诺贝尔生理医学奖膜片钳技术与单离子通道.ppt

1991年诺贝尔生理医学奖 膜片钳技术与单离子通道,得奖者： 埃尔文尼赫尔（Erwin Neher） 贝尔特萨克曼（Bert Sakmann）,人物简介,发现细胞单离子通道的功能： 埃尔文尼赫尔 Erwin Neher，1944 。,德国生物物理学家，1991年诺贝尔生理学和医学奖得主。1944年3月20日出生于德国巴伐利亚州的兰茨贝格，父亲弗朗茨尼赫尔管理着一个乳业公司，母亲为教师，他有二个姐姐。他在故乡生活、读书到1963年，19631966年在慕尼黑工业大学学物理学，1966年获富布赖特奖学金去美国，在威斯康星大学麦迪逊分校学一年，1967年获生物物理学硕士学位回慕尼黑。19681972年在德国马克斯普朗克研究所的实验室，1970年获慕尼黑工业大学物理学博士。19721982年为该研究所实验室副研究员，1983年为该研究所膜生理部主任。1986年为德国哥廷根大学名誉教授，19891990年在美国加州理工学院新时代的学者。现任德国马克斯普朗克研究所所长、教授。,尼赫尔多次获奖：1977年德国社会物理化学能斯特-哈勃-博登斯坦奖；1979年伦敦菲尔德博格奖；1982年生物物理陈家强科尔奖；1982年纽约科学院哈罗德奖；1983年哥伦比亚大学斯潘塞奖；1984年维尔茨堡大学阿道夫菲克-特奖；1986年哥伦比亚大学路易莎格罗斯霍维兹奖；1986年吉森大学顺克特奖；1986年德意志基金会莱布尼兹奖；1989年多伦多盖尔德纳奖；1990年明斯特大学汉斯-斯特恩特奖；1990年纽约百时美施贵宝研究奖；1991年美国神经科学协会杰拉德奖等等。 1979年尼赫尔结婚，夫人爱娃-玛丽亚内尔，是个微生物学家，他们有五个孩子。,细胞离子通道发现者之一： 贝尔特萨克曼,Bert Sakmann 1942-,德国细胞生理学家，1991年诺贝尔生理学和医学奖得主。1942年6月12日出生于德国巴登-符腾堡州首府斯图加特，他们住在德国南部已几代人，父亲出生于医生家庭，是一家公司的董事，母亲是出生于泰国曼谷的一位物理治疗师，外祖父是德国医生，是暹罗第一医院创始人之一。萨克曼童年和小学在农村（林道）长大，1961年在斯图加特读完高中，他自小喜欢物理，在家里设计和建造汽车、远程控制飞机、船只等模型，理想成为一名工程师。因着迷生物学，1967年就读于蒂宾根大学医学院，1968年在慕尼黑大学，同时作为科学助理在马克斯普朗克研究所。1971年到伦敦大学生物物理部工作，1974年完成医学论文，获哥廷根大学医学院医学学位，同年回到马克斯普朗克研究所，与埃尔文尼赫尔（1944-）合作达十六年之久。1979年加入到膜生物学小组，1985年成为研究所所长。,萨克曼还得过： 1982年希伯莱大学第一任校长马格内斯奖； 1991年理工大学哈维奖。 萨克曼的夫人克里斯时蒂安，是位眼科医生，他们有二个儿子和一个女儿。,研究背景 1902年，伯恩斯坦提出膜学说 1939-1949年，霍奇金和赫克斯利利用枪乌贼的巨大神经轴突为材料和电压钳等生理技术，进行一系列实验提出离子学说。 1951年，R.D.Keynes以乌曲大轴突为实验材料，研究了致射性离子和钾离子的跨膜移动。 这些早期的实验和提出的理论表明，在兴奋过程中细胞膜内外离子穿过神经细胞膜的活动是通过跨膜通道进行的，为进一步研究离子单通道打下基础。 1975年，B.Hille提出了从河豚内脏提取的一个河豚毒素分子如何阻塞，钠通道的模型。 1976年，德国科学家Erwin Neher和Bert.Sakmann共同发展了一种允许记录通过离子单通道的非常小的电流（PA，即10-12）的技术，即膜片箝技术，该技术可以记录由于单个通道分子改变形状而发生的必常短暂(0.001ms以内)的电流。,得奖内容：,发现细胞的单一离子通道之功能 （for their discoveries concerning “the function of single ion channels in cells ） 单一离子通道记录法（single channel recording or patch clamp recording）,1980年Neher、Sakmann合作发明了patch clamp技术，该技术是一种广泛用于细胞生物学及神经科学研究的方法，可藉以检验小至一万亿分之一安培的通过细胞膜的电流。这一研究成果对于研究细胞功能的调控机制至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。 他们同在一个实验室，他们一道最终确认了细胞膜上离子通道的存在，离子通道是一些具特征性的机制，有的仅允许阳离子通过，有的仅允许阴离子通过，接着他们研究了多种细胞功能，终于发现离子通道在糖尿病、癫痫、某些心血管病.某些神经肌肉疾病中所引起的作用，这些发现使研究新的更为特异性的药物疗法成为可能。,膜片钳技术,原理：用特殊处理过的玻璃微电极压在细胞膜上, 玻璃微电极和细胞膜片间形成高电阻封闭，这一封闭对膜片进行了电和化学的隔离。由于电的隔离以及玻璃微电极的低电阻, 只要简单地对玻璃电极提供一个电压,就能对膜片进行电压钳位。膜片的直径为0.5-1微米, 在膜片内一般有4 -6 个离子通道, 大多数情况下只有一个通道。从玻璃微电极引出的微小电流通过电流电压变换装置, 在示波器上可观察到一系列矩形等幅脉冲, 电流图形显示通道是以全或无的方式随机开放的时间,方法： 1.拉制微电极 采用低熔点的玻璃毛细管;在美国普遍使用一种医用的玻璃毛细管, 第一步按传统的玻璃微电极拉制方法, 将一根玻璃毛细管拉成两根电极备用, 电极颈长1.5 厘米左右。第二步是将玻璃电极进一步拉细, 烧红的v字型电阻丝， 将玻璃电极尖端烧成一弯钩, 并将1克左右的重物挂在钩上, 然后移动烧红的电阻丝到距电极杆6-8毫米处;注意电阻丝不能碰着电极，对电极再次加热至烧断, 此时电极尖端为平的切口, 尖端直径约1-2 微米。,第三步是对玻璃电极尖端进行加工, 用v 字型铂铱合金电阻丝加热电极尖端，v 型电阻丝尖端裹上一直径0.5 毫米的玻璃球。加热时电极尖端收紧成圆滑的口, 此时电极尖端直径为0.5-1微米, 电极的电阻为2-5兆欧。 要成功地形成一个高阻封闭, 首先要保证玻璃微电极尖端的清洁, 在制作过程中要防尘, 实验用的各种缓冲溶液使用前要过滤, 防止组织碎片或结晶物质堵塞电极尖端。此外, 实验用的细胞膜表面一定要光滑, 为了使电极尖端平滑, 可以进行电极抛光, 使用抛光的电极形成的密封比较稳定,2充灌微电极 用于充灌微电极的液体需经微孔滤膜过滤, 除去 阻止封接形成的灰尘。充灌方法多种多样, 在微电极 尖端较粗的情况下, 用注射器或聚乙烯的细塑料管直 接从电极尾部充灌即可, 这种方法叫反向充灌。而在 电极尖端较细的情况下, 首先将电极尖端浸于此液中, 利用毛细管现象使尖端部分充满液体, 然后再从其尾 部充灌, 如果有气泡, 用手持微电极使其尖端朝下, 用 手指轻弹几下管壁即可除去。电极液不要充灌太多, 否则将电极装在电极架上时, 液体可从电极溢出会浸 湿支架内部, 可能成为各种故障的原因。,。,3高阻封接的形成 1981年Neher等对此项技术又做了改进,电流测量的灵敏度，时间和空间分辨率均提高。通过一根塑料管, 用吸气方法在玻璃微电极内造成负压, 膜片向玻璃微电极内突出呈半球形, 膜片与玻璃微电极更紧密地接触, 形成1-100千兆欧的高电阻封闭, 此项改进称为京欧封闭。如果封接处有漏洞，就会隐藏一些很小的电流。此项改进的优点是, 通过膜片的电流几乎全部流进玻璃微电极, 1-100 千兆欧的封闭电阻使记录的背景噪声减到1PA以下，改进了频率响应的记录系统可控制膜片电位, 此京欧封闭也具有机械稳定性, 可制成不同形式的游离膜片, 此时玻璃微电极带着尖端的膜片脱离整个细胞表面, 且保持其高封闭电阻的特性。使用这些膜片形式可以很方便地控制膜片两侧的溶液成分, 以利于不同目的的离子通道研究,膜片形式 根据膜片与电极之间的关系, 分为: 细胞吸附式、全细胞模式、膜内面向外模式、膜外面向外模式。细胞吸附式是玻璃微电极在完整细胞上形成一个高阻封闭的膜，这时玻璃微电极内充灌的溶液为细胞外液。全细胞模式形式是在细胞吸附式的基础上吸破细胞膜玻璃电极内为低钙溶液, 这时玻璃微电极与细胞内相通, 玻璃微电极内充灌细胞内液。这种实验形式相当于细胞内擂人一个电极, 可用作整个细胞的电压钳位实验, 由于用一个电极代替了两个电极进行细胞电压钳位实验, 故这种形式特别适用于对小细胞的电压钳位。通过玻璃微电极可改变细胞内液的成分和浓度。,膜内面向外模式 是在细胞吸附式的基础上, 用外力使玻璃微电极连同尖端的膜片脱离细胞表面成为游离的膜片, 这时玻璃微电极尖端的膜片暴露在外的一面正是细胞膜的内表面, 膜片在玻璃微电极内的一面是细胞膜的外表面。因此, 玻璃微电极内应充灌细胞外液, 玻璃电极尖端则浸入细胞内液中。膜片两侧的溶液可以随意更换。 膜外面向外模式是在全细胞模式的基础上, 用外力使玻璃微电极连同尖端的一部分细胞膜脱离细胞表面, 尖端的细胞膜游离部分自行合拢成脂双层膜, 这时玻璃微电极尖端的膜片在电极内的一面正好是细胞膜的内表面, 暴露在外面的一面是细胞膜的外表面。,因此, 玻璃微电极内应充灌细胞内液, 玻璃微电极尖端则浸入细胞外液中。同样, 膜片两侧的溶液可以随意更换 以膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。,应用与发展： 膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）。 传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。,这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！签于全自动膜片钳技术的这些优点，目前已经广泛的用于药物筛选。 膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直接或间接临床医学研究服务， 目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。 随着全自动膜片钳技术（Automatic patch clamp technology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力。,1膜片钳技术与荧光技术的结合 荧光探针常用于检测细胞内的钙离子浓度, 能与钙离子结合, 产生较强的荧光, 通过膜片微电极将其引入细胞, 可以利用膜片钳记录细胞内的钙离子浓度, 钙离子的释放及内流等情况, 研究细胞膜钙离子通道的开放、关闭的动力学特征及生理学效应。 2穿孔膜片钳技术 1988年H orn等对传统全细胞记录进行了改进, 建立了穿孔膜片钳技术即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质, 将这类抗生素充灌在电极液中, 在高阻封接形成之后自发形成全细胞记录模式。,该技术中, 抗生素形成孔道的有效半径为0. 4 0. 8 nm, 可以选择性地通透Na+ 、K+ 、Li+ 、Cs+ 、Cl- 等一价离子, 使细胞内环境相对稳定, 电流的衰减现象减弱。并且抗生素对细胞的损伤作用小, 高阻封接不易被破坏, 记录的持续时间延长。 3在体膜片钳技术 在体膜片钳技术主要用于研究感觉系统对外界环境刺激的反应特性和机理。该技术主要引入双光子显微技术, 并结合荧光标记技术, 使细胞内微电极的穿透可以准确的定位, 能探测到胞体、树突甚至个别的棘突, 大大提高了实验的准确率和成功率。,4全自动膜片钳技术 全自动膜片钳技术是离子通道检测的新技术, 它具有直接性、高信息量及高精确性的特点。与常规的膜片钳技术相比, 全自动膜片钳技术能够进行大量筛选, 具有高通量性, 并且高阻封接稳定, 实验记录的精确性高, 实现了操作过程的自动化。目前, 该技术应用于以离子通道为靶标的药物的筛选, 药效的测试以及安全性研究等方面。 5膜片钳技术与分子生物学技术的结合 分子生物学是从分子水平上研究生物的形态结构及其功能的科学, 膜片钳技术利用微电极来研究细胞膜上离子通道的通透性和电位的变化。,离子通道,细胞是构成生物体的基本单位，细胞是通过细胞膜与外界隔离的，在细胞膜上有很多通道，细胞就是通过这些通道与外界进行物质交换的。这些通道由单个分子或多个分子组成，允许一些离子通过。信号的调节影响到细胞的生命和功能。 生物体内的各种细胞由于周遭离子分布的不均匀，因此在平常静止状态时，细胞内所带的电荷是“的，而细胞外通常是比较“的，这就是所谓的静止膜电位（resting membrane potential）。当细胞兴奋时如神经的传导，肌肉的收缩或腺细胞的分泌，细胞膜上的离子通道（如Na+ channel）就会打开，让Na+离子由细胞外进入细胞内产生去极化现象（Depolarization）。,因此要了解神经细胞间讯息的传递及肌肉细胞收缩的原理，首先就是要探讨细胞膜上各种离子通道如何选择性的运送离子。 Erwin Neher 和Bert Sakmann合作，结果发现当离子通过细胞膜上的离子通道的时候，产生十分微弱的电流。Neher and Sakmann在实验中，利用与离子通道直径近似的钠离子或氯离子，最后达到共识：离子通道是存在的，以及它们如何发挥功能的。有一些离子通道上有接受体，他们甚至发现了这些接受体在通道分子中的定位,Neher and Sakmann 记录了流经单一离子通道的电流,已知细胞膜上的离子改变是快速的，但Neher和Sakmann是第一发现有特殊的离子通道实际存在。为了说明离子通道的作用方式，所以必须记录通道是如何开启和闭合的。流经单一离子通道的离子性电流十分微小，这似乎难以证明前述情况。此外，有小的离子通道分子嵌在细胞膜上。Neher和Sakmann成功地解决了这些困难点。他们发明了细小的玻璃微量吸管（直径为a thousandths of a millimeter）作为记录电极。当微量吸管接触进入细胞膜，微量吸管的孔洞周围会形成紧实的密封状（Figure 1A, B）。微量吸管内外部的离子改变，仅发生在膜上的离子通道。当单一的离子通道开启，带电的离子将会移动通过离子通道，形成电流。经过精密的电子设备，他们成功地估量出实验中的精微电流（”microscopical” current）。,单一离子通道记录法的发明,他们利用一个毛细玻璃管，管口的直径比一个细胞还小，大约只有二到三微米（10-6米）。如果这个毛细管口非常干净，在显微镜底下将它轻轻压位细胞的表面，再加点吸力，细胞膜就会紧紧黏在管口上。如果细胞膜上有一个离子通道的分子，经过电流的记录仪器，就可以记录在这个离子通道进出的离子流。 应用这套技术，顺利地记录出青蛙肌肉细胞上单一离子通道流过电流的大小。Neher和Sakmann的结果显示，肌肉细胞的细胞膜上一个离子通道可通过的电流约为二十微微安培（10-12安培），换成离子数目大约是每秒通过一亿个离子。,How Does an Ion Channel Operate?离子通道是如何运作的？,离子通道有数种不同的型态。有些只允许带正电的离子通过，例如钠离子、钾离子、或钙离子等，有的只允许阴离子通过，如氯离子。Neher和Sakmann发现了这种特异性是很完备的。其中一个原因是由于离子通道的直径大小，仅适于一特定离子的直径。其中一种离子通道，具有两个带有正荷或是两个负荷胺基酸的环。这种环形成了离子滤器（see Figure 1C），只允许一个相反电荷的离子通过这个滤器。特别的是，Sakmann和其它不同的分子生物学家一样，完成了一个具创造性的反应，这个反应解释了离子通道分子的不同部分是如何运作的。,Regulation on Channel Function 离子通道的调节功能,Neher和Sakmann也使用微量吸管电极将不同的作用物质注射到细胞内，因此研究出细胞分泌不同的阶段。在这个方法中，说明了细胞分泌的机制为cyclic AMP或是钙离子所担任的。 胰岛素分泌的基本机制已经确定，血糖的水平控制着产生胰岛素的细胞内的葡萄糖水平，后者可调节能源物质ATP，ATP直接作用于控制细胞膜电位的特殊离子通道。膜电位的改变可间接影响允许钙离子进入细胞的离子通道，最后由Ca2+触发胰岛素分泌。刺激糖尿病病人胰岛素分泌的某些药物就是直接作用在被ATP控制的离子通道上的。,The Study of Secretory Processes分泌过程进行之研究,神经细胞及产生激素的内分泌细胞和防御细胞分泌不同的物质。这些物质均贮存在由膜包围起来的小泡内。当细胞被刺激时，小泡移动到细胞表面，小泡膜与胞膜融合，并释放其中的物质。Neher发展了一种记录小泡与胞膜融合均新技术，阐述了上述细