沉默谷胱甘肽S转移酶mu5对人支气管上皮细胞炎症氧化的调节作用研究

沉默谷胱甘肽S转移酶mu5对人支气管上皮细胞炎症氧化的调节作用研究【摘要】 目的 建立肿瘤坏死因子（TNF-）诱导支气管上皮（16HBE）细胞炎症模型，探讨谷胱甘肽S转移酶mu5（GSTM5）在炎症诱导的氧化应激损伤中的作用。方法 以TNF-（10 ng/mL）刺激16HBE细胞，利用GSTM5真核表达载体、RNAi干扰技术过表达或沉默GSTM5，比色法检测细胞内丙二醛（MDA）及总抗氧化能力（T-AOC）；MTT法检测细胞存活率；ELISA法检测白介素-1b、白介素-6、白介素-10、INF-y浓度，结果 沉默GSTM5基因可促进TNF-诱导的细胞内MDA的增高（P0.05），显著减弱T-AOC能力（P0.05），减少16HBE细胞存活率（P0.05），细胞上清液中白介素-1b、白介素-6、白介素-10、INF-y浓度均较TNF-组升高（P0.05），差异有统计学意义。过表达GSTM5起到相反作用。结论 GSTM5表达对炎症诱发的肺上皮细胞的氧化应激损伤有保护作用。 【关键词】 谷胱甘肽S转移酶mu 5；真核细胞表达载体；RNA干扰；炎症；氧化前言急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一个具有复杂病理和发病机制的危重症临床综合征, ARDS 的年发病率3 /10 万人 65 /10 万人不等，病死率为10% 90%1。其本质是肺部过度失控的炎症反应2。过度炎症反应引发氧化应激状态，诱导细胞内源性活性氧（ROS）的生成量剧增，超过机体抗氧化系统的清除能力时，使机体处于持续的氧化应激状态，导致肺结构细胞损伤3，并与过度激活的炎症反应协同加重病情4。谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase，GST）与谷胱甘肽结合，具有多种功能的催化氧化还原反应的酶超家族，与其他抗氧化酶在细胞内共同起到清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤的作用5。GST家族有7个成员：alpha,mu, pi, sigma, theta, omega, and zeta6。谷胱甘肽S转移酶mu 5（GSTM5）是GST家族的成员，关于GSTM5在ARDS时炎症诱发的氧化应激中的作用研究不多7。本研究以代表性的炎症因子肿瘤坏死因子（TNF-）刺激人支气管上皮细胞，在细胞上模拟ARDS时的炎症过程，并观察其炎症水平的变化；同时，利用真核细胞表达载体、siRNA技术增强或减弱人支气管上皮16HBE细胞的GSTM5基因表达，探讨该基因在TNF-诱导的人支气管上皮细胞氧化损伤中的作用及其对该细胞炎症模型的炎症因子水平的影响，为ALI综合治疗提供实验依据。材料与方法1. 材料16HBE细胞由广州军区总医院医学实验科细胞库提供；北美胎牛血清购于广州博仁生物科技有限公司；DMEM高糖培养基、胰酶购于Hyclone公司；重组人TNF-购自美国Pepro Tech公司；GSTM5-GV230-GFP质粒由上海吉凯基因技术有限公司构建；转染试剂Lipofectamine2000TM购自Invitrogen公司； 白介素-1b、白介素-6、白介素-10、INF-y，ELISA试剂盒购自博士德公司。总抗氧化能力（T-AOC）活性检测试剂盒及脂质氧化丙二醛（MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA法蛋白浓度测定试剂盒、MTT试剂盒购自江苏碧云天公司；逆转录试剂购自TaKaRa公司；PCR试剂购自北京康为世纪公司；引物由上海英潍捷基公司合成；NADPH氧化酶（NOX）家族NOX1和NOX2抗体购自美国abcam公司；-actin抗体购自武汉博士德公司。2. 方法2.1 细胞培养：16HBE细胞在含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 、5% CO2、饱和湿度条件下的培养箱中培养，23 d传代1次，取处于对数生长期的细胞用于实验。2.2 模型构建及实验分组：将细胞以2105个/mL接种于6孔板，待贴壁细胞融合度达到70%更换为含GSTM5-GV230-GFP质粒脂质体（1 g/mL）的无血清、无抗生素培养基培养6 h后，更换为完全培养基，待细胞状态恢复良好后更换为含TNF-（10 ng/mL）的无血清、无抗生素培养基继续培养，24 h后分别收取培养细胞及细胞上清液标本备检。实验分为6组：空白对照组（不加干预因素），TNF-组（仅用TNF-刺激），siGSTM5组和阴性对照组分别转染GSTM5的siRNA和阴性对照siRNA，GSTM5质粒组（预转染GSTM5-GV230-GFP质粒且用TNF-刺激），阴性对照组（预转染空质粒且用TNF-刺激）。2.3 分光光度法检测细胞脂质氧化程度（MDA含量）：采用玻璃匀浆器匀浆裂解细胞，BCA法定量蛋白浓度，按试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪于532 nm测定各样本吸光度，测得各样本的MDA含量后，除以样本的总蛋白含量，即“nmol/mg pro”来表示MDA水平。2.4 分光光度法检测细胞T-AOC：采用玻璃匀浆器匀浆裂解细胞，BCA法定量蛋白浓度，按试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪于520 nm测定各样本吸光度，测得各个样本T-AOC后，再除以样本的总蛋白含量，即“U/mg pro”来表示T-AOC水平。2.5 MTT比色法检测细胞存活率：将细胞以1104个/mL接种于96孔板，按上述分组进行转染和TNF-干预后继续培养24 h，终止培养前4 h每孔加入10 L MTT溶液（5 mg/mL），终止培养时加入100 L Formazan溶解液，待紫色结晶完全溶解，酶标仪测定各孔吸光度（A）值（570 nm）。细胞存活率=实验组/对照组100%。2.6 ELISA法检测细胞上清炎症因子浓度取收集细胞上清，室温1000rpm离心10min后再次取上清，按照ELISA说明书步骤检测各组细胞上清液中白介素-1b、白介素-6、白介素-10、INF-y浓度，重复检测4次，取平均值。3 统计学处理应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以meanSD表示。数据均进行方差齐性检验，组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齐时多重比较采用LSD检验法，方差不齐时多重比较采用Dunnetts T3检验法，P0.05为差异有统计学意义。结 果1. 细胞脂质氧化程度TNF-组16HBE细胞MDA水平较空白对照组显著上调（1.970.26）nmol/mg pro比（0.940.17）nmol/mg pro，P0.05）。GSTM5质粒组MDA水平较TNF- 组和阴性对照组显著下调（1.530.15）nmol/mg pro比（1.97 0.26）nmol/mg pro和（2.080.07）nmol/mg pro，P0.05，仍高于空白对照组（1.530.15）nmol/mg pro比（0.940.17）nmol/mg pro，P0.05。siGSTM5组MDA 水平较空白对照组、TNF-组和阴性对照组明显上调 (3.960.32)nmol/mg pro比（0.940.17）nmol/mg pro、（1.970.26）nmol/mg pro和（2.080.07）nmol/mg pro，P0.05。结果见图1。2. 细胞内总抗氧化能力TNF-组T-AOC较空白对照组降低（1.300.14）U/mg pro比（1.930.29）U/mg pro，P0.05）。GSTM5质粒组T-AOC较空白对照组、TNF-组和阴性对照组显著上调（3.780.42）U/mg pro比（1.930.29）U/mg、（1.300.14）U/mg pro和（1.280.21）U/mg pro，P0.05。siGSTM5组T-AOC较空白对照组、TNF-组和阴性对照组明显下调 (0.930.1 4)U/mg pro 比（1.930.29）U/mg pro、（1.300.14）U/mg pro和（1.280.21）U/mg pro，P0.05 。结果见图1。3. 细胞存活率测定TNF-组细胞存活率较空白对照组显著下调（56.31%4.33%比99.20%3.79%，P0.05）。GSTM5质粒组细胞存活率较TNF-组和阴性对照组显著升高（69.15%9.23%比56.31%4.33%和56.10%5.22%，P0.05），较空白对照组仍有明显降低（69.15%9.23%比99.20%3.79%，P0.05）。siGSTM5组细胞存活率较空白对照组、TNF-组和阴性对照组降低（39.91% 3.43%比99.20%3.79%、56.31%4.33%和56.10%5.22%，P0.05）。结果见图2。4. 细胞上清炎症因子测定TNF-组细胞炎症因子较空白对照组显著升高，与阴性对照组差异无统计学意义。GSTM5质粒组细胞炎症因子较TNF-组和阴性对照组显著降低，较空白对照组仍有明显降低。siGSTM5组细胞存活率较空白对照组、TNF-组和阴性对照组降低（39.91% 3.43%比99.20%3.79%、56.31%4.33%和56.10%5.22%，P0.05）。结果见图3。讨 论ARDS的主要病理生理事件包括中性粒细胞激活，ROS爆发，肺动脉高压，渗出性肺水肿及其他相关器官功能障碍8。病人的生存受免疫-炎症信号通路的调节，而炎症过程中转录因子调节及ROS来源有着重要地位，例如NF-kb、NADPH氧化酶9。多项研究结果表明TNF- 是介导ARDS的早期细胞因子之一，亦 是细胞因子网络级联反应的启动因子10。本实验室前期研究发现：TNF- 刺激A549 细胞可在基因水平上调NF-B p65 的表达，并增加NF-B 蛋白的核转位，沉默NF-B p65 基因下调TNF- 诱导的肺泡上皮细胞的炎症反应11。这说明使用TNF- 刺激 16HBE可激活NF-B，而NF-B是多种炎症、氧化因子的转录因子，是炎症反应的核心，建立肺泡上皮细胞急性炎症模型成功。前炎症因子可使NADPH氧化酶活化，ROS过度产生，进而引起ARDS、哮喘、囊性纤维化、COPD的发生9。NOX1是NADPH氧化酶家族的主要成员，TNF-刺激16hbe细胞后NOX1转录及表达明显上调12。本研究小组前期对炎症诱发的氧化应激调控的研究发现，GSTM5与NOX1启动子间存在着相互作用13，这引起了我们对GSTM5的关注。后续的研究发现增强 GSTM5 表达对炎症诱发的人支气管上皮细胞氧化应激损伤有保护性调节作用，其机制与下调 NOX1、NOX2 基因表达密切相关12。以上研究说明炎症刺激- TNF-NF-kb- NADPH氧化酶-ROS可能ARDS发生发展的是重要线索，而GSTM5可下调NOX1、NOX2表达，起到减轻ARDS作用。氧化应激时体内高活性分子如ROS产生过多，造成肺结构细胞氧化损伤，加重ARDS14。MDA是自由基作用于脂质发生过氧化反应的最终代谢产物，其浓度可反映自由基对组织细胞的损伤程度15。T-AOC是一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平，其水平反映了体系总抗氧化能力。本实验室前期研究结果显示，单纯以TNF-刺激16HBE细胞，MDA浓度较空白对照组明显升高（P0.05），T-AOC能力降低（P0.05），且细胞存活率下降（P0.05）。这说明TNF-在其诱导的细胞炎症过程中诱发了氧化应激反应和细胞的氧化损伤。GSTM5质粒转染组的MDA浓度较TNF-组降低（P0.05），T-AOC能力显著增高（P0.05），细胞存活率回升（P0.05）。本研究补充了siRNA干扰GSTM5，这提示减弱GSTM5表达可有效增强炎症反应诱发的氧化应激，加重肺结构细胞的损伤，GSTM5具有保护性的调控作用。引起ARDS 的炎症介质主要包括促炎因子 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12 、TNF- 和 干扰素( -IFN) ，以及抗炎因子 IL-4、IL-10、IL-13、转化生长因子-和粒细胞噬细胞集落刺激因子，这些炎症介质构成了ARDS炎症反应和免疫调节的基础16-18，在临床工作中，只有极少数的生物标记物可用于ARDS的诊断、预后、治疗反应的评估，部分研究发现ARDS患者肺泡灌洗液中TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 升高，其中治愈患者升高程度高于死亡患者19。本研究通过构建 GSTM5 真核表达载体、siRNA并转染 16HBE 细胞，TNF- 刺激 16HBE 建立细胞急性肺损伤模型，选取促炎抗炎因子的典型代表-IFN, IL-1, IL-6, IL-10，发现TNF-刺激使细胞炎症因子上调，与上述结果吻合，即GSTM5过表达可减少其促炎作用，干扰GSTM5表达可增加其促炎作用。综上所述，siGSTM5沉默GSTM5表达后，使细胞内的总抗氧化能力减弱，代表氧化应激损伤的MDA水平上升，支气管上皮细胞的生存率下降，炎症因子水平升高。而当GSTM5质粒增强GSTM5表达后，肺组织结构细胞生存率回升， MDA水平下降，总抗氧化能力明显升高，炎症因子水平降低。上述研究结果从正反两个角度证明了GSTM5可有效下调炎症反应诱发的氧化应激，减轻肺结构细胞的损伤，起到保护性的调节作用。炎症反应是肺结构细胞破坏的重要因素，其与氧化应激互为因果，相互促进，促进ARDS的发生发展。GSTM5 具有抗氧化能力，对炎症诱发的支气管上皮细胞的氧化应激损伤有保护作用。此研究为 ARDS的综合治疗提供了有益的启示。参考文献 1 Ranieri V M, Rubenfeld G D, Thompson B T, et al. 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