毕业论文——维生素C修饰的纳米硒抗氧化性研究

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 毕 业 论 文题目： 维生素C修饰的纳米硒抗氧化性研究 学 院： 食品科学与工程学院 姓 名： 学 号： 专 业： 食品质量与安全 班 级： 食安 指导教师： 职 称： 年 月目 录摘要IAbstractII引言11 材料2 1.1 试验材料2 1.2 试验试剂2 1.3 试验仪器22 试验溶液配制23 试验方法33.1 清除羟自由基的能力测定33.2 清除超氧阴离子自由基的能力测定33.3 清除DPPH自由基的能力测定43.4 还原能力的测定44 结果与讨论44.1 清除羟自由基的能力测定44.2 超氧阴离子清除能力的测定54.3 清除DPPH自由基能力的测定64.4 还原能力的测定65 结论7参考文献8致谢9维生素C修饰的纳米硒抗氧化性研究摘要 试验通过测定维生素C修饰的纳米硒（VcSeNPs）清除羟自由基、超氧阴离子、DPPH自由基的能力以及还原能力，评价其抗氧化活性。结果显示，在试验所选择的浓度范围内，VcSeNPs对自由基的清除率及还原力均随着浓度的增大而增加。其中，VcSeNPs对O2-、DPPH及OH自由基清除率与Vc接近，而浓度超过0.4 mg/mL时，其还原力略大于Vc。试验结果表明，VcSeNPs具有抗氧化作用。关键词：维生素C修饰的纳米硒（VcSeNPs）；Vc；抗氧化性1Abstract This experiment measured four indicators of vitamin C- modified nano-selenium (VC SeNPs): ability of removing hydroxyl radicals; competence of scavenging free radicals; ability of eliminating DPPH free radicals and reducing capacity, so that the antioxidant activity was evaluated. The results showed that those four aspects were increased as the concentration of VC SeNPs augmented. Besides, there are small differences between VC SeNPs and VC according to their competence of scavenging O2-,DPPH andOH. While the concentration of those does was more than 0.4 mg/mL, the reducing force of VC SeNPs was slightly greater than that of VC. Thus, this resules indicated that VC SeNPs had antioxidant properties.Keywords: vitamin C-modified nano-selenium(VcSeNPs);vitamin C;resistance to oxidationII引言 纳米硒作为一种新研发出的产品，可以发挥硒的生物学和保健功效。它所具备的低毒性尤为关键。2000年，上海四通纳米技术有限公司将纳米硒产业化。获国家卫生部批准制成保健食品-硒旺胶囊1。2003年，陈君石院士指导进行亚慢毒性研究实验，其结果证明，纳米硒是最安全的硒制品，可长期食用2。这些优势使得纳米硒成为研究热点。抗氧化剂可以延长食物的存储期，防止氧化，增强其稳定性。在油脂中添加部分抗氧化剂如异抗坏血酸和维生素C能够避免油脂氧化。其作用机理为，利用抗氧化剂还原力，降低含氧量。 抗氧化活性是纳米硒的重要生物活性之一，主要表现在纳米硒能够通过清除自由基对细胞进行保护，防止细胞被损伤和发生癌变3。Vc是人体需要量最大的一种维生素，并且可以作为抗氧化剂在体内发挥其作用，其能够使体内的一些自由基和活性氧基团消除，防止细胞因为被氧化而发生侵害、加强对铁元素的吸收、并且提高机体的免疫能力、降低癌症的病发率等。试验所选用的维生素C修饰的纳米硒（VcSeNPs）具有很好的稳定性，然而，对VcSeNPs的抗氧化能力测定目前未被研究到。试验通过测定VcSeNPs对还原能力以及超氧阴离子、羟自由基、DPPH自由基的清除能力，对VcSeNPs的抗氧化性能进行评价，从而进一步探究纳米硒的生物功能，为纳米硒在保健食品等行业的发展提供理论依据。 1 材料 1.1 试验材料： 维生素C修饰的纳米硒（VcSeNPs）1.2 试验试剂： 1.3 试验仪器： V-5600型分光光度计 北京长安科学仪器 FA2104V型电子天平 上海青浦仪器有限公司 JW-1042低速离心机 上海安亭科学仪器厂 HH-66数显恒温搅拌循环水箱 上海安亭科学仪器厂超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司2 试验溶液配制1) 9 mmol/L 水杨酸（用无水乙醇进行配制）：称取0.12 g水杨酸，用无水乙醇进行溶解并移至100 mL容量瓶，并定容至刻度。2） 9 mmol/L FeSO4：称取0.14 g FeSO4，用蒸馏水对其进行溶解并移至100 mL容量瓶，再用蒸馏水定容至刻度。3） 8 mmol/L H2O2：移取100 L 30%的H2O2至100 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度。4） 0.1 mmol/L DPPH（用无水乙醇进行配制）：称取0.004 g DPPH，用无水乙醇对其进行溶解并移至100 mL容量瓶，最后用无水乙醇定容至刻度。5） 50 mmol/L（pH=8.2）Tris-HCl缓冲液：称取0.61 g Tris，用蒸馏水溶解、移至100 mL容量瓶，用盐酸调pH，最后用蒸馏水定容至刻度。6) 25 mmol/L邻苯三酚：称取0.16 g邻苯三酚,蒸馏水对其进行溶解并移至50 mL的容量瓶，定容至刻度。7) 0.2 mol/L（pH=6.6）磷酸盐缓冲液：分别先配制0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液，而后分别取上述溶40 mL和60 mL混合后就是0.2 mol/L pH=6.6的磷酸盐缓冲液。称取磷酸二氢钠1.74 g，磷酸氢二钠2.70 g，氯化钠1.70 g，蒸馏水溶解成400 mL。8) 1%铁氰化钾：称取1 .00 g铁氰化钾,加水99.00 g，混匀即可。9) 10%三氯乙酸：称取10 .00 g三氯乙酸,加水90.00 g，混匀即可。10) 0.1%三氯化铁：称取0.10 g三氯化铁,加水99.90 g，混匀即可。（实验所用水均为蒸馏水）3 试验方法3.1 清除羟自由基的能力测定用移液枪准确量取0.5 mL不同浓度的VcSeNPs于试管中，先后加入0.5 mL 9 mmol/L FeSO4和0.5 mL 8.8 mmol/L过氧化氢，轻轻振荡混合后放置10 min，最后每只试管分别加入0.5 mL 9 mmol/L水杨酸，轻轻振荡混合后放置30 min，在510 nm处测吸光度Ai。将水杨酸替换为蒸馏水测其吸光度Aj，0.5 mL的蒸馏水为参比做对照，测其吸光度A0。每组重复测量三次，取其平均值。用Vc溶液做阳性对照。羟自由基清除率E的计算公式为： E =A0 -（Ai-Aj）/A03.2 清除超氧阴离子自由基的能力测定用移液枪准确量取0.9 mL 50 mmol/L pH = 8.2的Tris-HCl缓冲液、0.4 mL蒸馏水于试管中，25水浴中反应20 min，然后用移液枪分别量取0.4 mL不同浓度的VcSeNPs、0.1 mL 5 mmol/L邻苯三酚于每支试管中，用手轻轻振荡使其均匀混合,在25水浴中反应6 min，迅速移取0.2 mL 10 mmol/L盐酸结束反应，在320 nm处测其吸光值Ai，将邻苯三酚替换为蒸馏水测其吸光度Aj，0.4 mL蒸馏水为参比做对照，测其吸光度A0。每组重复测量三次，取其平均值。Vc溶液做对照。超氧阴离子自由基清除率S的计算公式为：S =A0 -（Ai-Aj）/A03.3 清除DPPH自由基的能力测定用移液枪准确量取1.0 mL不同浓度的VcSeNPs和0.1 mmol/L的DPPH溶液1.0 mL于试管中轻轻振荡使其混合均匀，避光条件下反应20 min，在517 nm处测其吸光度Ai，将DPPH替换为无水乙醇，测吸光度Aj；以蒸馏水为参比做对照，测其吸光度A0。每组重复测量三次，取其平均值。用Vc溶液做阳性对照。计算清除率I：I =A0 -（Ai-Aj）/A03.4 还原能力的测定用移液枪准确量取1.0 mL不同浓度的VcSeNPs，并分别移取1.25 mL的pH = 6.60.2 mol/L磷酸盐缓冲液和1%的铁氰化钾溶液于离心管中，轻轻振荡混合后，在50水浴中反应20 min，迅速降至室温，移取10%的三氯乙酸1.0 mL于每支离心管中 ，3000 r/min的速度下离心10 min。移取0.5 mL上清液，并分别移取1.75 mL蒸馏水和0.25 mL 0.1%的三氯化铁溶液于试管中，振荡混合后，在700 nm处测其吸光值Ai。用Vc溶液做阳性对照。4 结果与讨论4.1 清除羟自由基的能力测定据前人研究，OH具有较强的氧化性，基本上可以和全部细胞成分发生反应，且反应速率很快。硫酸亚铁与过氧化氢能够反应形成羟自由基，而水杨酸的加入将会使其生成有色物质，在510 nm处有最大吸收。抗氧化剂添加后将与水杨酸争夺羟自由基，淡化其颜色或使其消失，以此判定其对羟自由基的清除能力。样品液VcSeNPs和VC对OH的清除率如图1所示：在浓度范围之内样品液和VC对羟自由基的清除率随浓度的增大而增加；0.6 mg/mL浓度下，VC对OH的最大清除率接近85%；样品对OH的清除率略低于VC，清除率为78.44%。图1 VC和VcSeNPs对OH清除率的比较Fig.1 Comparison of VC and VcSeNPs forOH Scavenging4.2 超氧阴离子清除能力的测定邻苯三酚在Tris-HCl缓冲液（pH=8.2）中会发生自氧化反应，期间伴有O2-和有色的中间产物，该有色的中间产物在320 nm处有特征吸收。加入自由基清除剂即可阻抑产生中间产物和超氧阴离子，以此淡化颜色，减小吸光度。因此能够通过吸光度的变化，判定对O2-自由基的清除能力。VcSeNPs和VC对超氧阴离子自由基的清除率如图2所示：在0.1-0.3 mg/mL浓度范围内，VC对O2-的清除率随着浓度的增大迅速增大，之后随着浓度的增大略有增大但变化不大；而样品溶液对O2-的清除率在0.1-0.6 mg/mL范围内随浓度的增加而增加，最高可达96.78%。样品对O2-的清除率均低于同浓度下VC对O2-的清除率。图2 VC和VcSeNPs对O2-清除率的比较Fig.2 Comparison of VC and VcSeNPs for O2-Clearance4.3 清除DPPH自由基能力的测定DPPH自由基结构中的单电子，在乙醇中显现深紫色，是一种稳定的含氮自由基，在517 nm处有特征吸收。抗氧化剂的加入，可使其氢与DPPH结合，导致颜色产生变化，吸光度也相应的发生变化，以此评价对DPPH自由基的清除能力。VcSeNPs和VC对DPPH自由基的清除率如图3所示：VC对DPPH自由基清除作用较强。在0.001-0.004 mg/mL浓度内，VC对DPPH的清除率迅速增加，之后随着浓度的增加基本上无太大变化；而样品的清除率在试验浓度范围内随着浓度的增大而增大，呈量效关系，清除率最高可达56.91%，且清除率均低于同浓度下VC对DPPH自由基的清除率。 图3 VC和VcSeNPs对DPPH自由基清除率的比较Fig.3 Comparison of DPPH Free Radical Scavenging Rate with VC and VcSeNPs4.4 还原能力的测定 还原性物质将铁氰化钾还原，产生亚铁氰化钾；酸性环境中，Fe3+ 可以和亚铁氰化钾发生反应，形成普鲁士蓝，并在700 nm处有特征吸收，吸光值随着浓度的增大而增大。VcSeNPs和VC具有还原性，Fe3+被还原为Fe2+，减小了普鲁士蓝的浓度。还原力随着吸光值的增大而增强，而抗氧化性随着还原力的增强而增强。VcSeNPs和VC的还原能力如图4所示：在浓度0.1-0.3 mg/mL范围内，VC的吸光度明显大于样品的吸光度；但继续增大浓度，VC的吸光度略小于样品的吸光度。图4 VC和VcSeNPs的还原能力的比较Fig.4 Comparison of reduction capabilities with VC and VcSeNPs5 结论通过测定VcSeNPs的还原能力以及清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子的能力，评价其抗氧化活性。VcSeNPs对自由基的清除率及还原力均随浓度的增加而增加。其中，VcSeNPs对自由基清除率与Vc相近，而浓度超过0.4 mg/mL时，其还原力略大于Vc。试验结果表明， VcSeNPs具有抗氧化作用。参考文献1.非凡的、必需的和谜一般的纳米硒：与纳米硒第一发明人张劲松博士的对话J. 医药世界,2004,10:20-23.2林根. 陈君石:“纳米硒在世界上是独一无二的”J. 医药世界,2004,10:12-14.3杨梦涛. 纳米硒牡蛎多糖的制备及其抗氧化活性研究D.中国海洋大学,2014.4李彩霞，李复兴，李鹏，等.国槐叶黄酮的抗氧化活性研究J.天然产物研究与开发，2013, 05: 676-680,683.5杨润亚，明永飞，王慧.无花果叶中总黄酮的提取及其抗氧化活性测定J.食品科学，2010, 16: 78-826南海娟，莫海珍，颜振敏，等. 槲树叶黄酮的抗氧化特性研究J. 中国食品添加剂，2013, 02: 83-877顾采琴，张织芬，朱冬雪，等.香蕉果皮黄酮抗氧化活性研究J.广州大学学报(自然科学版)，2013, 03: 12-168Zoran Maksimovie, Dorde Maleneie, Nada Kovacevie. Polyphenol content and antioxidant activity of Maydis stigma extraersJ. Bioresourse Technology, 2005, 96：873-877.9 BekiasTe Pe