单核细胞增生李斯特菌检验课件

食品中单核细胞增生李斯特氏菌 检验,国标修订协作组 中国CDC营养与食品安全所,李斯特氏菌属,李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。,单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污染。该菌在4的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例，死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。,检测程序,目前常用的单核增生李斯特氏菌检测增菌肉汤主要有半量Fraser肉汤、 Fraser肉汤（FB）、UVM（Modified University of Vermont broth，也叫UVM1）、LEB（Listeria enrichment broth）和BLEB（buffered Listeria enrichment broth）,半量Fraser肉汤和Fraser肉汤,具有选择性和区别性。 加入柠檬酸铁铵和七叶灵，起到区别的作用。李斯特氏菌可以水解七叶灵，与培养基中的铁离子反应，使培养基变黑，可直观的从培养液的颜色就可以判断是否有单核李斯特氏菌的生长。 氯化锂、吖啶黄和萘啶酮酸作为选择性因子。 半量Fraser肉汤与Fraser肉汤所用的添加剂一样 半量Fraser肉汤：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黄12.5mg/L Fraser肉汤：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黄的25mg/L,UVM,UVM只有选择性没有区别性 加入萘啶酮酸和盐酸吖啶黄，作为选择性因子。虽然其中含有七叶灵，但是没有添加柠檬酸铁铵，不能发生黑色的颜色反应。,LEB和BLEB,只有选择性没有区别性 LEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入的丙酮酸钠，有助于受损细胞的恢复；不含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应 BLEB是在LEB基础上加入缓冲体系：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠,检测程序 -分离,分离培养基有：OXA、PALCAM、LPM、MOX等，但首选仍然是OXA。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有D葡萄糖苷酶的活性，能水解培养基中的七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而，使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈。 还有一些选择性显色培养基，如BCM、ALOA、CHROMagar listeria、RapidL. mono等。,修订原则,参照FDA、AOAC、ISO、 AFNOR等有关标准，使本标准更接近现行国际标准 保持与原标准的连续性,修订依据,FDA BAM (2001) chapter10 AOAC 975.55 987.09 ISO11290-1 AFNOR DGAL/SDHA/N93 USDA/FSIS Microbiology laboratory Guidebook 3rd Edition Canada Health and Welfare Canada MFHPB-30 各省、市CDC和其他系统专家提出的修改意见,修订内容,单增李斯特氏菌选择性增菌肉汤的比较和筛选 单增李斯特氏菌选择性培养基的比较和筛选 初筛步骤,选择性增菌肉汤的比较和筛选,根据各省反馈意见及长期使用经验，EB增菌液增菌效果远远低于LB增菌液,选择性增菌肉汤的比较和筛选,通过对高污染及低污染食品进行增菌效果比对，结果表明： LB肉汤的增菌效果最佳 BLEB更适于背景微生物较少的熟食样品 修订标准选择LB增菌肉汤,分离培养基的比较和筛选,比对试验： MMA 进口OXA 进口PALCAM 国产OXA 国产PALCAM CHROMagar,高污染食品及低污染食品的分离效果 比较 农贸市场生肉、熟肉样品 超市生肉样品 回收率比较,L.M在OXA培养基生长特征,L.M在PALCAM培养基生长特征,L.M在 Chromagar培养基生长特征,MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难与杂菌区分 进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与杂菌区分 CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对高污染食品中的杂菌抑制性较差,回收率： 进口PALCAM和CHROMagar较高，结果稳定,进口PALCAM和科玛嘉均优于进口OXA、国产PALCAM、国产OXA和MMA。背景微生物较少时，科玛嘉的分离效果最好；背景微生物较复杂时，进口PALCAM分离效果最好 根据各省长期使用经验及本次实验结果结合参考文献，修订标准拟采用PALCAM和CHROMagar分离培养基,检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质,0.1 mL+10 mL LB2增菌液,科玛嘉李斯特菌显色培养基,PALCAM琼脂,接种木糖、鼠李糖，36 1 ，24 h；同时于TSA-YE平板划线纯化，30 1 ，24 h48 h,木糖-，鼠李糖+,鉴定,结果报告,30 1 ，24 h,30 1 ，18 h24 h,36 1 ，24 h48 h,染色、动力、H2O2酶、糖发酵、MR-VP、溶血（格子穿刺，底部）、协同溶血,单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别,初筛 高污染样品在选择性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。,由于在李斯特氏菌属中，只有单增李斯特氏菌与英诺克李斯特菌的木糖与鼠李糖发酵结果相同，即木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为黄色。在TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色或蓝灰色。对木糖、鼠李糖典型反应的菌落，可直接从TSA-YE平板上挑取进行进一步的实验,2.商业生化鉴定系统的应用 原国标中未涉及，FDA、AOAC标准使用API 10300、Vitek GPI（AOAC 989.13），这些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。 我国许多单位也积累了较多的经验，使用最广泛的是API 10300, Vitek GPI，考虑到各种系统在国内的实际应用现状，拟定在生化鉴定方面“采纳API10300或Vitek GPI为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。,API10300,L.M的API10300鉴定结果,报告,综合生化实验和溶血试验结果，报告检出或未检出/25g,mL 小鼠毒力实验可选择：1010cfu/ml, 35只小鼠腹腔注射0.5ml, 25天死亡，设阴阳性对照组，单增和伊氏,VITEK,第二法 全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法,mini VIDAS或VIDAS单核细胞增生李斯特氏菌分析，是在自动VIDAS仪器上进行的双抗体夹心酶联荧光免疫分析方法。固相容器（SPR）用单核细胞增生李斯特氏菌抗体包被，各种试剂均封闭在试剂条内。煮沸过的增菌肉汤加入试条孔后，在特定时间内样本中的单核细胞增生李斯特氏菌抗原与包被在SPR内部的单核细胞增生李斯特氏菌抗体结合，未结合的其他成分通过洗涤步骤清除。标记有碱性磷酸酶的抗体与固定在SPR壁上的单核细胞增生李斯特氏菌抗原结合，最后洗去未结合的抗体标记物。SPR中所用荧光底物为磷酸4-甲基伞型物。结合在SPR壁上的酶将催化底物转变成具有荧光的产物：4-甲基伞形酮。VIDAS光扫描器在波长450 nm处检测该荧光强度。试验完成后由VIDAS自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样本的检测结果。,操作步骤,前增菌 以无菌操作取检样25 g(mL)加入到含有225 mLHalf-Fraser肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1 min2 min；或放入盛有225 mLHalf-Fraser肉汤的均质杯中，8000 rpm10000 rpm均质1 min2 min。于30 1 培养24 h。同时做阳性及阴性对照。,增菌与处理 取1 mL前增菌肉汤接种于10 mlFraser肉汤，于30 1 培养24 h。然后取1 mL增菌的Fraser肉汤加入试管中，在100 水浴中加热15min。剩余增菌肉汤保存于2 8 ，以备对阳性检测结果确认。,上机操作 输入MLE卡信息 每个试剂盒在使用之前，首先要用试剂盒中的MLE卡向仪器输入试剂规格（或曲线数据）。每盒试剂只需输入一次。,校正 在输入MLE卡信息后，使用试剂盒内的校正液进行校正，校正必须做双份测试。以后每14天进行一次校正。,检测 取出试剂条，待恢复至室温后进行样本编号。 建立work list，输入样本编号。 分别吸取500 L对照和样本（冷却至室温）加入到试剂条样本孔中央。依屏幕提示，将试剂条放入仪器相应的位置。,结果报告 检测值是样品的相对荧光值（RFV）与标准溶液的相对荧光值（RFV）的比值，即：,阴性结果可直接报告25 g/mL样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。 阳性结果的样品必须对保存于2 8 的增菌肉汤进行确认,第三法 全自动病原菌检测系统筛选法,BAX系统利用多聚酶链反应（PCR）来扩增并检测细菌DNA中特异片段来判断目标菌是否存在。反应所需的引物、DNA聚合酶和核苷酸等被合并成为一个稳定、干燥的片剂，并装入PCR管中，检测系统运用荧光检测来分析PCR产物。每个PCR试剂片都包含有荧光染料，该染料能结合双链DNA，并且受光激发后发出荧光信号。在检测过程中，BAX系统通过测量荧光信号的变化，分析测量数据，从而判定阳性或阴性结果。,增菌,一般食品：称取25 样品于225 mL不含抗生素的BLEB中，混匀后在30 C1 培养4 h，然后加入抗生素在30 C1 培养20 h，移取100 L转种于9.9 ml MOPS-BLEB 中（1:100 ），36 C1 培养18 h24 h。,生肉：称取25 样品于225 mLDemi-Fraser肉汤中，混匀后，30 C 1培养 22 h24 h；移取100 L转种于9.9 ml MOPS-BLEB 中（1:100），36 C1 培养18 h24 h。,熟肉制品：称取25 样品于225 mL UVM-LEB中，混匀后，30 C1 培养 22 h24 h；移取100 L转种于9.9 mL MOPS-BLEB 中(1:100 )，36 C1 培养18 h24 h。,乳品：称取25 样品于225 mL LEB中，混匀后，在35 C1 培养22 h26 h；移取100 L 转种于9 ml MOPS-BLEB 中 (1:100) ，36 C1 培养18 h24 h。,熏鱼：称取25 样品于225 mL LB1中，混匀后，35 C1 培养22 h26 h；移取1 mL 转种于9 ml MOPS-BLEB (1:10)，36 C1 培养18 h24 h。,上机操作,打开加热槽分别加热至55 和95 ，检查冷藏过夜的冷却槽(4 )，开机并启动BAX系统软件。如果仪器自检后建议校正，按屏幕提示进行校正操作。 创建“rack”文件： 根据提示在完整的“rack”文件和“个样”资料中输入识别数据。,溶菌操作：在每个溶菌管加入200 L配制好的溶菌试剂，取5 L增菌肉汤加入相应的溶菌管中，盖上盖子。将溶菌管放在55 加热槽中，加热60 min；再将溶菌管放在95 的加热槽中，加热10 min；最后将溶菌管放在冷却槽上（冷却槽从冰箱取出后30 min内使用完毕），冷却5 min。剩余增菌肉汤保存于2 8 ，以备对阳性检测结果确认。,加热循环仪/检测仪：从菜单中选择“RUN FULL PROCESS”，加热到设定温度（热槽90 ，盖子100 ）。,溶菌产物转移：将PCR管支架放到专用冷却槽上，然后将PCR管放入到支架内。将所有的管盖放松并除去一排管盖。用多道加样器将50 L溶菌产物加入此排管中，并用替代的透明盖密封PCR管。换用新吸头，重复上述操作，直至将所有样