剁辣椒发酵过程中抗氧化作用研究——毕业论文

湖 南 农 业 大 学全日制普通本科生毕业论文剁辣椒发酵过程中抗氧化作用研究ANTIOXIDATIVE ACTIVITY OF CHOPPED PEPPER DURING THE FERMENTATION学生姓名：学 号：年级专业及班级： 食品质量与安全 指导老师及职称： 学 院：食品科学技术学院湖南长沙 提交日期： 年 月目录摘 要1关键词11 前言12 材料与方法22.1 实验材料22.1.1 原料22.1.2 器具32.1.3 试剂32.2 仪器与设备32.3 试验方法32.3.1 剁辣椒制备工艺路线32.3.2 剁辣椒制备方法32.3.3 pH测定前处理42.3.4 pH值测定方法42.3.5 总酸的测定方法42.3.6 抗氧化性测定的前处理52.3.7 抗氧化性测定52.3.8 总酚含量测定的前处理52.3.9 总酚含量的测定63 结果与分析63.1 剁辣椒发酵过程中pH的变化63.2 剁辣椒发酵过程中总酸的变化63.3 DPPH自由基清除试验结果73.4 还原力测定结果83.5 没食子酸标准曲线93.6 剁辣椒发酵过程中总酚含量的变化94 结论10参考文献10致 谢11剁辣椒发酵过程中抗氧化作用研究 摘 要：本研究以自然发酵剁辣椒为研究对象，取不同发酵时间点的剁辣椒，测定其pH、滴定酸，并初步探讨了剁辣椒乙醇提取物的抗氧化作用。结果表明：剁辣椒在发酵过程中，其pH值呈现下降趋势，总酸度不断上升。剁辣椒乙醇提取物的DPPH自由基清除和还原力能力不断增强，剁辣椒的多酚含量也呈现逐渐增加的趋势，在发酵12 d后，总多酚的含量增加明显。关键词：剁辣椒，pH总酸度，抗氧化性，总酚含量Antioxidative Activity of Chopped Pepper During the Fermentation Abstract:In this study, the natural fermented pepper was used as the research object. The samples of the pepper were taken at different fermentation time points. The pH and titratable acidity were measured. The antioxidation of ethanol extract of the pepper was also determined. The results showed that the H value of chopped pepper during the fermentation process showed a downward trend, and the total acidity increased continuously. The DPPH free radical scavenging capacity of the ethanol extract of chopped pepper increased, and the polyphenol content of chopped pepper also showed a gradual increase. After 12 days of fermentation, the total polyphenol content increased significantly.Key words:chopped pepper; pH; antioxidant activity; total phenolic content1 前言辣椒，拉丁学名Capsicum annuum，别名：辣子、牛角椒、辣角、红海椒、朝天椒属于茄科；是一年生或有限多年生植物1 。辣椒多为灌木、半灌木、多分枝、单页互生、多生，浆果不含汁液，其果皮肉质类似革质，种子呈盘形状，扁圆，胚呈弯曲状物2 。原产国是墨西哥，现在属于世界性植物。辣椒在明朝末年传入我国，在中国主要分布在四川、贵州、湖南、陕西、河南、河北以及内蒙古等地3。目前我国已经有几十种辣椒品种，如朝天椒，小米椒，且种植面积广大4。仅2003年，我国辣椒的种植面积就有130万公顷面。到2005年，我国辣椒总产量已居世界第一。2006年，我国辣椒全球贸易额约为980亿元5全球辣椒贸易额逐年增加，超越茶叶和咖啡，我国成为第一大辣椒出口国6。 辣椒营养成分丰富，富含辣椒碱、二氢辣椒碱、辣椒红素、碳水化合物、大量的维生素C以及钙、磷等，含有一定量的铁、硫胺素、尼克酸、苹果酸、柠檬酸、脂肪油、树脂等7，辣椒中还含有龙葵碱、龙葵胺、澳洲茄碱等生物碱类物质8 。从1g辣椒中2mgVC，曾是匈牙利科学家吉奥尔吉的杰出成就，因此在1937年他获得了诺贝尔奖，辣椒被他誉为红色药材9。辣椒所含有的这些物质使其自身具有药理作用，对一些列如坏血病、高血压、血管硬化脑溢血、肠胃功能障碍的疑难杂症有防治作用10 。剁辣椒，又名发酵辣椒，是中国传统的风味调味品，其味道鲜美，且具有促进食欲，解腻助消化等保健功效11 。剁辣椒咸香共有，风味独特，其中剁辣椒的酸味来自发酵过程中产生的乳酸，辣味来自辣椒本身的辣椒素类物质，甜味来之辣椒中的糖类物质，咸味则来自制作剁辣椒时加入的食盐，因此剁辣椒既可以作为调味料，也可以作为主菜肴物12 。因此，剁辣椒成为湖南省最常见，销量最大的辣椒制品。抗氧化物质是具有能延缓和抑制体内氧化过程的物质，广泛的存在于日程食品蔬菜水果中物13 。抗氧化剂的存在，就是清除体内过多自由基，或者当机体处于不良环境下，产生大量自由基而抗氧化剂不足，就会导致机体受损14。抗氧化性剂的抗氧化性主要是抑制体内物质的氧化降解，清除体内过多自由基和表还原力15 。多酚是一种氧化还原电位很低的还原剂，提供氢离子与羟基自由基结合，生成惰性化合物或者稳定的自由基，清除体内过多的有害自由基，因此多酚具有预防白内障、关节炎等疾病的作用16 。N.Deepa17 使用福林酚分光光度法测定辣椒中多酚的含量，结果显示辣椒中总酚含量很高，具有良好的抗氧化性。本文采取DPPH法18 ，和还原力测定来研究剁辣椒在发酵过程中抗氧化性的变化规律，并测定剁辣椒发酵过程中多酚含量的变化，探讨两者之间联系。2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 原料红辣椒、碘盐、大蒜籽（选用完好无腐败,机械损伤的）、生姜（新鲜仔姜）、白酒（老白干），均购自湘桦连锁超市（农大店）和东之源超市（滨湖店）。2.1.2 器具制作剁辣椒器具：菜刀、砧板、不锈钢盆、泡菜坛，实验器具：烧杯、锥形瓶、容量瓶、量筒。2.1.3 试剂DPPH、没食子酸、福林酚（均由湖南农业大学实验室提供）。2.2 仪器与设备表1 仪器与设备Table 1 Instruments and equipment仪器型号生产厂家电子天平YP-B5902型上海光正医疗仪器有限公司pH计S20型梅特勒-托利多仪器有限公司生化培养箱GZ-400-S型韶关市广智科技设备有限公司电热鼓风干燥箱DHG-9246A型上海精宏实验设备有限公司冰箱BCD-215KALM型青岛海尔股份有限公司微量分析超纯水机WP-UP-WF-20型沃特尔水处理设备有限公司数控超声波清洗器KQ-700DE型昆山市超声仪器有限公司电热恒温水浴锅DK-98-锅有型天津市泰斯特仪器有限公司高速离心机Avanti J-26XP型美国贝克曼库尔特公司紫外分光光度计TU-1901北京普析通用有限责任公司打浆机MB-1001苏泊尔公司2.3 试验方法2.3.1 剁辣椒制备工艺路线红线椒等原辅料洗净晾干剁碎称重拌料装坛密封发酵成品2.3.2 剁辣椒制备方法（1）分别将所有器具（砧板、菜刀、不锈钢盆、汤匙、筷子和玻璃瓶以及玻璃瓶盖）放入电热恒温水浴锅沸水浴15 min杀毒消菌，烘干备用。（2）将红线椒去蒂洗净晾干切碎（0.5 cm左右宽度）；生姜洗净去皮晾干切碎成姜沫；大蒜籽去皮切碎成蒜沫。（3）按表2称取相应质量的各原辅料，先将食盐、大蒜籽、生姜、白酒和氯化钙粉末在不锈钢盆中混合均匀，再将上述混合物拌入已切碎的辣椒碎中拌匀。表2 剁辣椒配料比Table 2 The ingredient ratio of chopped pepper原辅料辅料用量剁碎新鲜辣椒（以辣椒量为基数）100%食盐10%大蒜籽5%生姜3%白酒0.5%氯化钙0.1%（4）根据表配料做出混匀产物后装坛，装坛后置于30恒温培养箱发酵。2.3.3 pH测定前处理（1）配制0.1 mol/LNaOH溶液，1%酚酞乙醇溶液。（2）将蒸馏水煮沸510 min，冷水浴快速降温备用（煮沸后30 min 内使用）。（3）取30 g样品，加入上述蒸馏水30 mL，用打浆机将上述混合物打磨成匀浆。2.3.4 pH值测定方法参照GB 10468 - 1989 水果和蔬菜产品pH值的测定方法19 。分别在第0 d、第6 d、第12 d、第18 d、第24 d、第27 d、第30 d取坛中剁辣椒样品，按照2.3.3中方法制成匀浆，用pH计测定匀浆的pH值。2.3.5 总酸的测定方法参照GB/T 12456 - 2008 食品中总酸的测定方法20 。（1）准确称取0.400 g烘干的邻苯二甲酸氢钾标定NaOH。（2）分别在第0 d，第6 d，第12 d，第18 d，第24 d，第30 d称剁辣椒样品15.000 g制成匀浆，加入40 mL煮沸后冷却至80 冷左右的蒸馏水，置于沸水浴中煮沸30 min（摇匀23次，使试样中的有机酸全部溶于溶液中，）取出后冷却至室温，再用煮沸后冷却的蒸馏水定容至250 mL。然后将上一步溶液过滤，除去初滤液，收集剩余滤液。（3）准确称取（2）中滤液50.000 mL，加50 mL 冷却后煮沸的蒸馏水以及4滴1%酚酞指示剂，用NaOH（0.1 mol/L）滴定至微红色且30 s不褪色，并记录消耗NaOH (0.1 mol/L)标准滴定溶液体积的数,平行测定两次，两次平行测定的平均NaOH消耗量记作V1。（4）空白试验：做以煮沸后冷却的蒸馏水做空白对照，且平行测定2次。两次平行测定的平均NaOH消耗量记作V2。（5）食品中总酸含量以质量分数X计，数值以每千克（g/kg）表示，按以下公式计算结果：F：样品稀释倍数；K：酸的换算系数，本试验用K乳酸=0.090；C：NaOH浓度，单位：mol/L，具体数值用邻苯二甲酸氢钾滴定结果表示；V1、V2：V1平行测定的平均NaOH消耗量，V2对照的空白NaOH消耗量，单位 mL。2.3.6 抗氧化性测定的前处理（1）在剁辣椒发酵过程中的第0 d、第6 d、第12 d、第18 d、第24 d、第30 d称取100 g剁辣椒样品冷冻干燥。（2）准确称取冷冻干燥后的剁辣椒2 g，粉碎后置于三角瓶中，加入40 mL无水乙醇，超声波提取20 min，过滤，滤渣再用40 mL无水乙醇超声波提取20 min，过滤，合并两次滤液，3000 r/min离心取10 min，取上清液用无水乙醇定容至100 mL，以待备用。2.3.7 抗氧化性测定DPPH自由基清除率测定：（1）分别取2 mL用0.1 mol/LNaOH溶液调至pH=5.0的样液于两支试管中，并分别加入2 mL浓度为0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液和2 mL乙醇溶液，空白对照为2 mL乙醇溶液加DPPH溶液，不断震荡摇匀，30 min后用紫外分光光度计在517 nm处测定其吸光度Ai，A0，Aj，平行测定两次。（2）计算结果：自由基清除率（）=1-(Ai-Aj)/A0100Ai：2 mL样品提取液+2 mLDPPH乙醇溶液A0：2 mL乙醇溶液+2 mLDPPH溶液Aj：2 mL样品提取液+2 mL乙醇溶液还原力测定：用移液枪吸取1 mL样品提取液于10 mL离心管，并用移液枪加入1 mL的pH 6.6的磷酸缓冲溶液和1 mL的1%铁氰化钾溶液，振荡混匀后放入50 恒温水浴锅，保持20 min后取出加入1 mL的10%三氯乙酸溶液，振荡混匀后迅速冷却，再于混合液中加入1 mL蒸馏水和0.2 mL0.1 三氯化铁溶液，混匀后于700 nm处测定其吸光值。2.3.8 总酚含量测定的前处理（1）准确称取冷冻干燥剁辣椒0.500 g，剪碎置于研钵中,捣碎,加入15 mL无水乙醇溶液,超声波提取20 min，3000 r/min离心10 min后过滤，滤液澄清为止,滤渣用同样方法提取一次，合并滤液，无水乙醇定容至50 mL。（2）没食子酸贮备液精确称取没食子酸0.250 g，蒸馏水溶解后定容至250 mL，配成没食子酸母液。2.3.9 总酚含量的测定（1）标准曲线的绘制：分别用移液管移取没食子酸母液0、5、10、15、20、25 mL置于250 mL容量瓶，加蒸馏水定容。分别用移液枪吸取0.5 mL置于试管中，再加入2.5 mL10%福林酚溶液振荡摇匀使其反应5 min，然后加2 mL 7.5%碳酸钠溶液，摇匀避光1 h后，在765 nm处测定其吸光度。以没食子酸浓度梯度溶液的没食子酸浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线。（2）样品中总酚的测定：取样品提取液0.5mL置于试管中，加入2.5 mL10%福林酚溶液振荡摇匀使其反应5 min，然后加入2 mL 7.5%碳酸钠溶液，摇匀后避光1 h后，于765 nm处测定其吸光度，由没食子酸标准曲线，确定总酚含量。3 结果与分析3.1 剁辣椒发酵过程中pH的变化将剁辣椒放置于30 辣恒温培养箱里进行发酵，以剁辣椒发酵天数做为横坐标，以pH值作为纵坐标，绘制剁辣椒发酵过程中pH的变化曲线图，见图1。图1 剁辣椒发酵过程中pH值的变化Figure 1 Changes in pH during the fermentation of chopped pepper由图1可知，在剁辣椒的发酵过程中，pH值随着发酵天数的增加而有不同趋势的降低，从0到12 d之间，pH值缓慢降低。从12 d到18 d，测得pH值下降到4.42，共下降了0.25。可以得出剁辣椒装坛后的第12 d到第18 d是发酵的“高峰期”，而在第24 d后，pH值又开始了缓慢的下降，最终维持在4.2。3.2 剁辣椒发酵过程中总酸的变化将剁辣椒放入30恒温培养箱中进行发酵，以剁辣椒发酵天数作为横坐标，以总酸值作为纵坐标，绘制剁辣椒发酵过程中总酸的变化曲线图，见图2。 图2 剁辣椒发酵过程中总酸度的变化Figure 2 Change in total acidity during fermentation of chopped pepper在剁辣椒的发酵过程中选取了6个点测定其总酸度，由图2可以看出，在剁辣椒的发酵过程中，剁辣椒的总酸度变化总体呈现一个上升的趋势，说明在辣椒在发酵过程中，产生了大量的酸。而在本实验测定的发酵第24 d的总酸含量小于第18 d测定的值，而后在第30 d测定时，总酸含量又上升了，使总酸的变化有了一个折线的变化，在查阅文献，分析试验操作，试验记录结果后，是第24 d试验中滴定操作失误，使滴定用的NaOH量比正常数据小，计算出结果偏小，试验数据错误。3.3 DPPH自由基清除试验结果取第0，6，12，18，24，30 d剁辣椒冷冻干燥样品，用无水乙醇进行提取，测定提取物的DPPH自由基清除率，以剁辣椒发酵天数作为横坐标，DPPH自由基清除率作为纵坐标，绘制剁辣椒发酵过程DPPH自由基清除率变化曲线图，见图3。图3 剁辣椒发酵过程中DPPH自由基清除率的变化Figure 3 Change in DPPH free radical scavenging rate during fermentation of chopped pepper由图3可知，在剁辣椒的发酵过程中以无水乙醇提取的剁辣椒提取物（0.02 g/mL）测定剁辣椒的DPPH自由基清除率，其总体呈现一个上升的趋势。第0 d测定显示剁辣椒的DPPH自由基清除率初始即有80%，说明剁辣椒发酵初始就有较强的抗氧化性。而后在第6 d到第18 d的曲线可以看出，在这12 d中剁辣椒的DPPH自由基清除率以较大速度上升，在第18 d达到95%，可以说明剁辣椒的发酵在这个阶段其抗氧化性大大提升。而后在第18 d到第30 d，剁辣椒的DPPH自由基清除率虽然也有提高，但提高的速率较前18 d而言很低。可以看出剁辣椒发酵到第18 d时，其DPPH自由基清除率以较大速度提升到较为饱和状态，而后其DPPH自由基清除率以缓慢速度增长。发酵到30 d后，其DPPH清除率达到97%。3.4 还原力测定结果取第0，6，12，18，24，30 d剁辣椒冷冻干燥样品测定剁辣椒的还原力，以剁辣椒发酵天数做为横坐标，以吸光度做为纵坐标，绘制剁辣椒发酵过程中其吸光度变化曲线图，见图4。图4 剁辣椒发酵过程中还原力的变化Figure 4 Change in reducing power during the fermentation of chopped pepper由图4可以看出，以0.02 g/mL的剁辣椒无水乙醇提取物测定的吸光度，并以吸光度大小表示还原力，可以看出随着发酵天数的增加而上升，其还原力的上升有着不同的趋势。从图中可以看出，从第0 d到第6 d，剁辣椒的还原力上升的并不多，而从发酵的第6 d开始到发酵的第18 d这12 d中，剁辣椒的还原力有较大提高，这其中又以发酵第12 d到18 d中间提升最多，说明剁辣椒发酵的这个阶段还原性得到了很大的提高。而发酵18 d之后，剁辣椒的还原力则以很缓慢的速度上升，从第18 d到第30 d这12 d中，剁辣椒的还原力的提升很小。还原力的测定结果和DPPH自由基清除实验结果相契合，说明了剁辣椒发酵过程中其抗氧化性的变化规律。3.5 没食子酸标准曲线将没食子酸母液用蒸馏水稀释成系列浓度梯度溶液，在765 nm处测定其吸光值，以系列浓度梯度溶液中没食子酸的浓度为横坐标，以其在765 nm处吸光值为纵坐标，绘制成标准曲线图，见图5。图5 没食子酸标准曲线Figure 5 Gallic acid standard curve3.6 剁辣椒发酵过程中总酚含量的变化以标准曲线中的回归方程，计算出不同发酵天数时剁辣椒的总酚含量，列出表3，如下。表3发酵过程总酚含量Table 3. Total phenol content during fermentation发酵天数（d）0612182430总酚含量（g/g）273129343161385844605352以剁辣椒发酵天数为横坐标，总酚含量（没食子酸当量表示）为纵坐标，绘制总酚含量变化曲线图，见图6。图6 剁辣椒发酵过程中总酚含量变化曲线图Figure 6 Graph of changes in total phenolic content during the fermentation of chili pepper图6中可以看出剁辣椒发酵过程中总酚含量的变化趋势。总体上看，剁辣椒发酵过程中，总酚含量是上升的。从发酵0 d开始，即新鲜辣椒本身就有多酚物质，到发酵12 d，剁辣椒的总酚含量虽有提升，但多酚物质产生的并不多。而发酵的第12 d开始到第30 d，其总酚含量高速增加，这中间18 d产生的多酚物质几乎是前12 d产生的量的多倍。4 结论（1）剁辣椒在自然发酵过程中，pH值总体下降，在发酵30 d后保持在4.2左右，而总酸度在保持上升，在发酵30 d后维持在3.7 g/Kg。（2）剁辣椒发酵过程中抗氧化性的测定，本文采取DPPH自由基清除实验，还原力测定。两种抗氧化试验结果说明了剁辣椒发酵过程中抗氧化性的变化规律，即在剁辣椒发酵过程中，抗氧化性能力呈增加趋势，在发酵6 d时，抗氧化性小幅增加，发酵6 d到发酵18 d之中，剁辣椒的抗氧化性大幅增加，发酵18 d到发酵30 d之中，剁辣椒的抗氧化性又呈现缓速增加状态，并有维持在一定水平的趋势。（3）剁辣椒发酵过程中总酚含量总体增加，在发酵12 d时，总酚含量提升的并不多，而在发酵12 d以后，总酚含量增加量较大。（4）经查阅文献得知，姜、蒜中多酚物质含量较低，且本试验中姜、蒜所用量极少，应对试验结果无影响。从本试验结果可以得出，剁辣椒发酵过程中抗氧化作用的增加，可能与剁辣椒中多酚物质含量增加有关。参考文献1 中国科学院中国植物志编辑委员会,中国植物志M.北京:科学出版社,1978: 622 钱崇澎,陈焕镛.中国植物志M.北京:科学出版社, 2004, 67(1): 62-633 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草M.北京:上海科学技术出版社4 李锡香.辣椒遗传资源评价数据库信息分析J.计算机与农业, 1999, 23-255 李晴,韩玉珠,张广臣.国内外辣椒产业现状与发展趋势J.湖北农业科学, 2009, 48(9): 2278-22816 毛亦卉,向拉蛟,对我国辣椒产业发展发展对策思考J.辣椒杂志, 2007(2): 1-4.7 邹学校主编.中国辣椒M.北京:中国农业出版社, 20028 江苏新医学院.中药大辞典M.上海:上海科学技术出版社, 1997, 25709 蒋佃水.辣椒的医疗保健功效J.中国食物与营养, 2001(6): 4710 李巧玲.辣椒中有效成分的提取及利用J.山西食品工业, 2003, 3(1): 30-3211 韩雪.发酵蔬菜汁营养成分分析及再利用C.乳酸菌与营养健康:第九届乳酸菌与健康国际研讨会摘要汇编中国食品科学技术学会,212 李德风,黎迅,刘焱等.发酵蔬菜的安全性研究进展J.中国酿造, 2016(4): 11-1413 蒋厚阳,杨吉霞,赵国华等.食品抗氧化评价体系及其选择使用J.食品工业科技, 2012(24): 41414 刘志东,郭本恒,王荫榆.抗氧化性活性检测方法的研究进展J.天然产物研究与开发,2008,20: 563-56715 陈龙.云南十种辣椒抗氧化性及抑菌活性的研究D.昆明理工大学硕士学位论文, 201016 孙建霞,孙爱东,白卫滨.苹果多酚的功能性质及应用研究J.营养保健, 2004(10)12-1317 N.Deepa, Charanjit Kaur, Binoy Gerge, ct al.Antioxidant constituents in some sweet pepper (Cap