缺氧调控报告载体的构建与鉴定.doc

缺氧调控报告载体的构建与鉴定 作者：杨洁，李占亭，杜德伟，柴青焕，王丽，张惠中，孙脊峰【关键词】 荧光素酶 Construction and identification of hypoxia regulatory reporter vectors【Abstract】 AIM: To construct the firefly luciferase reporter gene vectors regulated by hypoxia response promoters. METHODS: The oligonucleotides of hypoxia response element (HRE) and a mutation control were synthesized and cloned into pCIneo vectors to constrct HRE/CMV recombinant vectors. Then HRE/CMV promoters amplified by PCR were subcloned into pGL3Basic vectors. RESULTS: The integrity reporter vectors were verified by restriction enzyme digestion. Also, the sequences of the vectors were detected and aligned to the expected sequences. CONCLUSION: Luciferase reporter vectors regulated by HRE/CMV promoters were successfully constructed, which makes it possible to further investigate their potency of hypoxia regulation.【Keywords】 transcription；regulation；hypoxia; response elements；luciferase；reporter gene【摘要】 目的：构建能用来检测缺氧应答启动子转录调控作用的萤火虫荧光素酶报告载体. 方法：合成缺氧应答元件(HRE)的寡核苷酸序列及其突变对照，克隆入pCIneo，构建HRE/CMV重组载体. 然后采用PCR方法将HRE/CMV启动子定向亚克隆入pGL3Basic. 结果：酶切和测序鉴定分析，所克隆的基因产物酶切结果与预期值一致，序列无碱基的突变. 结论：成功构建了缺氧应答启动子的荧光素酶报告载体，为进一步研究其缺氧调控作用提供了条件.【关键词】 转录；调控；缺氧;反应元件；荧光素酶；报告基因0引言目前已开发出多种报告载体用于研究启动子和/或增强子的调控活性1-3，如氯霉素乙酰转移酶报告载体，半乳糖苷酶报告载体，葡萄糖醛酸酶报告载体，碱性磷酸酶报告载体，绿色荧光蛋白报告载体以及荧光素酶报告载体. 其中荧光素酶报告载体以其检测迅速、敏感和重现性好，被广泛应用于启动子和增强子转录调控的研究4. 在基因调控机制研究中，应用报告载体对可能调控哺乳动物基因表达的基因元件进行定量分析是极为重要和必要的. 缺氧应答元件(hypoxia response element, HRE)是对缺氧可做出应激反应的缺氧反应基因内一段小于100 bp的单拷贝或多拷贝的顺式作用元件，能够与转录因子缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1, HIF1)结合，启动缺氧反应基因的转录，介导细胞对缺氧的反应5-6. 本文将各种不同缺氧应答基因的HRE与CMV启动子组合成缺氧应答启动子，构建其荧光素酶报告载体，快速对该遗传调控元件进行功能性分析.1材料和方法1.1材料Taq DNA聚合酶及Kpn，Hind限制性内切酶购自TaKaRa公司. 质粒小量制备与纯化试剂盒、PCR试剂购自天为时代公司. Bgl，Sgf，IPpo限制性内切酶和pCIneo真核表达载体、pGL3Basic报告基因载体、JM109菌种由Promega公司提供. HREs的正向和反向单链由博雅公司合成（两端带有限制性内切酶的粘端切口）. 引物由奥科公司合成. 测序由基康公司完成. 其他试剂为进口或国产分析纯.1.2方法1.2.1HRE退火合成的HRE单链用去离子灭菌水稀释成3 g/L，退火反应体系：正向单链2 L，反向单链2 L，1退火液将总体积补至50 L（退火液的配方：醋酸钾0.98 g，HEPES 0.72 g，KOH 0.18 g，醋酸镁0.043 g，去离子水100 mL，溶解后高压蒸气消毒，备用）. 退火反应条件：95 5 min变性后，70 10 min，关掉水浴锅，缓慢降至4，过夜.1.2.2HRE/CMV重组载体构建带有Bgl和Sgf切口的HRE正向和反向单链退火成双链后定向克隆入经相应酶切去除CMV增强子的pCIneo载体，构建HRE/CMV重组载体，转化至JM109大肠杆菌，挑选单克隆，提取重组质粒后对其行酶切鉴定，对符合预期值的克隆进行测序.1.2.3HRE/CMV报告载体的构建以测序正确的HRE/CMV重组载体为模板，设计并合成含Kpn，Hind限制性内切酶位点的引物，采用PCR方法克隆HRE/CMV调控序列. PCR反应体系：2Taq PCR MasterMix，12.5 L；Primer1，1 L； Primer2，1 L；质粒模板，1 L；总体积，25 L. PCR反应条件：95 5 min变性后，95，30 s，68，45 s，72，45 s，30个循环. PCR产物经电泳凝胶回收后，进行Kpn和Hind双酶切，定向克隆入经相应酶切的萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3Basic，转化至JM109大肠杆菌，挑选单克隆，提取重组质粒后对其行酶切鉴定，对符合预期值的克隆进行测序.2结果2.1HRE/CMV重组载体的鉴定合成的HRE正向和反向单链退火成双链后，与酶切后的pCIneo载体进行定向连接. 利用酶切对载体进行鉴定，选择Bgl和IPpo两个酶切位点，可得到约280 bp的片段. 酶切后电泳如图1所示，可见到与预期值相符的片段. 测序结果也与设计序列完全相同.M: DL2000 marker; 16: HRE/CMV(ENO，ENOm，VEGF，EPO，hPGK，mPGK) （Bgl+IPpo）.图1pCIneoHRE/CMV的酶切鉴定图（略）2.2HRE/CMV报告基因载体的鉴定以HRE/CMV重组载体为模板进行PCR，预期可获得约150 bp的HRE/CMV转录调控元件. 如图2所示，可见与预期大小相符的片段. 将回收的特异片段经Kpn和Hind双酶切后克隆入pGL3Basic，转化后提取重组质粒酶切鉴定，如图3所示，可见与预期大小相符的片段. 测序结果完全正确.3讨论作为报告基因，荧光素酶是一类能催化底物并发射荧光的酶家族. 包括细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶以及近年发现的海洋腔肠荧光素酶. 其中萤火虫荧光素酶克隆于北美洲萤火虫基因，它编码一条6.2104的多肽链，其活性不需转录后修饰，无二硫键，不需要辅助因子和结合金属，几乎在任何宿主细胞中表达. 它能催化甲虫荧光素的氧化性羧化作用，发射出光子，可由光度计捕获并定量. 该酶半衰期很短，对于基因元件的诱导效应进行瞬间分析效果很好. 由于大多数生物缺少内源荧光，所以几乎无背景干扰. 鉴于此，萤火虫荧光素酶报告载体系统已广泛应用于不同启动子下外源基因表达强度和转录调控作用的研究. 报告基因分析系统一般需要2个不同的报告载体同时转染细胞，一个标化转染效率，作为内参照；另一个测定启动子调控活性. 萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶这2种报告载体具有兼容的化学特性、操作条件、速度、灵敏度、线性范围和仪器需要，使用标准光度计即可迅速完成测试.M：DL2000 marker; 16: HRE/CMV（ENO，ENOm，VEGF，EPO，hPGK，mPGK）.图2HRE/CMV PCR产物（略）M: DL2000 marker; 16: HRE/CMV(ENO，ENOm，VEGF，EPO，hPGK，mPGK) （Kpn+Hind）.图3pGL3BasicHRE/CMV的酶切鉴定图（略）将HRE调控序列与CMV启动子组合后与报告基因连接，构建通过HRE调控报告基因表达的质粒. 转染细胞后，通过细胞自身DNA表达的转录因子，作用于基因调控序列. 如果转录因子对调控序列存在反式调控作用，此调控序列就会引发报告基因的表达. 由于报告基因的表达量是可检测并能进行定量分析，因而即可反映HRE调控序列对基因诱导调控的作用. 本研究设计组合了5个缺氧应答启动子及1个突变对照，并克隆于pGL3Basic萤火虫荧光素酶基因的上游，整合的pGL3BasicHRE/CMV载体经限制性酶切鉴定，载体测序结果也与预期完全相同. 这就为进一步研究HRE/CMV遗传调控元件的转录调控作用提供了资源和条件.【参考文献】1 Phippard D, Manning AM. Screening for inhibitors of transcription factors using luciferase reporter gene expression in transfected cells J. Methods Mol Biol, 2003, 225:19-23.2 Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression J. Science, 1994, 263: 802-805.3 Basu C, Kausch AP, Chandlee JM. Use of betaglucuronidase reporter gene for gene expression analysis in turfgrasses J. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 320(1):7-10.4 Bronstein I, Martin CS, Fortin JJ, et al. Chemiluminescence: Sensitive detection technology for reporter gene assays J. Clin Chem, 1996,