现代分子诊断技术.ppt

第七章 现代分子诊断技术 v酶联免疫吸附测定 vDNA诊断系统 vDNA指纹 v遗传性疾病的分子诊断技术 基因诊断 基因蛋白质 性状 生化 诊断 基因 诊断 临床 诊断 v传统的诊断程序 先要对病原物质进行培养，培养后再分析它 的生理学特性 确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细 菌，还是其他物质 实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对 比较特异 诊断成本高、速度慢、效率低 如砂眼衣原体、朊病毒 方法优点缺点 显微镜镜检简单易行，可直接观察到 寄生虫的形态 速度慢，灵敏度低，对经 验水平要求高费时费工， 无法辨别形态相近的寄生 虫 体外培养、接种能检测到活的寄生虫，并 可检测感染性和感染程度 速度慢、花费高，寄生虫 可能难以进行体外培养， 且必须使用动物材料 抗体检测简单、快速、能够实现自 动化，可用于检测大量的 样品 无法区分活的寄生虫与处 在潜伏状态的寄生虫。有 时会有非特异反应发生 DNA杂交及PCR快速灵敏，能够实现自动 化，可以分辨不同种的寄 生虫，不需要以前有寄生 虫感染病史 花费高，步骤多，无法区 分活的和死的寄生虫，有 时会有假阳性或假阴性 检测寄生虫感染的诊断方法的比较 v现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分 子生物学的方法对病原物质进行诊断检测 v一种有效的诊断方法应具备： 1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌 分子产生阳性反应 2、灵敏度(sensitivity)高 3、操作简单(simplicity) 基因诊断的特点 v特异性高 检测目标是基因，为原始的致病因素 v灵敏度高 待测标本往往微量，目的基因只需pg水平 v稳定性高 基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不 需处于活性状态 v诊断范围广，适应性强 确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态 v临床应用前景好 基因诊断优点 v从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制 v显著提早产前诊断的时间 v无需对组织、器官或细胞进行选择 v快捷准确、安全 基因诊断常用的技术 核酸分子杂交 PCR（聚合酶链式反应） 限制性酶切分析 SSCP（单链构象多态性分析） DNA 测序 DNA 芯片技术 vDNA Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, micoarray, restriction analysis, RFLP，SSCP vRNA Northern blot, RT-PCR, micoarrays vProtein Western blot, Immuno-histochemistry, microarray Southern blot N N T T N T T FISH PCR 技术 DNA 测 序 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将 大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面 ，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析， 得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息） 由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术 如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相 支持物，所以称为DNA芯片技术 DNA芯片技术的概念 DNA芯片技术原理 v大规模集成的固相杂交 v基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA 双链碱基互补配对、变性和复性的原理 以大量已知序列的寡核苷酸、 cDNA或基因片段作探针，检测 样品中哪些核酸序列与其互补， 然后通过定性、定量分析得出待 测样品的基因序列及表达的信息 DNA芯片技术流程 Biological Sample Analyze dataScanner microarray “Hybridize” arrayer vMicroarray fabrication vSample preparation vMolecular hybridization vDetection and analysis 基因诊断的原理 v利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或 RNA水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态 ，从而对疾病做出诊断的方法 v策略 检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因 检测与某种遗传标志连锁的的致病基因 检测表型克隆基因 基因治疗的机理 v 基因置换：正常基因取代致病基因 v 基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列 v 基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能 v 基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达 v 基因封闭：封闭特定基因的表达 v “自杀基因”的应用 v 免疫基因的治疗 v 耐药基因的治疗 美国医学家WF安德森等人对腺甘脱氨 酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是 世界上第一个基因治疗成功的范例 19901990年年9 9月月1414日，安德森对一例患日，安德森对一例患ADAADA缺乏症的缺乏症的4 4岁岁 女孩谢德尔进行基因治疗。这个女孩谢德尔进行基因治疗。这个4 4岁女孩由于遗传基因岁女孩由于遗传基因 有缺陷，自身不能生产有缺陷，自身不能生产ADAADA，先天性免疫功能不全，先天性免疫功能不全， 只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自 己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这 种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的 基因所替代。在以后的基因所替代。在以后的1010个月内她又接受了个月内她又接受了7 7次这样的次这样的 治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋 健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。 谢德尔，1999 n 分子诊断 l 利用PCR技术或 PCR与分子杂交 标记相结合，可 以快速准确地检 测出病原性物质 。 n 分子诊断 l l 遗传性疾病的诊断遗传性疾病的诊断 羊水和胎盘绒毛膜检测 第一节酶联免疫吸附测定 v抗体高度特异地与抗原分子结合 v通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA) 一、酶联免疫吸附测定的原理 工作原理： v主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合 v假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于 检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然 后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在 免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体 二、检测过程： 将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴 定板）上 加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（ primary antibody）,反应后冲洗，将未结合上的 一抗洗去 加入二抗（secondary antibody），二抗通常只 特异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还 连着一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶 等，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物 转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后，再 次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去 加入无色底物 双抗体夹心法 v检测大分子抗原 间接法 v检测抗体 竞争法 v测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体 双夹心法 v测定大分子抗原 特异性相同，来源不同 3、使用多克隆抗体的缺点 同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制 备的抗体的量之间也会有差异 无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子 之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分 ，因为在ELISA检测中都会发生颜色变化 v单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置 4、酶联免疫吸附测定的局限性 v仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作 为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进 行western检测 v要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特 异性 v在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位 点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方 式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结 合 第二节 DNA诊断系统 vDNA诊断的理论基础：任何一个决定生物 学特性的DNA序列都应该是独特的，都可以 作为专一性的诊断标记 一、核酸杂交 1、工作原理： 两条DNA链之间可以通过碱基配对而形 成氢键 2、3个关键要素： 探针DNA 目的DNA 信号检测 主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 GC ; DNA与RNA杂杂交: A=U、 GC ; 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补 双链 碱基互补 核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段 杂交 加入标记核酸探针 检测杂交信号 标记核酸探针 预杂交 制备核酸探针 漂洗去除未参与杂交的标记探针 3、杂交探针 v必须是高度特异性的DNA片段 v种级探针：区分两个或多个物种 v亚种级探针：区分物种内特定的株系 vDNA vRNA v化学合成或克隆的完整基因 v基因的一个片段 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理， 可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待 测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同 源核酸序列的存在 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与 待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同 源序列 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、 荧光素等）两大类 v分离杂交探针的方法： v提取某一病原微生物株系的染色体DNA v限制性内切酶进行酶解 v得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库 v文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性 微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选 v核酸杂交的灵敏度和可靠性极高 v用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和 组织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯 化DNA v若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目 的序列扩增，再进行杂交检测 从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可 用于对所有的致病微生物的检测 4、非同位素标记探针 v 32P的缺点： 半衰期短，仅13天 操作起来比较危险 必须要有特殊的实验室设备进行操作 放射性垃圾的处理繁琐 v非放射性杂交检测系统： 通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化 学发光物质而达到放大信号的目的 v采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA 的方法制备探针 v生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年 v检测发光和颜色变化可在几小时内完成 B B B BAP B BAP 生物素 加入链霉素抗生物蛋白 加入生物素标记的碱性磷酸酶 探针 目的DNA 加入不同的生色或化学发光底物 荧光标记的引物直接进行PCR检测 DNA 引物1 引物2荧光染料 PCR 层析 荧光检测 游离引物 v分子夹心探针检测 发出荧光 分子夹心探针 (没有荧光) 荧光团猝灭剂 目的DNA 与目的DNA杂交 TaqMan探针技术 v原理： 利用Taq酶的3 5外切核酸酶活性，切断探针 ，产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合， 荧光的强弱就代表了模板的数量 3 5 5 3 Q R 上游 引物 下游 引物 5 3 3 5 Q R TaqMan探针的荧光信号产生机制 疟疾的分子诊断： v检测是否存在疟原虫 v抽取血样进行镜检 v免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感染还是现在感染 vDNA杂交诊断 例一： vDNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列 v具体的分离过程： v构建一个疟原虫的核基因文库 v用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库 v选出那些杂交信号最强的克隆 v用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中 不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作 为DNA探针的可靠性 锥虫的 检测 v锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经 系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞 v显微镜检新鲜血液 v取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40天后 杀死昆虫,镜检昆虫的肠道 v免疫检测:假阳性高 例二： vPCR检测 v针对锥虫特有的一段188bp的DNA序列设 计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到 188bp的条带 二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊 断技术 v抗生素的不合理使用 vDNA杂交 vPCR检测 v噬菌体介导 DNA杂交 v设计16SrRNA为探针 v16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守 性 v特异性不是很好 v必须结合PCR技术 PCR检测 vnested PCR v针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引 物 每对引物都能特异的扩增出 一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增 加 模板 使用外引物，进行第一 次PCR扩增 使用内引物，进行第二 次PCR扩增 第一次PCR扩 增产物 第二次PCR扩 增产物 巢式PCR原理示意图 vPCR技术也会产生假阳性 v新扩增的目的DNA特异性不强 v退火温度过低 v模板中杂质的污染 v假阴性 v存在Taq酶的抑制剂 v模板量过少 v模板DNA纯度不够 v原位PCR(in situ PCR,ISPCR ) v在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行 扩增，并通过原位杂交进行检测 v不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织 细胞中定位 原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂 交，进而检测特异的DNA或RNA序列 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的 形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态 有 噬菌体介导细菌检测 v将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用 转基因噬菌体去侵染待测样品 v噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在 内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧 光素和ATP，就会有荧光产生 v结核菌的检测 v抗药性菌株的检测 荧光素酶 荧光素ATP荧光 利用宿主细胞 转录、翻译 噬菌体基因 荧光素酶 基因 宿主细菌 噬菌体介导的细菌检测 第三节 DNA指 纹 v每个人体细胞内都 含有23对染色体，每 条染色体中部含有一 个DNA分子，DNA分 子中的核苷酸序列包 含着遗传信息，在 DNA分子中存在三种 类型：单拷贝序列、 中等程度重复序列、 高度重复序 v每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复， 序列经过超离心后以卫星带出现在主要DNA带的附近，所 以也称卫星DNA，其中的重复序列单元则称为“小卫星 DNA” v “小卫星”具有高度的可变性，但在“小卫星DNA “中 有一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列” 。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的 DNA进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们 与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作“DNA指 纹” v 通过对人类基因组的解析，发现人与人之间9999的 碱基序列都相同，而剩下的0.01%的碱基特征序列则来自 于双亲，据此可用于“亲子鉴定” 所罗门的审判： 大家都听说过所罗门的审判这样一件故事： 两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于 是 所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将 其 辟成两半分给他们两， 结果假母亲同意所罗 门的判决，而孩子真 正的母亲却恳求侍卫 饶了孩子的性命，她 解释说：“把孩子给了 假母亲，总比让孩子 惨死好。”当然，真假母亲也就水落石出了。 滴骨验亲法： 以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内 ，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍 中有多种记录。 三国时代（公园220280年）谢承著会稽 先贤传中的以弟血滴兄骨可能是记录此法 的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当 时一同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐 败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己 的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸 入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄 的尸骨。 合血法： 等到了明代，更是采用了“合血法”来识别亲 权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲 子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各 刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也 。” 方 法 ： vDNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所 得到的具有特征性的DNA分子杂交图谱 vDNA 酶解 电泳 转膜 杂 交 v最常用的DNA探针是微卫星序列 受害者血样 犯罪嫌疑人 衣物上血样 犯罪嫌疑 人血样 第四节 遗传性疾病的分子诊断技术 直接诊断 点突变 间接诊断 多态性连锁分析 美国前副总统汉弗莱美国前副总统汉弗莱Humphrey)Humphrey) 在在19671967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞 良性良性“慢性增生性囊肿慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。，未进行手术治疗。 九年后，他被诊断为患有九年后，他被诊断为患有“膀胧癌膀胧癌”，两年后死于该病。，两年后死于该病。 19941994年，研究者用灵敏的年，研究者用灵敏的PCRPCR技术对上述汉弗莱技术对上述汉弗莱19671967 年的病理切片进行了年的病理切片进行了P53P53抑癌基因检查，发现那时的组抑癌基因检查，发现那时的组 织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53P53 基因的第基因的第227227个密码个密码子子已经发生了一个核苷酸的突变。已经发生了一个核苷酸的突变。 就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致 九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之 前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出 来了来了 P53P53抑癌基因抑癌基因 遗传性疾病的分子诊断技术 vPCR酶解鉴定 vPCROLA鉴定 vPCR-ELISA检测 vPCR-DGGE鉴定 v扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS） v连接酶链反应（LCR） 镰刀形细胞贫血症(sickle-cell anemia) v典型的单基因遗传性疾病 v血红蛋白的链（珠蛋白）的第六个氨基酸Glu 发生突变成Val 血红蛋白 - 链上 谷氨酸 变成缬氨酸 英国女王维多利亚。她带有英国女王维多利亚。她带有血友病基因血友病基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种，并将其传给了她的儿女。血友病是一种 遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一 般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病 症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有1717人是她的后裔，人是她的后裔， 其中有她的孙女亚历山德拉（其中有她的孙女亚历山德拉（2121），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子 患有血友病。患有血友病。 血友病血友病 基基 因因 一、PCR酶解鉴定 v 正常基因为CCTGAGG v镰刀形贫血病患者的基因为CCTGTGG v限制性内切酶CvnI的识别序列为CC TNAGG v方法: v在CvnI位点的两点设计两个引物; v包含CvnI位点区域的DNA片段通过PCR扩增出 来; v扩增的DNA用CvnI酶处理，酶解产物用凝胶 电泳分开，经溴化乙锭染色后就可在紫外灯 下检查DNA带型。 382 256 201 181 88 条带大小(bp)正常纯合子杂合子突变纯合子 CvuI处理 CvuICvuICvuI 256bp 201bp 181bp 88bp CvuICvuI 256bp382bp88bp 正常情况 镰刀形细胞贫血症 PCR 扩增 引物1 引物2 PCR产物（长726bp） 二、PCR/OLA鉴定 vOLA(oligo-nucleotide ligation assay),寡 聚核苷酸连接分析 v假定一个正常的基因在一个特定的位置发生 了突变，比如说150位的T突变为G v根据150位两边的序列，人工合成两段短的 核苷酸链，使这两段寡聚核苷酸链与基因的 一条链互补 v探针X：寡聚核苷酸链的3端最后一个核苷酸正 好与正常基因的150位的的核苷酸配对 v探针Y：另一段寡聚核苷酸链的5端第一个核苷 酸与151位的核苷酸配对 正常基因 探针X3端最后一个核苷酸 就不会与目的基因150位 的核苷酸配对 由于3最后一个核苷酸不配对而使 两个探针无法实现连接 目的基因突变 两探针与目的基因的 完美配对 两个探针就可连 接起来 加入DNA 连接酶 B 150 151 D BD 150 151 B X Y 150 151 D B D 双链目的DNA 或PCR产物 热变性 单链目的DNA 或PCR产物 加探针退火 完全配对 模板有突变 ,不完全配 对 连接酶 连接酶 加入链霉抗生 物素蛋白 加入链霉抗生 物素蛋白 BD B 加入碱性磷酸酶 加入无色底物 加入碱性磷酸酶 加入无色底物 BDAP 变色 无色底物 有色底物 B 保持无色 无色底物 PCR/OLA分析程序示意图 例：例：特异性互补寡核苷酸法特异性互补寡核苷酸法检测检测镰状红细胞贫血症镰状红细胞贫血症 （1）提取DNA，热处理成为单链DNA； （2）以单链DNA为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计 引物进行PCR扩增后转移到滤膜上，热变性成单链； （3）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（ASO）杂交。 三、PCR-ELISA检测 v在PCR反应体系中加入生物素标记的dUTP和 其他3种dNTP v3端经DIG标记特异性探针 v包被有抗生物素抗体的酶标板 v抗碱性磷酸酶（AP）DIG抗体 v如果加入的DIG标记的探针可与扩增片段结 合，则酶标板上有颜色反应发生，否则不会 有颜色的变化 四、PCR-DGGE法 v原理 变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段 的熔解性质而使之分离的凝胶系统 Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少 DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度5060 ，变性剂0100% 当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加 的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰 好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开 始熔解，而高熔点区仍为双链 v原理 同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位 置处达到各自最低解链区域的解链温度，部分 解链的DNA片段在胶中的迁移速率急剧降低，形 成相互分开的条带图谱 不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域 时，这些片段就不能被区分，则人为地加入一 个高熔点区GC夹，即在一侧引物的5端加 上一个3040bp的GC结构，使相应的感兴趣的序 列处于低熔点区而便于分析 突 变 型 野 生 型 杂 合 型 五、扩增阻滞突变系统 v等位基因特异性扩增 v原理 Taq缺乏3 5外切酶活性，如果引 物的3 端不能与模板DNA严格互补配对， 模板DNA 就不能有效的扩增 5 TACATTAGGTT 3 3 TAATCCAA 5 PCR反应继续 5 TACCTTAGGTT 3 AATCCAA 5 PCR反应终止 3 T 5 TACATTAGGTT 3 AATCCAA 5 PCR反应终止 3G 5 TACCTTAGGTT 3 3 GAATCCAA 5 PCR反应继续 野生型序列突变序列 野 生 型 引 物 突 变 引 物 ARMS原理示意图 野生型DNA A T T 3 引物3 发红光 C G T 3 引物3 无法扩增没有荧光 A ARMS 检测突 变体举 例 纯合突变体DNA C G G3 引物3 发绿光 A T G 3 引物3 无法扩增没有荧光 B ARMS 检测突 变体举 例 杂合突变体DNA A G T 3 引物3 G 发黄光 C ARMS 检测突 变体举 例 T C 引物1 引物2 G T 六、连接酶链反应 v基本原理 利用DNA连接酶特异地将双链DNA片段连接，经 变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基 因序列大量扩增 设计两对分别互补的引物，引物与之互补的模 板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的 相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连 接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步 骤(变性-退火-连接)就能反复进行，若连接处 的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结 合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连 接反应不能进行，也就不能形成连接产物 第五节 基因工程疫苗 一、疫苗的简介 二、基因工程疫苗 1、亚单位疫苗 2、肽基疫苗 3、DNA疫苗 一、疫苗的简介 v Dr Edward Jener（1796）： 用一种奶牛痘感染人类，感染后不再被天花 感染 v Louis Pasteur （19世纪末）： 研制成功狂犬疫苗 v Von Behring Kitasato Shibasaburo： 开发研制白喉/破伤风疫苗 v医学上最有潜力的防御物质 v灭活的和减毒的致病物质 不能丧失引起免疫反应的能力 v麻疹、白喉、百日咳、破伤风、天花、脊髓灰质 炎 传统疫苗的局限 性 有些致病物无法在培养基上生长； 动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养； 培养的动物和人类病毒其生长速度和产量一般都很 低； 需要对实验室以及参加实验的操作人员采取特殊的 保护措施； 疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中又可能没有完 全杀死或充分减毒； 减毒菌株有可能发生突变； 有些疾病（如艾滋病）用传统的疫苗防治收效甚微 ； 绝大多数的现行疫苗的有效期短。 衡量疫苗能否投入使用的标 准 v安全性 删除致病基因，保留抗原性。 v有效性 尽可能调动机体细胞免疫和体 液免疫。 v免疫系统的工作机制：体液免疫、细胞免疫 抗原抗原肽细胞表面复合物 活化的B 细胞（浆 细胞） 淋巴因子 活化的T细胞 抗体杀灭抗原分