RNA干扰在肿瘤治疗中的研究发展.doc

肄莁薄袈膇薇蒀袇艿莀螈羆罿薅蚄羅肁莈薀羄膃薄薆羃莅蒆袅羃肅艿螁羂膇蒅蚇羁芀芇薃羀罿蒃葿聿肂芆螈肈膄蒁蚄肇莆芄蚀肇肆薀薆肆膈莂袄肅芁薈螀肄莃莁蚆肃肃薆薂螀膅荿蒈蝿芇薄螇螈羇莇螃螇腿蚃虿螆芁蒆薅螅莄芈袃螄肃蒄蝿螄膆芇蚅袃芈蒂薁袂羈芅蒇袁肀蒀袆袀节芃螂衿莅蕿蚈袈肄莁薄袈膇薇蒀袇艿莀螈羆罿薅蚄羅肁莈薀羄膃薄薆羃莅蒆袅羃肅艿螁羂膇蒅蚇羁芀芇薃羀罿蒃葿聿肂芆螈肈膄蒁蚄肇莆芄蚀肇肆薀薆肆膈莂袄肅芁薈螀肄莃莁蚆肃肃薆薂螀膅荿蒈蝿芇薄螇螈羇莇螃螇腿蚃虿螆芁蒆薅螅莄芈袃螄肃蒄蝿螄膆芇蚅袃芈蒂薁袂羈芅蒇袁肀蒀袆袀节芃螂衿莅蕿蚈袈肄莁薄袈膇薇蒀袇艿莀螈羆罿薅蚄羅肁莈薀羄膃薄薆羃莅蒆袅羃肅艿螁羂膇蒅蚇羁芀芇薃羀罿蒃葿聿肂芆螈肈膄蒁蚄肇莆芄蚀肇肆薀薆肆膈莂袄肅芁薈螀肄莃莁蚆肃肃薆薂螀膅荿蒈蝿芇薄螇螈羇莇螃螇腿蚃虿螆芁蒆薅螅莄芈袃螄肃蒄蝿螄膆芇蚅袃芈蒂薁袂羈芅蒇袁肀蒀袆袀节芃螂衿莅蕿蚈袈肄莁薄袈膇薇蒀袇艿莀螈羆罿薅蚄羅肁莈薀羄膃薄薆羃莅蒆袅羃肅艿螁羂膇蒅蚇羁芀芇薃羀罿蒃葿聿肂芆螈肈膄蒁蚄肇莆芄蚀肇肆薀薆肆膈莂袄肅芁薈螀肄莃莁蚆肃肃薆薂螀膅荿蒈蝿芇薄螇螈羇莇螃螇腿蚃虿螆芁蒆薅螅莄芈袃螄肃蒄蝿螄膆芇蚅袃芈蒂薁袂羈芅蒇 RNA干扰在肿瘤治疗中的研究发展 孙源慧 于海燕 魏亚萍 赵倩摘要RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi的作用提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具。在肿瘤研究中, 通过RNA i技术可以选择性地抑制人类肿瘤相关基因的表达, 从而抑制肿瘤细胞的生长。该技术的应用为癌症的基因治疗提供了新的方法。关键词：RNA干扰；细胞周期 肿瘤 沉默基因 siRNA RNAi技术癌基因 抑癌基因Abstract ：RNA interference (RNA devices, RNAi) refers to in the evolutionary process highly conservative, by double-stranded RNA (double stranded RNA, dsRNA) - induced, homology mRNA efficient specificity degradation phenomenon. The role of RNAi provides an economic, fast and efficient inhibiting specific gene expression techniques help to study the genes in biology model system of function, is the important function of the gene research tools. In cancer research, through the RNA I technology can selectively restrain human tumor related gene expression, thus inhibiting tumor cell growth. The application of the technology for cancer gene therapy provides a new methodKey word ： RNAinterference siRNA RNA cancer Silence gene RNAi technology Cancer gene Tumor-suppressor genes Cell cycle Homologous mRNA 前言: RNA干扰( RNA interference, RNAi)是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象, 是由dsRNA介导的、特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi是真核生物体抵杭外源基因(如病毒基因、转座子、人工转入基因等)入侵的一种保护性反应, 它还是生物体在不同时期通过调控基因表达来调节细胞分化的机制。RNAi已成为一种极为有用的使基因失活的工具, 应用于多方面的研究中。肿瘤是一个多因素多步骤的发病过程, 涉及到多种分子特别是基因的改变。RNAi的特点就是它能同时针对基因起作用, 这为运用它来治疗肿瘤提供了机会。1 RNA干扰与卵巢癌1 1 恶性肿瘤细胞要实现转移, 必须突破由细胞外基质和基底膜构成的组织屏障, 因HPSE 具有降解硫酸乙酰肝素蛋白多聚糖(HSPG s)的能力, 所以在转移过程中具有重要意义。RNA i具有高度的序列专一性和有效性, 即只抑制与双链RNA ( dsRNA )同源的基因, 可以特异性地使基因沉默, 从而使基因功能丧失或基因表达量降低。 1 2 构建HPSE siRNA 真核表达载体, 将其导入卵巢癌细胞, 通过筛选能够获得稳定长期的表达干扰效果，用荧光定量PCR 检测HPSE 基因抑制情况。siRNA 是RNA i中的效应分子, 为短片段双链RNA结构, 能以同源互补序列的mRNA 作为反应靶目标。RNA i除了通过促使mRNA 降解以在转录后调控外, 也能引起转录水平的基因沉默( transcription gene silencing, TGS )。其机制是由dsRNA 降解成的21 23个核苷酸长的siRNA 小分子, 在细胞核中可以诱发同源序列DNA 的甲基化( RNA2 d irected DNA methy lation, RdDM ), 使靶启动子失去功能, 导致下游基因转录沉默 1 。所以, 可以通过检测mRNA筛选干扰的效果。13 与普通的胰腺癌细胞株相比，HPSE 受到抑制的细胞株细胞倍增时间明显延长。但两者的克隆形成率无统计学差异。我们认为, HPSE 表达受干扰后存在增殖能力减弱的倾向, 但需要更多的实验证实。肿瘤细胞与ECM 的黏附是影响迁移的重要因素,测定转染前后细胞的黏附能力, 发现HPSE 表达受抑制以后肿瘤细胞黏附能力提高, 但对细胞的迁移功能无影响。干扰HPSE 基因的表达对细胞侵袭行为的影响最大, 干扰组的侵袭能力明显降低, 证实HPSE 能够增强卵巢癌细胞的侵袭能力。进而RNAi抑制卵巢癌的恶性病变！2 RNA干扰与白血病21 RNAi 在增殖分化研究中的应用nm23 是一个多功能基因，除了具有抑制肿瘤转移作用，对细胞的增殖、分化、个体发育也具有调控功能。应用RNAi 技术沉默nm23-H1 基因导致人红白血病细胞K562 生长和增殖受到抑制，使细胞阻滞于G0 /G1期，同时导致c-myc 的表达下调，结果表明沉默K562 细胞中的nm23-H1 基因可促进细胞分化，其机制可能是通过阻滞细胞周期和下调c-myc 基因的表达而实现。2 2 RNAi 在凋亡研究中的应用抑癌基因家族中的癌基因iASPP( invasive alien species partnership program)是抑癌基因p53 的一个主要抑制基因，在急性白血病患者中iASPP 基因表达量与正常对照相比显著增高，表明该基因在急性白血病的病理和( 或) 疾病进展过程中起着重要作用，在白血病细胞株Nalm6和K562 中利用RNAi 技术下调iASPP 基因表达量，研究表明内源性iASPP 基因表达下调的同时，白血病细胞p53 依赖性的凋亡增加，因此， iASPP 基因可能是白血病治疗的一个分子靶标2 3 RNAi 在白血病耐药机制研究中的应用Wilms 肿瘤基因( Wilms tumor，WT) 1 是一种重要的转录调控因子，在白血病及许多实体肿瘤的病理进展过程当中发挥重要作用。Bernards 等利用构建小干扰RNA 表达载体转染白血病细胞株K562 细胞系，抑制WT1 / + 17AA 蛋白表达，导致MDR1( multi-drug resistance 1 ) 和P-g 蛋白表达水平下降，使Rh123 的累积及阿霉素细胞毒性作用增强，该研究表明WT1 / + 17AA 通过调节白血病细胞多重耐药机制而发挥它的致癌作用。3 RNA干扰与乳腺癌 31人端粒酶逆转录酶(Human telomerase reversetranscriptase, hTERT),即端粒酶催化亚单位是端粒酶的重要组分,被认为是端粒酶的催化亚基,是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤,在乳腺癌组织中,端粒酶活性表达显著升高,并且与乳腺癌病理类型和分化程度密切相关,而在正常乳腺组织中不表达,与乳腺癌的发生、发展有着密切的关系,hTERT在乳腺癌中高表达也提示预后较差。32依据RNA干扰原理,使用短发夹样RNA(small hairpin RNA,shRNA)设计的RNAi-DNA载体方法,以hTERT基因为靶点,构建针对该基因的siRNA表达载体,从细胞水平siRNA特异诱导hTERT基因转录后沉默,逆转乳腺癌细胞恶性表型的能力,探讨该表达载体对MCF-7乳腺癌细胞生长的影响及其hTERT表达的抑制作用。3- 3通过实验证明，siRNA特异诱导hTERT基因转录后沉默,靶向hTERT基因的siRNA能在MCF-7乳腺癌细胞中特异诱导RNAi,抑制了MCF-7乳腺癌细胞的增殖,从mRNA和蛋白水平降低hTERT的表达,逆转了乳腺癌细胞的恶性表型,使其向良好的方向发展！4 RNA干扰与胰腺癌41胰腺癌易发生侵袭和转移, 85% 以上的患者在确诊时已有转移或侵袭到胰腺外器官而无法切除。研究表明, 基质金属蛋白酶2( mat rix metal-lo pro teinases-2, MMP-2) 与胰腺癌的侵袭转移密切相关。基质金属蛋白酶( matrixmetalloproteinases,MMPs) 是一组蛋白水解酶类, 能够降解细胞外基质( ex tr acellular mat rix, ECM) 和基底膜, 促使肿瘤细胞迁移和新生血管形成而 RNAi 体外沉默基质金属蛋白酶2( MMP-2) 基因对胰腺癌PANC-1 细胞MMP-2 mRNA 表达有抑制作用。4-2 RNAi 通过双链RNA 诱导同源mRNA 特异降解, 在基因转录后水平导致基因沉默。通过RQ-PCR 检测到PANC-1 细胞转染干扰质粒后MMP-2 mRNA含量下降了71. 74% , MMP-2 基因被有效抑制, 从而为以后胰腺癌的抗侵袭转移研究打下了基础。靶向MMP-2 的RN Ai 已经在胰腺癌体外研究中取得了良好的干扰效果, RNAi 能为胰腺癌尤其是晚期胰腺癌的治疗提供帮助。5 RNA干扰与大肠癌 51大肠癌发生发展过程受诸多因素的影响。传统的放疗、化疗及手术治疗仍不能获得理想的效果, 而基因治疗逐渐成为大肠癌研究的热点。转录信号传导子与激活子家族( signaltransducers and ac tivators o f transcription, STAT ) 的重要成员STAT3, STAT3是作为白细胞介素6信号传递中的急性反应因子最早被发现并被纯化的 , 其所参与的JAK /STAT信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关, 该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化, 为肿瘤形成过程中的重要环节。通过RNA 干扰( RNA i) 技术抑制STAT3基因在人大肠癌细胞HCT116中的表达, 观察其对大肠癌细胞生物学行为的影响, 为大肠癌基因治疗提供有效靶点及技术。5-2 RNA i技术在人大肠癌SW1990细胞中成功的抑制了STAT3的表达, 为防止大肠癌的侵袭和转移提供了新的策略 。因此, 应用RNA i技术可抑制STAT3基因在大肠癌细胞中的表达, 人工合成STAT3-siRNA-GFP可通过抑制大肠癌细胞的增殖、促进大肠癌细胞的凋亡而发挥抗肿瘤作用, STAT3 基因可成为大肠癌治疗中重要的方法。6-1问题与展望1 自从1998年Fire等提出RNAi以来,短短的几年间人们对它的认识和应用速度是惊人的。尽管RNAi在抗肿瘤方面表现出了相当的优越性,但仍存在一些问题。是否所有的基因都能成为RNAi的靶基因:从现有的报道来看,RNAi多在较低等的生物中实验,较多的用于报告基因的干扰,抑制效率也高低不等。研究表明,可能存在一些基因或组织能部分或完全抵抗RNA干扰,线虫的神经系统即具有这种能力。RNAi序列的选择:RNAi序列选择不同可能导致不同的抑制效果,并且只能在编码蛋白质外显子序列中选择。哺乳动物中RNAi问题:导入哺乳动物细胞的干扰RNA必须是21nt左右的小片段RNA链,而且其抑制效果不如在低等生物中,RNAi对稳定、丰富表达的靶基因抑制效率不高。体外合成的dsRNA或siRNA导入细胞的效率不高,尤其是在哺乳动物细胞中等等。还需要更多更深的研究和探索2 利用RNA i技术设计出针对肿瘤细胞特异基因的dsRNA, 可以高效、特异的抑制多种与癌发生、发展和耐药等相关的基因表达, 可以抑制肿瘤血管的形成, 调控肿瘤细胞的细胞周期和凋亡等, 为癌症的有效治疗提供新的思路。随着恶性肿瘤基因治疗领域的发展, 现在人类依据RNAi技术已建立起即用性siRNA文库和表达性siRNA文库, 使得利用RNA i技术进行高通量筛选基因成为可能。我们希望能够扩展现在的文库以靶向作用于更多的未知和非编码的转录本, 以建立起低重复、高效率、低非靶向作用的文库。参考文献:1 陈泓, 李力, 张 玮, 王琪 RNA i阻断乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究 现代妇产科进展2010年6月第19卷第6期 Prog Obste t Gyneco,l June 2010, Vo l 19, No62 徐能文 王少元 RNAi 在白血病相关基因功能研究与基因治疗中的应用 医学综述2010 年8 月第16 卷第16 期Medical Recapitulate，Aug 2010，Vol 16，No 16【3】 曾晓华 刘长安 王继见 印国兵 郭丹 RNAi下调hTERT基因对MCF-7乳腺癌细胞生长的影响 肿瘤防治研究2010年第37卷第七期 【4】朱学锋 李德春 陈益君 许建伟 顾继礼 朱东明 岑建农 RNAi 抑制胰腺