crispr原理解析.pptx

CRISPR CRISPR：是细菌和古细菌在长期演化过程中 形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗 入侵的病毒及外源DNA，实际上就是一种基 因编辑器，可以用来删除、添加、激活或 抑制其他生物体的目标基因。 系统分类： 类需要多种CRISPR相关蛋 白（Cas蛋白）共同发挥作用，类只需要 一种Cas蛋白，（CRISPR/Cas9系统最为广泛 ） CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因 组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个 前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序 列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。 Leader一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度 为300500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇 的启动子序列。 Repeat长度为2148bp，含有回文序列，可形 成发卡结构。重复序列之间被长度为2672bp 的间隔区隔开。 Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫 记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可 被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默， 达到保护自身安全的目的。 crRNA：当细菌抵御噬菌体等外源DNA（ protospacers ）入侵时，在前导区的调控下， CRISPR被转录为长的RNA前体(pre-crRNA)，然后加 工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成 熟crRNA，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列 互补的反式激活crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA)也转录出来。 sgRNA：CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部 分，早先发现的guide RNA，由tracrRNA和crRNA两 部分组成, 两部分融合表达后，即sgRNA也能很好 的行使guide的功能，与cas9蛋白结合，引导cas9 酶靶向基因组DNA进行剪切。 Cas： CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存 在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均 含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解 旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区 域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因 (CRISPR associated)，缩写为Cas。 PAM： （protospacer adjacent motif ） protospacers选择自入侵DNA旁出现PAM的区域， 剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区。 工作原理： crRNA( CRISPR-derived RNA )通 过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此 复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配 对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人 工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引 导作用的sgRNA (short guide RNA )，引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。 第一阶段：外来DNA采集 宿主通过Cas蛋白来识别外源 核苷酸，使入侵细菌的短片段DNA作为间隔 区序列插入到宿主的CRISPR位点。 第二阶段：CRISPR RNA的生物合成 CRISPR RNA的生物合成从转录开始，接 下来是初级转录产物pre-crRNA加工生成一 类短的CRISPR衍生RNAs（crRNAs），每一个 都包含与之前遇到的外源DNA（Spacer序列 ）对应的互补序列。 pre-crRNA转录的同时 ，与其重复序列互补的反式激活crRNA (Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出 来，这两个RNAs可以融合成一个sgRNA。 第三阶段：靶向干扰 crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体， 识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开 DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链 杂交，另一条链保持游离的单链状态，然 后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互 补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最 终引入DNA双链断裂(DSB)。 数据： genome-scale CRISPR-Cas9 knockout (GeCKO) library targeting 18,080 genes with 64,751 unique guide sequences. The GeCKO v2 libraries consist of over 100,000 unique gRNAs for gene knock-out in either the human or mouse genome. /gecko/?page_id=114 敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成 功获得AIP1敲除的人(胚肾细胞株)293T稳定 细胞株（广州医科大学） 在一个黑素瘤模型中，筛选出了涉及药物 维罗非尼（Vemurafenib）耐药性的基因（ 麻省理工学院 张峰） CRISPR/Cas9的靶向特异性是由两部分决定的， 一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一 部分是Cas9蛋白和一个短DNA基序（DNA motif）的结 合，这个短DNA基序通常在靶DNA的3末端发现，被 称为前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif ，PAM） Natronobacterium gregoryi Argonaute（NgAgo） 是一种DNA导向的可用于人类细胞基因编辑的核酸内 切酶，与Cas9不同，NgAgogDNA系统不需要PAM ，初步鉴定表明，该系统对导向-靶向（guidetarget ）错配耐受低，且对编辑富含G+C的基因组更加有 效。据介绍，Cas9只存在于原核生物中，而 Argonautes几乎存在于所有的有机体中。要想与 Cas9正确绑