防止蛀牙產品開發

開發防止蛀牙產品,蛀牙的元兇與形成原因 Streptococcus mutans 齟齒(轉糖)鏈球菌 利用葡萄糖傳遞酵素分解蔗糖 合成黏性 a-1,3-葡萄聚醣 吸引許多菌株共同形成牙菌斑 菌株分泌酸性物質侵蝕牙齒造成蛀牙 預防之道: 干擾或抑制 牙菌斑的形成,防治對象 Streptococcus mutans 齟齒(轉糖)鏈球菌,不同策略可能的執行方案與可能遭遇的困難 抗生素治療 此細菌非生長於微血管可到達之組織或器官，口服或注射抗生素可以無法直接接觸到菌體 製成口含錠的抗生素？ 具有a-1,3-葡萄聚醣保護菌體，抗生素不易達到抑菌效果 抗體中和 抗體專一性與菌體結合，透過吞嚥或飲食將菌體帶離口腔 以細胞外何種蛋白質製成抗體？ 抗體結合力足夠帶離菌體嗎？,抑制a-1,3-葡萄聚醣生合成 a-1,3-葡萄聚醣生合成機轉 參與合成的酵素：葡萄糖傳遞酵素 利用此酵素分解蔗糖轉化成葡萄糖 研發葡萄糖傳遞酵素抑制劑 如何篩選抑制劑（篩選方法的建立） 選殖葡萄糖傳遞酵素基因 建立表達系統、純化酵素 酵素活性分析方法的建立 酵素活性抑制效率的評估 選擇何種抑制物做測試？ 抑制物安全性評估 減少蔗糖的供給（提供木聚糖取代蔗糖）,葡萄聚醣(葡聚醣)(聚葡萄糖) 葡萄糖單體以不同鍵結所形成聚醣,a-1,3-葡萄聚醣水解酵素水解a-1,3-葡萄聚醣,葡萄聚醣水解酵素水解之葡萄聚醣鍵結不同區分為 b-1,3-glucanase (EC 9 (58) 真菌、某些藻類、 少數細菌 a-1,3-glucanase (EC 3.2.1. - ) 少數真菌、少數細菌 b-1,6-glucanase (EC 5) 真菌 b-1,4-glucanase (cellulase) (EC ) 植物 b-1,3-1,4-glucanase (EC (73) 大麥殼,如何篩選a-1,3-葡萄聚醣水解酵素?,篩選可分解a-1,3-葡萄聚醣的菌株 a-1,3-葡萄聚醣來源？ Aspergillus niger 黑麴菌細胞壁 以葡萄糖傳遞酵素合成 a-1,3-葡萄聚醣 篩選在培養皿可形成澄清環菌落（？） Enrichment medium 純化a-1,3-葡萄聚醣水解酵素 酵素生化特性分析、生物活性分析,圖: 標準菌株Bacillus circulans WL-12之b-1,3-葡萄聚醣水解酵素 基因選殖於大腸桿菌中在活性培養基的表現,a-1,3-葡萄聚醣水解酵素基因選殖 建構基因庫 培養皿篩選可形成澄清環基因轉形株(?) DNA定序確認 構築酵素大量表現質體 純化a-1,3-葡萄聚醣水解酵素 酵素生化特性分析、生物活性分析,a-1,3-葡萄聚醣水解酵素 N端定序（？）（以蛋白酶水解成多片段做N端定序） 純化蛋白質送MALDI-TOF Mass or Tandem Mass 設計degenernal primers 構築酵素大量表現質體 純化a-1,3-葡萄聚醣水解酵素 酵素生化特性分析、生物活性分析,質譜術 質譜儀,化學分子離子化 帶電荷 外加電場(動能) 真空管中飛行 撞擊偵測標靶產生訊號 (質量愈大飛行速度越慢),飛行時間質譜儀 MALDI-TOF MS,Tandem Mass 串連（陣列）質譜儀,分析蛋白質種類的方法 二維電泳 胰蛋白酶切 質譜儀分析 資料庫比對 利用氣體分子撞擊胺基酸片段 研究蛋白質體學的新興技術 成本高 普及率低,遺傳密碼,N A, T, C, G V A, G, C H A, T, C D A, T, G, B T, G, C W A, T R A, G M A, C K T, G Y T, C S G, C,混合核酸對照表,實作練習 N端定序序列為 M T L S S G K S N R 請寫所設計之primers序列 另一股 primer? PCR產物不是全長open reading frame Eukaryote: 5, 3 Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) Prokaryote ?,/,mRNA separation method,Synthesis cDNA,Cloning full-length cDNA molecular,Cosmid Combine plasmid and bacteriophage Contain Cos (cohesive) sites,Reference: /dana/250/25003_10.html,已有純化酵素如何選殖對應基因 真核生物：蛋白質水解成小片段，選兩段做N端定序，設計非一般性引子，PCR出某大小片段，產物定序確認，再用RACE技術從mRNA基因庫找出5端和3端 原核生物（細菌） 基因庫的建立 Colony hybridization 探針？可與真核生物相同策略，以PCR產物當探針 Reverse PCR ? /,篩到基因的機率(原核生物) 公式：N = ln (1 -P) / ln (1 F/T) P is the desired probability (0.99) F is the fractional proportion of the genome in a single recombinant (5 kb) T genome size (5000 kb) N is the necessary number of recombinants N = ln (1-0.99) / ln (1 5/5000) = ln 0.01 / ln 0.999 = -4.6 / - 0.001 = 4600,若沒有全長基因如何解決？ 5端、3端RACE （X） 以現有基因序列設計一探針 篩選基因庫 （bacteriophage construct） Reverse PCR 限制酶完全水解基因體 割膠回收DNA片段 （切割成不同片段） 自接self-ligation 使其形成circle DNA 以反向P