免疫防龋课件.ppt

免疫防龋,概述 免疫防龋-主动免疫 免疫防龋-被动免疫 小结,目录,概述,防龋疫苗免疫途径的研究也是十分重要的，包括主动免疫和被动免疫。 主动免疫防龋是将防龋疫苗经过一定的途径接种到机体，诱导产生特异性抗体。 被动免疫防龋是指将特异性抗体作用于局部，达到预防龋病的目的。,概述,感染性疾病可以采取免疫学的方法来控制，龋病也不例外。 免疫防龋的研究主要集中在疫苗的研究。防龋疫苗类型包括灭活死疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗、多肽疫苗和抗独特型抗体疫苗等。 最新的研究主要针对变形链球菌葡糖基转移酶（gtf）和表面蛋白抗原（pac，ag i/ii）研制dna防龋疫苗。这些疫苗已用于动物实验，严格的说尚未进入i期临床实验。,免疫防龋主动免疫,dna免疫,嵌合（融合）免疫,基因重组免疫,基因工程重组疫苗是将选定的免疫性抗原蛋白或抗原决定簇的基因编码片段引入细菌、酵母或能连续转化的哺乳动物细胞的基因中，然后以基因工程技术生产大量抗原，从而可用以制备只含有免疫原性的纯化疫苗。,基因重组免疫,gtf-sb区与ctb基因工程重组疫苗,ag i/ii 与cta2b基因工程重组疫苗,ag i/ii a区与gtfs基因工程重组疫苗,1,2,3,转基因疫苗,4,基因重组免疫,1.ag i/ii a区与gtfs基因工程重组疫苗,gtfs是由1500个氨基酸组成的具有高度同源序列的蛋白质，其n端为蔗糖结合区（sucrose binding，sb），c端为葡聚糖结合区（glucan binding，gb）。sb和gb分别负责蔗糖水解和葡聚糖合成。 ag i/ii包括两个重复氨基酸序列，一个位于n端，富含丙氨酸，称a区，又称唾液成分结合区（saliva binding region，sbr）；一个位于c端，富含脯氨酸。 学者们用基因重组方法获得变异链球菌表面蛋白（ag i/ii ）的a区与gtf的sb区或gb区嵌合的抗原蛋白，用得到的表达产物免疫兔。,基因重组免疫,基因重组免疫,ag i/ii a区与gtfs基因工程重组疫苗,得到的表达产物免疫兔后发现： 用ag i/ii a区-gb免疫产生的igg既能抑制葡聚糖的合成，又能抑制变异链球菌对唾液包被的羟基磷灰石的非蔗糖依赖型粘附。 而用ag i/ii a区-sb免疫产生的抗体不能抑制葡聚糖的合成，只能抑制非蔗糖依赖型粘附。 推测可能是抗ag i/ii a-sb的抗体不能进入结合gtfs的催化区，或该抗体不能识别gtfs的构象。,基因重组免疫,2.gtf-sb区与ctb基因工程重组疫苗,霍乱毒素（ct）由a亚单位和b亚单位构成，其中a亚单位由两段肽构成，a1为毒性亚单位，a2在a1和b之间起桥梁联接作用。b亚单位与哺乳动物细胞膜成分gm1神经节苷脂有强亲和力，是其作为黏膜免疫佐剂的结构基础。 laloi等将gtf-sb区与ctb基因重组，并用得到的表达产物免疫兔。,基因重组免疫,基因重组免疫,gtf-sb区与ctb基因工程重组疫苗,获得表达产物免疫兔后，产生了既抗gtfs，又抗ctb的抗血清，且抗血清能抑制50%的gtfs的酶活性。,基因重组免疫,3.ag i/ii 与cta2b基因工程重组疫苗,hajishengallis等将编码变异链球菌ag i/ii唾液结合区（sucrose binding region，sbr）的基因与编码霍乱毒素a2b亚单位的基因嵌合。 表达产物经elisa检测，既有结合gm1神经节苷脂的能力，又保留了sbr的抗原性。 经口免疫小鼠，诱导出高滴度的抗ag i/ii的siga和血清iga，且持续3-6个月。,基因重组免疫,基因重组免疫,4.转基因疫苗,采用基因工程技术，将致龋菌的dna移植到番茄中去，在番茄的植物组织中合成疫苗病原的抗原蛋白，使番茄成为防龋疫苗。即只要吃了这种转基因番茄，人体就会产生免疫反应，达到防龋目的。 郑雨燕等研究获得了含编码变异链球菌表面蛋白（ag i/ii ）基因唾液粘附区片段（sbr）的转基因番茄植株，对balb/c小鼠进行转基因番茄的口服及腹膜下注射免疫，酶联免疫吸附试验（elisa）检测血清中特异性抗pac igg抗体。结果显示：口服和腹膜下注射转基因番茄的小鼠血清中均出现了抗pac igg抗体，且两组血清抗体水平差异无统计学意义。,基因重组免疫,转基因疫苗变异链球菌表面抗原基因的重组乳链球 菌的口腔免疫研究。,乳链球菌长期用于生产酸奶制品和奶酪等乳制品，已被广大人群频繁摄入体内。从安全性考虑，乳链球菌可作为重组疫苗最合适的微生物之一。为使外源性基因在乳链球菌中稳定地维持和表达，已构建了几种大肠杆菌、乳链球菌穿梭载体。 masaaki等将变异链球菌mt8 148的基因链接至穿梭质粒载体psa 3上，然后成功的转化至乳链球菌il1 403，获得一种携带变异链球菌190kda的表面蛋白抗原pac的结构基因的乳链球菌重组菌株。将这个重组疫苗经口腔免疫鼠，诱导产生了对pac免疫反应的特异性siga和血清igg。,基因重组免疫,基因重组免疫,基因疫苗是将外源抗原基因经载体直接导入宿主细胞内，以诱导宿主免疫系统对抗原基因所表达的抗原蛋白发生免疫应答，达到预防和治疗疾病的目的。 特点： 疫苗制作简便，只需对编码抗原基因进行设计和克隆，省去了在体外表达和蛋白纯化的繁琐过程； 核酸接种后，抗原在细胞内的表达与病原体自然感染过程相似，能够使抗原以天然构象呈递给宿主免疫系统； 能够持续诱导有效的体液和细胞免疫应答。,dna免疫,运用基因工程技术，多种针对变异链球菌表面毒力因子的dna疫苗已被构建起来。 樊明文等构建了针对变异链球菌pac蛋白a区和p区的防龋dna疫苗pcia-p，同时构建了针对变异链球菌gtf-i和pac蛋白a区p区的融合防龋dna疫苗pglua-p，经体外转染和体内接种实验证明，pcia-p和pglua-p均可在真核细胞中表达正确的抗原，诱导机体免疫应答，并用免疫定菌鼠证明该疫苗可以有效防龋，防龋效果后者优于前者。,dna免疫,han等将携带编码变异链球菌细胞壁相关蛋白a基因与质粒pcdna3.1/v5/his-topo构建防龋dna疫苗。 杨锦波等构建了针对gtf的质粒pcdna3-gtfb，并经动物实验证明有较好的免疫原性。 姜广水等通过t-a克隆技术成功构建出含免疫刺激序列cpg基序的抗pac中唾液蛋白结合区段（sbr）的抗sbr dna疫苗pcdna3.-sbr。,dna免疫,嵌合体疫苗是指两个及两个以上的抗原蛋白通过化学共价键结合，或间接通过基因工程方法获得嵌合抗原蛋白，以及运用含有嵌合基因的真核表达质粒直接免疫，诱发机体产生针对多种抗原的保护性免疫。,变异链球菌表面蛋白与霍乱毒素b亚单位嵌合疫苗 嵌合基因疫苗,嵌合（融合）免疫,变异链球菌表面蛋白与霍乱毒素b亚单位嵌合疫苗,近年来研究发现，变异链球菌表面蛋白（ag i/ii ）与霍乱毒素b亚单位（cholera toxin b subunit，ctb）嵌合疫苗有明显的防龋效果。ctb具很强的黏膜免疫增强作用，不少学者将ag i/ii 与ctb化学偶联，以此嵌合体免疫动物，获得了明显的防龋效果。,嵌合（融合）免疫,变异链球菌表面蛋白与霍乱毒素b亚单位嵌合疫苗,采用ag i/ii与ctb化学偶联的方法是ctb和ag i/ii分别与n-succinimidy1-（3-2-pyridy1-dithio）propionate（spdp）结合，形成ctb-spdp，ag i/ii-spdp，在室温又与二硫苏糖醇混合，再经还原和平衡后，获得的ag i/ii溶液与等摩尔的ctb-spdp混合，最后经透析得到ag i/ii-ctb嵌合蛋白。通过elisa证实嵌合体结合gm1神经节苷脂的能力及ag i/ii的免疫活性。,嵌合（融合）免疫,嵌合（融合）免疫,变异链球菌表面蛋白与霍乱毒素b亚单位嵌合疫苗,katz等用相同方法获得的ag i/ii-ctb经鼻腔免疫fischer鼠，与经口感染变异链球菌的相同鼠为对照，经elisa测定，免疫组抗ag i/ii的siga为对照组的4倍，且免疫组小鼠下颌牙菌斑中的变异链球菌和龋均明显低于对照组。 同样russell用ag i/ii-ctb经口免疫大鼠，经2-3次免疫，大鼠产生抗ag i/ii的siga，至5-6个月时仍能用elisa检测出siga。,嵌合（融合）免疫,嵌合基因疫苗,将多种编码抗原蛋白的基因通过基因重组技术，构建嵌合真核表达质粒，直接导入动物细胞，诱导保护性免疫。 基因疫苗接种后，抗原在细胞内的表达与病原体自然感染过程相似，能以更天然的构象递呈。 变异链球菌作为重要致龋菌，其主要毒力因子ag i/ii和gtfs的基因spap和gtfs已被成功克隆，核苷酸和氨基酸序列已基本清楚，对蛋白质分子中各功能区及相互作用的了解日益完善，以及对抗原表位筛选的成功，为研制防龋嵌合基因疫苗提供了依据。,嵌合（融合）免疫,免疫防龋被动免疫,被动免疫是直接应用特异性抗体以中和及对抗特异性致病菌的致病作用。由于可能避免主动免疫某些不能预料的副作用，如不会激发系统免疫反应，不会像系统运用防龋疫苗那样引起心脏交叉反应,因此易为人们所接受并日益受到关注。 边专等利用变异链球菌gtfs的灭活高表达株肌注免疫奶牛，收集牛乳，经间接elisa检测，牛乳中特异性变异链球菌抗体igg明显升高，认为变异链球菌gtfs高表达株可以诱导奶牛分泌高效价的抗变异链球菌特异igg，且牛乳中的igg经巴氏消毒，免疫活性无明显变化。,多克隆抗体和单克隆抗体,从80 年代末至今，已有大量研究资料证实运用多克隆抗体(简称多抗)和单克隆抗体(简称单抗)被动免疫防龋的有效性。 michalek 等首先尝试了用牛奶中的多抗免疫防龋研究。用变链菌4种血清型全菌抗原免疫奶牛，将获得含特异性抗变链菌抗体的牛奶喂养定菌鼠，结果显示，实验组动物变链菌粘附水平、菌斑指数及龋齿活性均显著性降低。 樊明文等研究也证实, 抗茸毛链球菌表面蛋白pag 的单抗能显著性抑制定菌大鼠口内