基因表达及功能分析基本策略.ppt

目 录 第二十六章 基因表达及功能分析的 基本策略 STRATEGIES FOR ANALYZING GENE EXPRESSION AND FUNCTION 目 录 第一节 基因表达的分析策略 Strategies for Analyzing Gene Expression 目 录 一、通过检测mRNA 揭示基因转录水平的表达特征 根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为: 封闭性系统研究方法:例如DNA微阵列、Northern印迹、实 时RT-PCR等方法，其应用范围仅限于已测序的物种，只能 研究已知的基因。 开放性系统研究方法: 如差异显示PCR、双向基因表达指纹 图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现 和分析未知的基因。 这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。 目 录 （一）基于杂交原理的方法可检测mRNA表达水平 1Northern印迹（Northern blot） 既可分析mRNA表达又可验证cDNA新序列 是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种RNA分析 技术 目 录 Northern印迹分析原理示意图 目 录 2核糖核酸酶保护实验 （ribonuclease protection assay，RPA） 可用于mRNA定量和RNA剪接分析 是一种基于杂交原理分析mRNA的方法，既可对 mRNA进行定量分析又可研究其结构特征，灵敏 度和特异性都很高。 目 录 核糖核酸酶保护实验原理示意图 目 录 可对mRNA进行区域定位 是利用杂交原理建立的组织原位mRNA检测技术，可 对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位。同 时也可作为定量分析的补充。 通过设计与目标mRNA碱基序列互补的寡核苷酸序列 ，标记后作为探针；该探针能够特异性地与目标靶序 列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表 达的区位信息。 虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该 技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因 为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。 3原位杂交（in situ hybridization，ISH） 目 录 （二）两种变换的聚合酶链式反应是常用的 mRNA检测方法 1反转录PCR 可用于mRNA的半定量分析 反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方 法。它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以 cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT- PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参 照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。 该方法适合对待测样品进行初步筛选，目前已广泛被 实时定量PCR替代。 目 录 常用于mRNA的定量分析 实时定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)是定量分析mRNA的最通用、最快速 、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测， 具有很高的灵敏度和特异性。 2实时定量PCR 目 录 目前有5种技术用于实时定量PCR： 其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBR Green ）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产 物的增加； 其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针 与正确的扩增子杂交，包括5核酸酶法（即人们熟知的 TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法 ，它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线 的需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴 定，但是成本较高。 目 录 SYBR Green实时定量PCR分析原理示意图 目 录 二、通过蛋白质检测揭示基因 翻译水平的表达特征 Western印迹（Western blot）是一种免疫印迹技术， 其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗 体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽 分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最 常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质 中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。 （一）采用特异抗体经Western印迹可直接 测定基因编码多肽 目 录 1. 蛋白质样品的制备 2. SDS-PAGE分离 3. 蛋白质转膜 4. 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印 迹杂交 5. 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体， 商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig） 6. 最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取 免疫印迹信息 Western blot基本程序 目 录 酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白 质分析基本方法。 该方法不需经电泳分离待检样品蛋白质，而是预先将样品 包被在支持体上，以后反应过程与Western印迹大致相同 顺序结合（即“吸附”）特异抗体（一抗）及与酶连接的第二抗 体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底物反应 。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。 （二）酶联免疫吸附分析与Western印迹原理 相似但形式不同 目 录 特点： 具有特异性； 灵敏度很高； 稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查， 尤其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原； 既可以做定性试验也可以做定量分析。 被广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和 免疫学等领域。 酶联免疫吸附分析 目 录 免疫组织化学（immunohistochemistry）与免疫 细胞化学（immunocytochemistry）原理相同，都是利 用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应， 在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的 方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗 体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。 （三）免疫组化实验可对组织/细胞 表达的蛋白质进行原位检测 目 录 （immunofluorescence），可应用荧光（倒置）显微镜或 激光共聚焦显微镜（confocal microscopy）对靶分子进行 定性、定量和定位分析，激光共聚焦显微镜还可进行断层 成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。 其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测 系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键 因素。 运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子 进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间 相互作用信息的有效方法。 免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量 系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。 目 录 流式细胞术（flow cytometry）在细胞水平分析特定 蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记 抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号 ，从而根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性 细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。 （四）流式细胞术用于分析 表达特异蛋白质的阳性细胞 目 录 流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的 细胞。 广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析 ，并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。 此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同时对 多个基因产物进行标记和监测，是对细胞进行快速分析 、分选、特征鉴定的一种有效方法。 目 录 三、高通量检测技术成为基因表达 研究的有力工具 高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术 是在大量核酸、多肽信息累计（即资料库）基础上，采 用微板作为分子载体，制作集成“芯片”，以自动化操作 系统进行分子杂交的试验过程。 因为快捷、灵敏、信息量大，适合大规模操作，故 称“高通量”。 高通量检测技术适合“组学”（omics）研究，更适 合生命活动过程相关的基因表达谱分析。 目 录 1. 基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法 基因芯片（gene chip）又称DNA微阵列(DNA microarray) 、DNA芯片（DNA chip）, 是将大量已知序列的核酸片段（ 包括寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、microRNA等) 集成 在同一基片上，组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂 交，检测、获取细胞或组织的基因信息。 其中基因表达谱（expression prifile）分析是目前基因芯片 应用最多的一个方面，主要采用cDNA芯片，基因表达谱芯 片便于对不同状态（如生理和病理条件）下的基因表达谱进 行比较，揭示转录组（transcriptome）差异表达的规律， 对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意 义。 （一）基因芯片和高通量测序技术可在基因 水平高通量地分析基因表达 目 录 2. 高通量测序技术是新一代基因表达谱 分析方法 高通量测序技术可以一次对几十万到几百万个 DNA分子片段进行序列测定，从而快速获得转录组或 基因组的全貌, 又被称为深度测序(deep sequencing)。 目 录 在DNA水平上，可以大规模地分析基因组甲基化、筛选突变基 因、检测基因多态性； 在RNA水平上，可以对RNA片段进行扫描、定量与鉴定，对全 基因组进行广谱表达研究。 1）目前，高通量测序技术不仅仅在DNA测序中起到重 要的作用，并且已经应用于基因组分析的各个方面： 2）高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或 非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易地解决芯片 技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列, 高度同源), 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度, 同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。 目 录 基因芯片的缺点: 在于它是一个“封闭系统”, 它只能检测人们已知序 列的特征(或有限的变异)。 高通量测序的优势: 在于它是一个“开放系统”, 它的发现能力和寻找新 信息的能力从本质上高于芯片技术。 目 录 （二）蛋白质芯片和双向电泳可在蛋白质水平 高通量地分析基因表达 蛋白质芯片（protein chip）是一种对蛋白质的表达和 功能进行高通量分析的技术。 是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体 ）固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中的目标多 肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白 质/DNA-蛋白质/RNA-蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白 质与药物、酶与底物、小分子-蛋白质等的相互作用。 1蛋白质芯片有多种形式和用途 目 录 蛋白质检测芯片包括: 1. 抗体芯片 2. 抗原芯片 3. 配体芯片 4. 碳水化合物芯片等 根据蛋白质芯片制作方法和用途不同，可将其分为 1. 蛋白质检测芯片 2. 蛋白质功能芯片两大类 目 录 目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向聚丙烯酰 胺凝胶电泳结合质谱技术。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 又称二维电泳（two-dimensional electrophoresis, 简称2-D 电泳）。 原理: 根据蛋白质分子的两个属性等电点和分子质 量将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，即 可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中 将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段 ，利用质谱（mass spectrum）技术进行定性分析，对差异 表达的蛋白质进行鉴定。 可同时分离数成百上千的蛋白质。 2双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达 谱的分析和鉴定 目 录 第二节 生物信息学在预测基因 功能中的应用 Bioinformatics Application in Predicting Gene Function 目 录 一、利用生物信息学方法进行基因功能 注释 (一）通过序列比对预测基因功能 序列比对是生物信息学最基本的分析技术之一，最常 用的方法是将目的DNA或蛋白质序列与已知的DNA和蛋白 质序列数据库进行比对，搜索到与目的序列高度同源的功 能已知的基因或蛋白质，用这些基因和蛋白质预测目的基 因和蛋白质的功能。局部比对搜索工具BLAST是进行序列 比对的基本工具，它允许用户选择一条查询序列与一个数 据库进行比对，找到数据库中与输入的查询序列相匹配的 项。BLAST是一个序列数据库搜索程序家族，其中包括许 多有特定用途的程序。 目 录 程序 查询查询 序列 类类型 数据库类库类 型注 BLASTNDNADNA BLASTP蛋白质质蛋白质质 BLASTXDNA蛋白质质 将待搜索的核酸序列按6个阅读阅读 框翻译译成蛋白 质质序列，然后与数据库库中的蛋白质质序列比对对 TBLASTN蛋白质质DNA 将数据库库中的核酸序列按6个阅读阅读 框翻译译成 蛋白质质序列，然后与待搜索的蛋白质质序列比 对对 TBLASTXDNADNA 无论论是待搜索的核酸序列还还是数据库库中的核 酸序列都按6个阅读阅读 框翻译译成蛋白质质序列， 然后比对对 BLAST序列数据库搜索程序家族 目 录 （二）利用生物信息学方法分析基因芯片数据 最常用的方法有： 差异表达分析（又称基因表达差异分析） 聚类分析 差异表达分析的目的： 识别两个条件下表达差异显著的基因，即一个基因 在两个条件中的表达水平，在排除各种偏差后，其差异 具有统计学意义 目 录 1. 倍数分析：计算每个基因在两个条件下的表达比值； 2. 统计分析中的t检验和方差分析：通过计算表达差异的 置信度来分析差异是否具有统计学意义； 3. 建模的方法：通过确定两个条件下的模型参数是否相 同来判断表达差异的显著性。 差异表达分析常用的分析方法有3类： 目 录 聚类分析所依据的基本假设： 若组内基因具有相似的表达模式，则它们可能具有 相似的功能，例如受共同的转录因子调控的基因，或者 产物构成同一个蛋白复合体的基因，或者参与相同调控 路径的基因。 在具体应用中可按照相似的表达谱对基因进行聚类 ，从而预测组内未知基因的功能。 目前已经有很多种聚类的方法应用到基因芯片的研 究当中，如层次聚类(Hierarchical clustering)、K 均值聚 类(K-means clustering)、自组织映射(self organizing map)、PCA (principlecomponet analysis)等。 目 录 在氨基酸序列整体同源性不明显的情况下，对 蛋白质的功能域进行分析将对预测基因功能提供极 其有价值的信息。目前已通过多序列比对将蛋白质 的同源序列收集在一起，确定了大量蕴藏于蛋白质 结构中的保守区域或序列，如结构域（domain）和 模体（motif），这些共享结构域和保守模体通常与 特定的生物学活性相关，反映了蛋白质分子的一些 重要功能。 （三）通过生物信息学方法分析蛋白质 结构来预测蛋白质功能 目 录 运用蛋白质序列模体搜索工具预测蛋白质功能的方法是： 首先收集现有的蛋白质家族，构造模体数据库； 而后通过搜索该数据库确定查询序列是否具有可能的序 列模体，判断该序列是否属于一个已知的蛋白质家族； 然后根据该蛋白质家族的已知功能预测未知蛋白质的功 能。 常用的模体数据库有INTERPROSCAN、PROSITE 、 SMART等。 目 录 基因组组功能注释释常用数据库库 数据库库网址描述 AAThttp : / / genome. cs. mtu. edu / aat基因组组分析和注释释工具 COGhttp : / / www. ncbi. nlm. nih. gov / COG/直系同源体簇分析数据库库 EcoCychttp : / / ecocyc. pangeasystems. com/ ecocyc/ ecocyc. html 大肠肠杆菌的基因与代谢谢 OMIMhttp : / / www. ncbi. nlm. nih. gov / Omim/在线线人类类孟德尔遗传资遗传资 料 PEDENThttp : / / pedant . mips. biochem. mpg. de/ frishman/ pedant . html 完整基因组组的生物信息学分析 SAShttp : / / www. biochem. ucl. ac. uk/ cgi2bin/ sas/ query. cgi 结结构为为基础础的基因组组序列分析 WIThttp : / / www. cme. msu. edu/ WIT/基因组组代谢谢途径重构 目 录 现在人们已经越来越清楚地认识到，生物功能大多 不是只由一个或几个基因控制的，而是通过生物体内众 多的分子（如DNA、RNA、蛋白质和其他小分子物质） 共同构成的复杂生物网络实现的。当前生物学面临的巨 大挑战之一就是，了解生物体内复杂的相互作用网络以 及它们的动态特征。要想全面系统地解析这些复杂的生 物网络需要大量相关数据的积累，现代基因芯片、蛋白 质芯片等大规模数据采集技术大大加快了这一进程。目 前人们已经利用生物技术和信息技术建立了各种生物网 络数据库和网站，可为研究者提供基因调控、信号转导 、代谢途径、蛋白质相互作用等方面的信息。 二、利用生物网络全面系统地了解 基因的功能 目 录 生物体任何细胞的遗传信息、基因都是相同的， 但同一个基因在不同组织、不同细胞中的表达却不相 同。一个基因的表达既影响其他的基因，又受其他基 因的影响，基因之间相互促进、相互抑制，构成一个 复杂的基因调控网络。 基因调控网络研究就是：利用生物芯片等高通量 技术所产生的大量基因表达谱数据，以及蛋白质- DNA间的相互作用等信息，结合实验室研究结果，用 生物信息学方法构建基因调控模型，对某一物种或组 织的基因表达关系进行整体性研究，从而推断基因之 间的调控关系，揭示支配基因表达和功能的基本规律 。 （一）利用生物网络研究基因调控 目 录 常用基因转录调转录调 控数据库库 数据库库网址描述 EPD 真核生物启动动子数据 库库 http:/www.epd.idb-sib.ch 包含已被实验证实验证 明的转录转录 起始位点 和组织组织 特异性等启动动子的一般信息 TFD 转录转录 因子数据库库 / 是转录转录 因子及其特性的专门专门 数据库库 ，收集有关多肽肽相互作用信息 TRANSFAC数据库库 http:/www.gene-regulation. com/pub/database.html# transcompel 提供转录转录 因子结结构、功能、序列、 DNA结结合谱谱以及分类类，还还包括基因 的转录转录 因子结结合位点的信息 TRRD 转录调转录调 控区数据库库 http:/www.bionet.nsc.ru/ trrd/celcyc/ 收集了关于真核基因整个调调控区分 级结级结 构和基因表达模式的信息 目 录 信号转导是生物系统的重要生命活动过程，机体 通过信号转导通路中分子之间的相互识别、联络和相 互作用, 实现整体功能上的协调统一。由于细胞内各种 信号通路之间存在着紧密的联系和交叉调控, 形成了非 常复杂的信号转导网络。信号转导网络研究的目的是 期望通过建立细胞信号传导过程的模型，找出参与此 过程的各个蛋白质间的相互作用关系，阐明其在基因 调控、疾病发生中的作用。 生物信息学方法利用已知数据和生物学知识进行 通路推断, 可以帮助阐释信号分子作用机制, 辅助实验设 计, 节省大量的人力物力。有关信号转导通路的网上数 据库资源较多 。 （二）利用生物网络研究信号转导 目 录 常用信号通路数据库库 数据库库网址描述 Biocartahttp:/www. biocarta. com信号通路图图片及注释释数据库库 Reactomehttp:/www. reactome. org 生物核心通路及反应应的挖掘知识库识库 PIDhttp:/pid. nci. nih. gov 从其他数据库导库导 入及文献挖掘的人 信号通路数据库库 STKEhttp:/stke. sciencemag. org 参与信号转导转导 的分子及其相互作用 关系的信息 AfCShttp:/www. signaling- gateway. org 参与信号通路的蛋白质质相互作用和 信号通路图图 DOQCShttp:/doqcs. ncbs. res. in 细细胞信号通路的量化数据库库, 提供 反应应参数及注释释信息 SigPathhttp:/sigpath. org 提供细细胞信号通路的量化信息 目 录 代谢网络处于生物体的功能执行阶段，其结构组 成方式反映了生物体的功能构成。代谢网络把细胞内 所有生化反应表示为网络形式，反映了代谢活动中所 有化合物及酶之间的相互作用。 通过基因组注释信息可以识别出编码催化生物体 内生化反应的酶的基因,结合相关的酶反应数据库就可 以预测物种特异的酶基因、酶以及酶催化反应，由此 产生了许多优秀的代谢数据库,可以方便地检索某一生 物代谢网络中的代谢反应。 （三）利用生物网络研究代谢途径 目 录 常用代谢谢网络络数据库库 数据库库网址描述 KEGGhttp:/www.genome.ad.jp/ke gg/ 包括了700个以上物种的代谢谢、信号 转导转导 、基因调调控、细细胞过过程的通路 BioCyc/包括了260个物种的代谢谢通路及基因 组组数据 PUMA2/p uma2/ 存放了预预先计计算的超过过200个物种的 代谢谢通路信息 BioSilicohttp:/biosilico.kaist.ac.kr:80 17/biochemdb/index.jsp 整合信息的数据库库，提供对对多个代 谢谢数据库库的访问访问 目 录 （四）利用生物网络研究蛋白质相互作用 从某种程度上可以说，细胞进行的生命活动，是 蛋白质在一定条件下相互作用的结果，若蛋白质相互 作用网络被破坏或稳定性丢失，会引起细胞的功能性 障碍。阐明蛋白质相互作用的完整网络结构，有助于 从系统的角度加深对细胞结构和功能的认识。 近年来各种预测蛋白质相互作用的计算方法被不 断提出，将这些方法与实验方法结合，挖掘出了蛋白 质相互作用网络中更多的相互作用节点，目前已有多 个蛋白质相互作用的数据库应运而生，可用来研究蛋 白质相互作用的生物学过程 。 目 录 常用蛋白质质互作网络络数据库库 数据库库网址描述 BINDhttp:/www. bind. ca 提供参与通路的分子的序列和相互作用信息 DIPhttp:/dip.doe- 专门专门 存放实验实验 确定的蛋白质质之间间相互作用的 数据,既包括经经典实验实验 手段也包括高通量实验实验 手段确定的蛋白质质相互作用数据 STRINGhttp:/string.embl.de存储实验储实验 确定的和预测预测 得到的蛋白质质相互作 用数据，并对对各种预测预测 方法得到的结结果的准 确性给给出了相应应的权权重 MIPShttp:/mips.gsf.de包括酵母和哺乳动动物的PPI,可靠性很高,被作 为为准金标标准使用 Yeast Interactome /rakesh/myindex.html 综综合多种来源的由酵母双杂杂交技术术确定的酵 母PPI数据集, 利用基因表达信息、蛋白亚细亚细 胞定位信息以及已知的各种知识对识对 其进进行验验 证证形成高可信度的相互作用数据 目 录 三、复杂疾病的生物信息学研究策略 包括信息提取、分析和建模 癌症、糖尿病、高血压等复杂疾病对人类健康影响 巨大，这类疾病的发病机制一般与多种遗传或非遗传因 素，以及它们之间的相互作用有关，不能通过单基因、 单通路、单层次的变化解释。 以系统的观点解释复杂疾病中遗传与环境的关系、 描述复杂疾病中基因的特征、分析疾病基因型与表现型 之间的关系，已成为生物信息学研究复杂疾病的基本观 点，针对复杂疾病的研究模式，也开始从传统的“序列 结构功能”向“相互作用网络功能”转变。 目 录 疾病的基因组合及相互作用信息的提取：即对复杂疾病相关 靶基因的识别，以及利用SNPs、基因、蛋白质等不同类型的 信息，构建疾病驱使相关基因网络。 生物信息分析及多层次信息的融合：即从不同层次对疾病的 遗传复杂性进行分析，对不同遗传网络间的映射算法进行研 究，进而将SNPs、基因、蛋白质等不同水平的信息进行融合 。 分子调控网络建模：即综合生理病理相关的基因、SNPs、 基因表达状况，蛋白质功能状态以及临床治疗等信息，以系 统的方法将不同的测量数据、各种因素的辨识、各个层次上 的相互作用关系进行整合，建立数学模型，深入了解疾病过 程、揭示复杂疾病的发病机制。 复杂疾病的基本研究策略 目 录 第三节 基因的生物学功能鉴定技术 Methods for Identifying Biological Functions of Genes 目 录 目前在已知的2.5万3万个人类基因中，大约70%的基因我们还 不清楚它们的功能，有90%的基因我们不知道它们在体内的确切 生理作用，因此，利用各种技术手段研究基因组中功能未知基因 的作用，将是“后基因组时代”功能基因组学研究的主要内容。 生物信息学利用已知数据和生物学知识进行合理推断, 可以节省 大量的人力物力，但基因功能的鉴定最终仍需要通过实验来验证 。 通常采用基因功能获得和/或基因功能缺失的策略，观察基因在 细胞或生物个体中的，细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变 化，来鉴定基因的功能。此外，基于正向遗传学的随机突变筛选 技术也成为揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必须在完 整的生物个体及其生命过程中才能得到完整的体现，因此从整体 水平研究基因的功能是必然的选择。 目 录 基因功能获得策略即通过将目的基因直接导入某一 细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过 细胞或个体生物性状的变化来研究基因的功能。常用的 方法有转基因和基因敲入技术等。 一、采用功能获得策略鉴定基因的功能 目 录 转基因技术（transgenic technology）是指将外源基 因导入受精卵或胚胎干细胞中，通过随机重组使外源基 因插入细胞染色体DNA，再将受精卵或胚胎干细胞植入 受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给 后代。 （一）用转基因技术获得基因功能 目 录 转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因 技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物。 其基本制作过程包括：转基因表达载体的构建，外 源基因的导入，转基因动物的获得和鉴定，转基因动物 品系的建立以及外源基因表达的鉴定。 1. 转基因动物可在整体水平研究基因的功能 目 录 转基因动物制作原理示意图 目 录 优点： 1. 利用转基因动物模型研究外源基因，能够接近真实地 再现基因表达所导致的结果，及其在整体水平的调控 规律，把复杂的系统简单化，具有系统性和独立性， 是目前层次最高的实验体系。 2. 利用转基因技术建立的疾病动物模型具有遗传背景清 楚、遗传物质改变简单、更自然更接近疾病的真实症 状等优点。 目 录 但转基因动物模型仍存在一些亟待解决的问题： 1. 外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插入突变 ，破坏宿主基因组功能； 2. 外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等； 3. 整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳 定遗传等。 虽然转基因技术本身仍存在一些问题，但其在医学研 究中的重要地位是毋庸置疑的，随着转基因技术的不断完 善，其在医学及生物学领域必将有更加广泛的应用。 目 录 目前，科学家已经采取了多种方法使转基因技术更加完善： 为了更为精确地调控转基因的表达，使其获得时空特异 性的调控，在构建转基因表达载体时，选择只在特定的细胞 类型或特定的生命时期才启动基因表达的启动子，即可使外 源基因获得时空特异性的表达。 可调控的基因表达系统也是一种常用的方法： 例如四环素调控系统，该表达系统可使转基因动物体内 外源基因的表达受诱导剂（四环素）的调控，通过加入或去 除诱导剂，就可以实现对外源基因表达时间及水平的控制。 2. 转基因技术在不断完善 目 录 当前转基因动物所涉及的转基因片段长度大多在几十个 kb以下，但是，随着科学研究需要进行大片段DNA、多 基因或基因簇的转基因。 克隆大片段DNA常应用酵母人工染色体(YAC)、细菌人 工染色体(BAC)等，可获得200kb以上的大DNA片段，能 携带包含完整的基因或多个基因，以及基因的所有外显 子，和附近的染色体调控区，为目的基因提供与其在正 常染色体上一致的环境，保证了转基因在正常细胞中的 时空表达。 目 录 （二）基因敲入可以实现基因的定向插入 基因敲入( gene knock-in)是通过同源重组的方法， 用某一基因替换另一基因, 或将一个设计好的基因片段插 入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。通过基 因敲入，可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之 前基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置 换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。 目 录 基因敲入是基因打靶技术的一种，基因打靶技术是 20世纪80年代后半期发展起来的，一种按预期方式 准确改造生物遗传信息的实验手段。 该技术的巧妙之处在于把胚胎干细胞技术和DNA同 源重组技术“结合”起来，实现对染色体上某一基因 的定向修饰和改造，从而深入地了解基因的功能。 除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变 、缺失突变、染色体组大片段删除等。 目 录 基因打靶的原理和基本步骤 1. 首先, 从小鼠囊胚分离出未分化的胚胎干细胞, 然后利用 细胞内的染色体DNA可以与导入细胞的外源DNA，在 相同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有正-负 筛选标记的打靶载体，对胚胎干细胞中的特定基因实施 “打靶”； 2. 之后将“中靶”的胚胎干细胞移植回小鼠囊胚( 受精卵分 裂至8个细胞左右即为囊胚, 此时受精卵只分裂不分化) , 移植进去的中靶胚胎干细胞钻入囊胚胚层, 与囊胚一起 分化发育成相应的组织和器官； 3. 最后诞生出具有基因功能缺陷的“嵌合鼠”。由于中靶的 胚胎干细胞保持分化的全能性, 因此它可以发育成为嵌 合鼠的生殖细胞, 使得经过定向改造的遗传信息可以代 代相传。 目 录 基因打靶的原理示意图 目 录 基因功能研究的功能失活策略是通过观察，细胞或 个体的某一基因功能被部分或全部失活后，细胞生物学 行为或个体遗传性状表型的变化，来鉴定基因的功能。 常用的方法主要有 基因敲除 基因沉默 二、采用功能失活策略鉴定基因的功能 目 录 基因敲除（gene knock-out）属于基因打靶技术的一 种，其操作步骤和原理与基因打靶技术相同。基因敲除 技术是利用细胞染色体DNA可以与导入的外源DNA在相 同序列的区域发生同源重组的现象，在ES细胞中定点破 坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有 预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基 因缺陷的纯和个体。 1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因 敲除的小鼠模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展 和完善，目前该技术已经成为研究基因功能最直接、最 有效的方法之一。 （一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失 目 录 基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使 得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些 基因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导 致突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表 型是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。 近年来，条件性基因打靶（conditional gene targeting） 系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明 确，效果更加精确可靠，已达到对任何基因在不同发育阶 段和不同器官、组织的选择性敲除。 目 录 Cre/loxP系统作用原理示意图 目 录 这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这 些基因的功能为其他基因代偿所致 条件性基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及 疾病发生、治疗过程中的作用和机制 目 录 基因沉默(gene silencing)是指由外源基因导入引起的 生物体内的特定基因不表达或表达受抑制的现象。 该现象最早发现在转基因植物中，后来这种现象在线 虫、真菌、果蝇、斑马鱼、小鼠早期胚胎中也有发现。 目前最常用的基因沉默技术包括： 1.RNA干涉（RNA interference，RNAi） 2.反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASON） （二）基因沉默可以使基因的功能部分缺失 目 录 RNAi是指双链RNA介导同源序列的mRNA特异性 降解，导致的转录后基因沉默。 RNAi是机体的一种天然防御机制，具有防御病毒 感染、入侵等功能。 目前利用RNAi能够在短时间内高效特异地抑制靶 基因表达的特点研究基因的功能已成为功能基因组学的 热点之一。 1. RNA干涉技术可用来研究基因的功能 目 录 RNAi的作用机制： 外源dsRNA可直接被导入细胞，或者通过转基因、 病毒感染等方式进入细胞，并整合到基因组中获得表达 ；各种来源的dsRNA被核酸酶RNase家族中，特异识 别dsRNA的Dicer酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割 成长约2123nt的双链小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)；siRNA识别mRNA链上的同源区域之后 ，结合一个核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合体（ RNA-induce silencing complex，RISC）；RISC定位到 靶mRNA转录本上，并在距离siRNA 3端12个碱基的位 置切割mRNA。 目 录 RNAi的作用机制示意图 目 录 目前有5种方法可用于制备siRNA： 1. 化学合成法 2. 体外转录法 3. 长链dsRNA的RNase体外消化法 4. siRNA表达载体法 5. siRNA表达框架法 前3种方法是在体外制备然后导入到细胞中；后两 种则是基于具有合适启动子的载体或转录元件，在哺乳 动物或细胞中转录生成。 目前多采用RNA聚合酶启动子构建siRNA的表达 载体或表达框架，常用的RNA聚合酶的启动子有人、 鼠U6启动子、人H1启动子。 目 录 研究者既可以将siRNA导入特定细胞，在细胞水平 上研究基因的功能； 也可以通过转基因的方法，在动物体内实现特异、 稳定、长期地抑制靶基因的表达，从而在整体水平上研 究基因的功能。 若将RNAi技术与Cre/loxP重组系统以及基因表达 调控系统相结合，建立转基因动物模型，则不仅具有稳 定、可遗传、可诱导等特点，而且无需使用胚胎干细胞 技术和基因打靶技术，与基因敲除相比具有简单、易操 作、周期短等优势。 已被作为一种简便和有效的工具广泛用于基因功能 的研究。 目 录 缺点： 1. 该技术可能对靶基因的相似序列发生作用，导致 脱靶（off-targeting）效应。 2. 还可能诱导干扰素和其他细胞因子的表达。 目 录 反义寡核苷酸引发基因沉默的机制： （1）可能是通过与靶mRNA互补结合后以位