是光电池的正 极。当光电池受光照射以后，半 导体硒的表面逸出电子，这些电 子只向负极方向移动，而不向正 极移动，因此在上下两金属片间 产生一个电位差，线路连通时即 产生电流 检测器-光电管 光电管 光电管是由封装在真 空透明封套里的一个半圆柱型 阴极和一个丝阳极组成。阴极 的凹画上有一层光电发射材料 ，此种物质经光照射可发射电 子。当在两极间加有电位时， 发射出来的电子就流向丝阳极 而产生光电流。对于相同的辐 射强度，它所产生的电流约为 光电池所产生电流的1/4。由于 光电管具有很高的电阻，所以 产生的电流容易放大 。 检测器-光电倍增管 光电倍增管 它比普通的 光电管优越，它可将第一次发 射出的电子数目放大到数百万 倍 。当电子打在兼性阳极上 时，能引起更多的电子自表面 射出。这些射出的电子又被第 二个兼性阳极所吸引，同样再 产生更多的电子。 此过程重复9次后，每个光子可形成106107个电子。这些 电子最后被收集在阳极上。所得到的倍增电流可进一步加以 放大和测量。 2.4 分光光度法的测量误差 分光光度法的测量误差 选择适宜波长的入射光 控制吸光度A的遍数范围 选择适当的参比溶液 仪器测 量误差 测量条 件选择 2.4.1 仪器测量误差 由朗伯-比尔定律可知，只有在一定的浓度范围 内，即一定的吸光度范围同内，由分光光度计测量所 引起的测定结果的相对误差才是较小的；当透光率接 近0或1.0时，其相对误差趋于无限大；一般在百分透 光率在1080%的范围内（即吸光度在10.1），浓度 测量相对误差较小；对于精密度高的仪器。当吸度 A=0.7-0.2时（百分透光率约为20-60%，测量误差约 为1%。 2.4.2 测量条件选择 （1）选择适宜波长的入射光：由于有色物质对光有 选择性吸收，为了使测定结果有较高的灵敏度，必须 选择溶液最大吸收波长的入射光。 （2）控制吸光度A的准确的读数范围：由朗伯-比 耳定律可知，吸光度只有控制在0.20.7读数范围内时 ，测量的准确度较高。 （3）选择参比溶液：参比溶液是用来调节仪器工作 零点的。若样品溶液，试剂，显色剂无无色可用蒸馏 水作参比溶液；反之应采用不加显色剂的样品液作参 比溶液。 2.5 显色反应及其影响因素 显色反应及其影响因 素 显色反应 一般要求 影响显色 反应因素 选择性好 灵敏度高 生成的有色化合物性质稳定 显色剂与有色物颜色反差大 显色反应要易于控制 显色剂用量 反应液的酸碱度（pH ） 反应温度 显色反应时间 干扰离子的影响 2.5.1 显色反应一般要求 （1）选择性好：显色剂最好只与一种被测组分起显色 反应； （2）灵敏度高：灵敏度高，能进行微量组分的测定； （3）有色化合物性质稳定：确保前后测定准确。 （4）显色剂与有色物颜色反差大：两者最大吸收波长 之差应大于60nm； （5）显色反应要易于控制：结果的确保实验再现性。 2.5.2 影响显色反应的主要因素 （1）显色剂用量：通过实验来确定最适用量； （2）反应液的酸碱度（pH）溶液酸碱度直接影响金 属离子与显色剂存在形式以及有色化合物组成的稳定性。 （3）反应温度：不同的显色反应需要不同的反应温 度，一般显色反应可在室温下完成。 （4）显色反应时间：显色反应的速度有快有慢。 （5）干扰离子的影响：应采用适当方法消除其影响 。 3. 7200型分光光度计的正确使用方法 3.1 结构和工作原理 3.1.1 仪器结构 3.3 注意事项 3.2 使用方法 3.1.3 特 点 3.1.2 工作原理 3.1.1 7200型分光光度计仪器结构 7200型光栅分光光度计由光源、单色器、试样室 、光电管、线性运算放大器、对数运算放大器及数字 显示器等部件组成，基本结构如下图所示。 1光源；2单色器；3试样室；4光电管；5线性 运算放大器；6对数运算放大器；7数字显示器 3.1.2 7200型分光光度计工作原理（图） 7 2 0 0型光栅分光光度计 光学系统示意图 1.光源灯；2.滤光片；3.球面反射镜；4.入射狭缝；5.保护 玻璃；6.平面反射镜；7.准直镜；8.光栅；9.保护玻璃；10.出 射狭缝； 11.聚光镜；12.试样室； 13.光门；14.光电管； 3.1.2 7200型分光光度计工作原理（文） 由光源灯(1)发出连续辐射光线，经滤光片(2)和球面反射镜(3) 至单色器的入射狭缝(4)聚焦成像，光束通过入射狭缝(4)经平面反射 镜(6)到准直镜(7)产生平行光，射至光栅(8)上色散后又以准直镜(7) 聚焦在出射狭缝(10)上形成一连续光谱，由出射狭缝选择射出一定 波长的单色光，经聚光镜(11)聚光后，通过试样室(12)中的测试溶液 部分吸收后，光经光门(13)再照射到光电管(14)上。调整仪器，使透 光度为100，再移动试样架拉手，使同一单色光通过测试溶液后 照射到光电管上。如果被测样品有光吸收现象，光量减弱，由光电 转换元件将变化的光信号转变为电信号，经线性运算放大器和对数 运算放大器处理，将光能的变化程度通过数字显示器显示出来。可 根据需要直接在数字显示器上读取透光度(T)、吸光度(A)或浓度(C) 。 3.1.3 特点 （1） 具有低杂色光，高分辩率的单光束光路结构的单色器； （2） 具有良好的稳定性，重现性和精确的测量读数； （3） 明亮清晰的数字显示器可显示透射比，吸光度，浓度和 所设置的波长，提高了仪器的读数准确性； （4） 采用最新微机处理技术，仪器具有自动设置0%T和 100%等控制功能； （5） 仪器配有标准的RS-232双向通讯接口，不仅可向计算机 发送测试参数，还可接收计算机发出的指令。 （6） 在已知标准溶液浓度前提下，测定未知样品浓度； （7）在已知标准溶液浓度斜率前提下，测定未知样品浓度。 3.2 7200型分光光度计使用方法（基本操作 1） 3.2.1 基本操作 （1）通电-仪器自检-预热20min； （2）用键设置测试方式：透射比（T），吸光度（A ），已知标样浓度方式（C）和已知标样浓度斜率（K）方式； （3）波长选择：用波长调节旋钮设置所需的单色光波长; （4）放样顺序：打开样品室盖，在14号放置比色皿槽中，依 次放入%T校具（黑体），参比液，样品液1和样品液2。 （5）校具（黑体）校“0.000”：将%T校具（黑体）置入光路， 在T方式下按“%T”键，此时仪器自动校正后显示“0.000” 3.2 7200型分光光度计使用方法（基本操作2） （6）参比液校“100”%T或“0.000”A：将参比液拉入光路中， 按“0A/100%T”键调0A/100%T，此时仪器显示“BLA”，表示仪器正 在自动校正，校正完毕后显示“100”%T或“0.000”A后,表示校正完毕 ，可以进行样品测定。 （7）样品测定：将两样品液分别拉入光路中，此时若在“T” 方式下则可依次显示样品的透射比（透光度）；若在“A”方式下， 则显示测得的样品吸光度。 3.2 7200型分光光度计使用方法（浓度测定） 7200型分光光度仪不仅可以测定未知样品的透射比（T）和吸 光度（A）这两项基本操作，还可进行未知样品浓度测定。 （1）在已知标准溶液浓度前提下，测定未知样品浓度。 （2）在已知标准溶液浓度斜率前提下，测定未知样品浓度。 备注：以上两种浓度测定的方法请大家参照实验教学 教材课后自学。 3.3 7200型光栅分光光度计的使用注意事项（1） (1) 预热是保证仪器准确稳定的重要步骤。 (2) 比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此， 特别要将比色皿清洗干净。先用自来水将用过的比色皿 反复冲洗，然后用蒸馏水淋洗，倒立于滤纸片上，待干 后再收回比色皿盒中。必要时，还要对比色皿进行更精 细的处理，如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡、冲洗。 (3) 比色皿与分光光度计应配套使用，否则会引起较 大的实验误差。 3.3 7200型光栅分光光度计的使用注意事项（2） (4) 比色皿内盛液应为其容量的2/3，过少会影响实 验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。 (5) 拿放比色皿时，应持其“毛面”，杜绝接触光路 通过的“光面”。如比色皿外表面有液体，应用绸布拭干 ，以保证光路通过时不受影响。 (6) 若待测液浓度过大，应选用短光径的比色皿， 一般应使吸光度读数处于0.10.8范围内为宜。由于测定 空白、标准和待测溶液时使用同样光径的比色皿，故不 必考虑因光径变化而引起的影响。 4. UV-754型紫外-可见分光光度计正确使用方法 4.1 紫外分光光度法概述 4.2 UV-754型紫外-可见分光光度计结构和工作原理 4.1.1 仪器结构 4.1.2 工作原理 4.3 UV-754型紫外-可见分光光度计使用方法 4.4 UV-754型紫外-可见分光光度计使用注意事项 4.1 紫外分光光度计法概述（1） 4.1.1 定义 用紫外光源通过分光光度技术对物质进 行测定的方法叫作紫外分光光度法。所使用的仪器叫作紫 外分光光度计。 4.1.2 原理 因为许多化合物的分子结构中存在共轭 双键，在200400nm的紫外光区具有吸收光的特性，所 以无需进行显色反应便能直接测定。 4.1.3 应用 常用于对蛋白质和核酸进行定性、定量 测定。蛋白质分子中所含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等芳 香族氨基酸残基在波长280nm处具有最大吸收峰。故常用 波长280nm处的吸光度测定蛋白质的浓度。 4.1 紫外分光光度计法概述（2） 4.1.4 特点 （1） 组成核酸的碱基也含有共轭双键，其最大吸收峰的波长 在260nm处。但在280nm处也有一定的光吸收，对蛋白质的测定有 一定的干扰作用。若分别测定280nm和260nm处的吸光度，可通过 经验公式消除核酸对蛋白质测定的影响。 （2）可对微量蛋白质（110g/L）不需显色，进行直接定量 测定。因此操作简便，而且可回收样品。此外，盐类在280nm处无 光吸收，少量盐类也不会影响测定结果。 （3）紫外分光光度法完全符合Lambert-Beer定律的基本原理。 在其它条件保持一致的情况下，被测溶液的吸光度与被测溶液的浓 度成正比。 4.2 UV-754型分光光度计的结构和工作原理 4.2.1 仪器结构 由光源(钨灯或氚灯)、单色器、试样室、接受 器(光电管)、微电流放大器、A/C 转换器、打印机、键盘和显示器 等部件组成。微处理机(CPU)通过输入、输出口(I/O)对微电流放大 器、显示器和打印机等部件进行 控制，实现仪器的整体功能。 4.2.2 工作原理（图） UV-7 5 4型紫外-可见分光 光度计光学系统示意图 1.氚灯；2.钨灯；3.滤光镜；4.聚光镜；5.入射狭缝；6.平面； 7.准直镜； 8.光栅； 9.出射狭缝； 10聚光镜； 11试样室； 12.光门； 13.光电管 4.2.2 工作原理（文） 由光源氚灯或钨灯（1或2）发出连续辐射光线经滤光镜（3） 和聚光镜（4）至单色器入射狭缝（5）处聚焦成像，再经平面反射 镜（6）反射至准直镜（7）产生平行光射至光栅（8）在光栅上色 散后又经准直镜（7）聚焦在出射狭缝（9）上成一连续光谱，经出 射狭缝射出的光在聚光镜（10）聚光后分别通过试样室（11）中的 空白溶液（或对照溶液）、标准溶液或样品溶液，被部分吸收后光 经光门（12）再照射到光电管（13）上。被光电管接收的光信号再 被转换成电信号，后者通过输入、输出口（/O），见上图。进入 微处理机进行调零、变换对数、浓度计算以及打印数据等处理，将 检测结果通过显示器和打印系统显示出来。 4.3 UV-754型分光光度计使用方法（外型） 4.3.1 UV-754型紫外可见分光光度计的外观图 1.试样架拉手；2.键盘部分；3.数据打印；4.波长刻度盘； 5 波长手轮；6电源汗关；7氚灯触发按钮；8光源室。 4.3 UV-754型分光光度计使用方法（键盘） UV-754型紫外-可见分光光度计的键盘示意图 键盘详细内容说明如下： 4.3 UV-754型分光光度计使用方法（键盘内容1） 功能键： F1F8，暂无功能，备扩展使用。 T键： 具有三种透光度状态调节功能。 A/C键：吸光度浓度转换键，按此键可分别表示“吸光度0 3A”、“吸光度00.lA”、“吸光度00.1A”和“浓度”四种状态。 送入键：只在“A/C键”处于“浓度”状态时才起作用。 打印键：手动方式时有效，每按一次，便打印一次数据。 控制键：在分别使用“设定+”、“设定一”、“倍率”、“显示方 式”和“打印方式”各键时，需与控制键分别联合使用才起作用。 设定+键：在“A/C键”处于“浓度”状态时才能设定“标准浓度 值”、“斜率K值”或“斜率B值”等数据。其功能是将设定数值增加。 4.3 UV-754型分光光度计使用方法（键盘内容2） 设定- 键：是使设定数值减小，操作与“设定+键”类同。 倍率键：用来设定标准溶液浓度的放大倍数。有“1”、“0.1” 和“0.01”三档，与“控制键”同时按下，倍率便发生相应的变化。 显示方式键：可表示“积分”、“浓度”和“样品号”三种状态。 (11) 打印方式键：存在“自动”（每移动一次试样架，仪器自动 打印一次数据）、“方式1”（手动方式，每按一次此键，仪器打印 一次数据）和“方式2”（每分钟定时打印一次数据）三种状态。每 与“控制键”同时按一次此键便改变一个状态。 (12) 送纸键：每按一次此键，仪器移动一次打印纸。 (13) TAC：数字显示器显示测定结果或输入的数据。 4.3.2 UV-754型紫外可见分光光度计使用方法（1） （1） 测试准备 将盛有“空白”或“对照”溶液的