葡萄糖测定-葡萄糖氧化酶法.docx

葡萄糖氧化酶法测定血清（浆）葡萄糖【原理】葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase ， GOD) 利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。过氧化物酶 (peroxidase ， POD) 在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原性氧受体 4- 氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即 Trinder 反应。红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。【试剂】1 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH7.0) 称取无水磷酸氢二钠 8.67g 及无水磷酸二氢钾 5.3g 溶于蒸馏水 800ml 中，用 1mol/L 氢氧化钠 ( 或 1mol/L 盐酸 ) 调 pH 至 7.0 ，用蒸馏水定容至 1L 。2 酶试剂 称取过氧化物酶 1 200U ，葡萄糖氧化酶 1 200U ， 4- 氨基安替比林 10mg ，叠氮钠 100mg ，溶于磷酸盐缓冲液 80ml 中，用 1 mol/L NaOH 调 pH 至 7.0 ，用磷酸盐缓冲液定容至 100ml ，置 4 保存，可稳定 3 个月。3 酚溶液 称取重蒸馏酚 100mg 溶于蒸馏水 100ml 中，用棕色瓶贮存。4 酶酚混合试剂 酶试剂及酚溶液等量混合， 4 可以存放 1 个月。5 12mmol/L 苯甲酸溶液 溶解苯甲酸 1.4g 于蒸馏水约 800ml 中，加温助溶，冷却后加蒸馏水定容至 l L 。6 100mmol/L 葡萄糖标准贮存液 称取已干燥恒重的无水葡萄糖 1.802g ，溶于 12mmol/L 苯甲酸溶液约 70ml 中，以 12mmol/L 苯甲酸溶液定容至 100ml 。 2h 以后方可使用。7 5mmol/L 葡萄糖标准应用液 吸取葡萄糖标准贮存液 5.0ml 放于 100ml 容量瓶中，用 12mmol/L 苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀。【操作步骤】1 自动分析法 按仪器说明书的要求进行测定。2 手工操作法取试管 3 支，按下表操作。葡萄糖氧化酶法测血糖操作步骤加入物 (ml)空白管标准管测定管血清0.02葡萄糖标准应用液0.02蒸馏水0.02酶酚混合试剂3.03.03.0混匀，置 37 水浴中，保温 15min ，在波长 505nm 处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。【计算】【参考范围】空腹血清葡萄糖为 3.89 6.11mmol/L 。【临床意义】1 生理性高血糖可见摄入高糖食物后，或情绪紧张肾上腺分泌增加时。2 病理性高血糖(1) 糖尿病：病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。(2) 内分泌腺功能障碍：甲状腺功能亢进，肾上腺皮质功能及髓质功能亢进。引起的各种对抗胰岛素的激素分泌过多也会出现高血糖。注意升高血糖的激素增多引起的高血糖，现已归入特异性糖尿病中。(3) 颅内压增高：颅内压增高刺激血糖中枢，如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等。(4) 脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。3 生理性低血糖 见于饥饿和剧烈运动。4 病理性低血糖 ( 特发性功能性低血糖最多见，依次是药源性、肝源性、胰岛素瘤等 )(1) 胰岛 细胞增生或胰岛 细胞瘤等，使胰岛素分泌过多。(2) 对抗胰岛素的激素分泌不足，如垂体前叶功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素分泌减少。(3) 严重肝病患者，由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下，肝脏不能有效地调节血糖。【注意事项】1 葡萄糖氧化酶对 - D 葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄糖约 36% 为 型， 64% 为 型。葡萄糖的完全氧化需要 型到 型的变旋反应。国外某些商品葡萄糖氧化酶试剂盒含有葡萄糖变旋酶，可加速这一反应，但在终点法中，延长孵育时间可达到完成自发变旋过程。新配制的葡萄糖标准液主要是 型，故须放置 2h 以上 ( 最好过夜 ) ，待变旋平衡后方可应用。2 葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰物质浓度过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。3 测定标本以草酸钾氟化钠为抗凝剂的血浆较好。取草酸钾 6g ，氟化钠 4g 。加水溶解至 100ml 。吸取 0.1ml 到试管内，在 80 以下烤干使用，可使 2 3ml 血液在 3 4 天内不凝固并抑制糖分解。4 本法用血量甚微，操作中应直接加标本至试剂中，再吸试剂反复冲洗吸管，以保证结果可靠。5 严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。【评价】线性范围至少可达 22.24mmol/L ，回收率 94% 105% ，批内 CV 为 0.7% 2.0% 。批间 CV 为 2% 左右，日间 CV 为 2% 3% 。葡萄糖氧化酶法与己糖激酶法比较， 73 份标本葡萄糖氧化酶法均值为 8.31mmol/L ，已糖激酶法均值 8.21mmol/L ，相关系数为 0.9986 ，回归方程 y=1.0026x 2.29 。本法测定葡萄糖非常特异，从原理反应式中可知第一步是特异反应，第二步特异性较差。误差往往发生在反应的第二步。一些还原性物质如尿酸、维生素 C 、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。然而，在本法的测定条件下，溶血标本血红蛋白的浓度达 10g/L ，黄疸标本胆红素浓度达 342 mol /L ，维生素 C 小于 30mg/L ，均不影响测定结果。氟化钠浓度达 2g/L 不干扰测定结果。标本中含尿素浓度达 46.7mmol/L ，尿酸浓度达 2.95mmol/L ，肌酐浓度达 4.42mmol/L 。半胱氨酸浓度达 3.30mmol/L ，甘油三酯浓度达 5.6mmol