色谱分析法概论

电化学分析 紫外可见分光光度法 荧光分析法 红外光谱法 原子吸收分光光度法 核磁共振波谱法 质谱法,仪器分析方法,复杂组分分析,天然产物、中草药有效组分的测定,药物、高纯试剂的制备 青霉素过敏原因：含微量其他组分； 提纯后可口服,消除干扰,加入掩饰剂 控制分析条件,分离出待测物质,复杂组分分析,分离在分析中的作用,(1) 将被测组分从复杂体系中分离后测定 (2) 把对测定有干扰的组分分离除去 (3) 将性质相近的组分相互分开 (4) 把微量或痕量的待测组分分离富集,复杂组分分析,常用分离方法,蒸馏分离法 重结晶分离法 沉淀分离法 溶剂萃取分离法,超临界萃取 离子交换分离法 膜分离技术 色谱分离方法,分离前的体系：均相；两组分A、B的分离 分离体系总是两相：液-液；液-固；气-液,(chromatography),色谱分析法概论,高效能的物理分离技术 + 适当的检测手段,色谱法层析法,色谱分析法,色谱法的历史与发展,30年代 Tsweet分离绿叶色素 40年代 TLC，纸色谱 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能 60年代末 HPLC出现，色谱分析范围进一步扩大,诺贝尔化学奖： 1948年，瑞典Tiselins，电泳和吸附分析 1952年，英国Martin和Synge，分配色谱。,展望： 新型固定相和检测器 联用仪器：GC-MS，HPLC-MS 智能化发展,色谱法(chromatography)： 以试样组分在固定相和流动相间的作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法。,一、定义,第一节 概 述,二、色谱法分类,1.按流动相和固定相分子聚集状态分类,2.按操作形式分类,柱色谱法（column chromatography) 填充柱色谱法； 毛细管柱色谱法,平面色谱法（plane chromatography) 纸色谱法； 薄层色谱法,毛细管电泳法（capillary electrophoresis CE),二、色谱法分类,3.按色谱过程的分离机制分类,分配色谱法 (patition chromatography) 吸附色谱法 (adsorption chromatography) 离子交换色谱法 (ion exchange chromatography) 空间排阻色谱法 (steric exclusion chromatography),二、色谱法分类,优点：“三高”、“一快”、“一广”,高选择性可将性质相似的组分分开 高效能反复多次利用组分性质的差异 产生很好分离效果 高灵敏度10-1110-13g，适于痕量分析 分析速度快几几十分钟完成分离 一次 可以测多种样品 应用范围广气体，液体、固体物质 化学衍生化再色谱分离、分析,三、色谱法的特点,缺点：,对未知物分析的定性专属性差 需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS),三、色谱法的特点,第二节 色谱法的基本原理,实现色谱分析的基本条件,相对运动的两相流动相、固定相,各组分与固定相的作用存在差异,两个组分被流动相携带移动的速度不同 差速迁移，两组分被分离,一、色谱过程,色谱过程是物质分子在相对运动的两相分配“平衡”的过程。,二、色谱图有关概念,1.色谱图（色谱流出曲线） 根据混合组分的分离过程及检测器输出的信号强度对时间所绘曲线,（一）色谱图和色谱峰,色谱柱仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，稳定的基线为水平直线。,2. 基线,（一）色谱图和色谱峰,（一）色谱图和色谱峰,噪音：仪器本身所固有的，以噪音带宽表示 漂移：基线向某个方向稳定移动（仪器未稳定造成）,3.色谱峰（峰高、峰面积、峰位、峰宽）,（一）色谱图和色谱峰,流出曲线上的突起部分,不正常峰 拖尾峰和前延峰,正常峰 正态分布,对称因子fs 衡量色谱峰的对称性,正常峰0.95-1.05,保留时间、死时间、调整保留时间 保留体积、死体积调整保留体积 相对保留值,(二)保留值,保留时间: tR 进样到某组分色谱峰顶点的时间间隔 死时间：t0 分配系数为零的组分的保留时间 调整保留时间：tR= tR -t0 组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，是组份在固定相中的滞留时间,保留体积：VR 从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积 VR = tR FC FC为流动相流速 死体积： V0 由进样器至监测器的流路中未被固定相占有的空间。 V0 = t0 FC,调整保留体积：某组份保留体积扣除死体积后体积 V R = VR-V0 相对保留值：r（也用表示, 又称选择因子 ） 组份的调整保留值之比，色谱系统的选择性指标。,（三）峰高和峰面积,峰高：h 色谱峰顶点与基线的距离。 峰面积：A 色谱曲线与基线间包围的面积,标准差： 正态分布曲线上两拐点间距离的一半 0.607倍峰宽处的一半 半峰宽：峰高一半处的峰宽 W1/2=2.355 峰宽：(W) W=4 或 W=1.699W1/2 色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离,（四）色谱峰柱效参数,以区域宽度表征,（五）分离效能指标,分离度 R ：相邻两组分色谱峰保留时间之差与两色谱峰宽度均值之比,R 越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达99.7%，R=1.5常用作是否分开的判据,色谱峰数样品中单组份的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 区域宽度衡量色谱柱分离效能； 分离度组分分离程度。,色谱流出曲线的意义,K 与组分，固定相、流动相性质及温度有关 与两相体积、柱管特性和所用仪器无关,（一）描述分配过程的参数,三、分配系数与色谱分离,1、分配系数 (K)：,2. 分配比 (k)：保留因子、质量分配系数,其中VmV0，Vs为固定相体积。,3. K 与 k 的关系：,k与温度、压力、两相体积有关,（一）描述分配过程的参数,4. tR 与 K 的关系:,色谱过程方程 表示保留时间与分配系数的关系,（一）描述分配过程的参数,（二）色谱分离的前提,色谱分离的前提 组分在两相间分配系数 K 不同或分配比 k 不同,一、吸附色谱法 二、分配色谱法 三、 离子交换色谱法 四、空间排阻色谱法,第三节 色谱分离机制,一、吸附色谱法,分离机制： 利用吸附剂对不同组分吸附能力差异实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开,吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm,吸附系数,吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm,Ka与组分性质、吸附剂活性、流动相性质及温度有关,保留时间与Ka和Sa的关系为,一、吸附色谱法,固定相和流动相： 固定相吸附剂（硅胶或Al2O3） 流动相气体或有机溶剂（洗脱能力由极性决定）,色谱柱一定时，Ka大的组分吸附强，后被洗脱,洗脱顺序：,烷烃非极性，不被吸附； 不饱和化合物比饱和化合物的吸附能力强； 基本母核相同，取代基极性越强，吸附能力越强,一、吸附色谱法,狭义分配系数,分离机制 利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离,连续萃取过程,K与组分性质、流动相性质、固定相性质及柱温有关,二、分配色谱法,固定相和流动相： 固定相机械吸附在惰性载体上的液体 流动相必须与固定相不为互溶,正相分配色谱：流动相极性弱于固定相 反相分配色谱：流动相极性强于固定相,GLC：气体，常为氢气或氮气 LLC：与固定相不为互溶的液体,二、分配色谱法,正相分配色谱：极性强的组分后出柱 反相分配色谱：极性强的组分先出柱,洗脱顺序： 相似相溶原理,二、分配色谱法,选择性系数,分离机制： 依据被测组分与离子交换剂交换能力不同而实现分离,三、离子交换色谱法,固定相与流动相： 固定相离子交换树脂，硅胶键合离子交换剂 被交换基团：SO3H,COOH, NR3+OH- 。 性能指标：交联度、交换容量、粒度等。 流动相一定pH和离子强度的缓冲溶液 被分离组分离子型的有机物或无机物,三、离子交换色谱法,KA/B越大，交换能力越大，越易保留，后出柱,洗脱顺序：,影响保留行为的因素 离子电荷数越大，KA/B越大，保留时间越长 交换树脂交联度越大，组分保留时间长 流动相的离子强度提高，组分保留值降低,三、离子交换色谱法,四、空间排阻色谱法,分离机制,渗透系数,利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离,注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相性质无关,固定相与流动相： 固定相多孔性凝胶 流动相水凝胶过滤色谱 流动相有机溶剂凝胶渗透色谱,洗脱顺序：,保留值常用保留体积表示,分子线团尺寸（分子量）大的组分，渗透系数小，保留体积小，先被洗脱出柱。,四、空间排阻色谱法,四种色谱类型的比较,四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡 K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和渗透系数 分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。,物质对分离的两种情况,提高分离度R,组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制； （组分和固定液的结构和性质） 色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制； （两相中的运动阻力，扩散）,两种色谱理论：塔板理论和速率理论,第四节 色谱理论基础,一、塔板理论柱分离效能指标,将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复 。,1.塔板理论（plate theory）,第一次平衡称为一个理论塔板,半经验理论,H为理论塔板高度,塔板理论假定： 1）样品和新鲜载气都加在第0号塔板上，且样品的纵向扩散可以忽略。 2）在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到； 3）每次分配的分配系数相同； 4）流动相以不连续方式加入。,0,1,2,3,4,载 气,固 定 相,分配色谱过程示意图（塔板理论示意）,kA=2 kB=0.5,0,1,2,3,4,载 气,固 定 相,kA=2 kB=0.5,分配色谱过程示意图（塔板理论示意）,0,1,2,3,4,载 气,固 定 相,kA=2 kB=0.5,分配色谱过程示意图（塔板理论示意）,0,1,2,3,4,载 气,固 定 相,kA=2 kB=0.5,分配色谱过程示意图（塔板理论示意）,0,1,2,3,4,载 气,固 定 相,kA=2 kB=0.5,分配色谱过程示意图（塔板理论示意）,塔板数n50时，流出曲线接近正态分布曲线。,k=1的组分从n5柱中的流出曲线,理论塔板数,理论塔板高度,（柱长为L）,柱子的柱效的评价 塔板数；塔板高度,根据色谱流出曲线导出,保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!,有效塔板数,有效塔板高度,2.塔板理论的特点和不足,(1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,(3)柱效不能表示被分离组分实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,(4)该理论在理想情况下导出，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。,2.塔板理论的特点和不足,塔板理论不能解释： 峰形为什么会扩张？ 影响柱效的动力学因素是什么？,二、 速率理论影响柱效的因素,速率理论（Rate theory） 1956年，荷兰化学工程师van Deemter提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高H概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了van Deemter方程：,u 流动相线速度； A，B，C为常数 A涡流扩散项； B/u分子扩散项系数； C传质阻力项。,速率方程（van Deemter方程式）,当u一定时，减小A、B、C三项可提高柱效 在A、B、C较小时，H较小，柱效较高； 反之则柱效较低，色谱峰将展宽。,填充物颗粒大小及填充的不均匀性 同一组分运行路线长短不同 流出时间不同，峰形展宽,1）涡流扩散项 (A),1）涡流扩散项 (A),使用细粒固定相并填充均匀可减小A，提高柱效 对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。,展宽程度以A表示： A=2dp 其中dp填充物平均直径； 填充不规则因子。,2）分子扩散项 (B/u), 称为弯曲因子，固定相对分子扩散阻碍情况 D组分在流动相中的扩散系数,由于浓度梯度引起的,B = 2D,球状颗粒； 大分子量流动相； 适当增加流速；,讨论：,分子量大的组分，Dg小，即B小 Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低而减小； 流动相分子量大，Dg 小，即 B 小； u 增加，组份停留时间短，纵向扩散小； 对于液相色谱，因Dm 较小，B 项可勿略。,B=2D,短柱； 低温。,2）分子扩散项 (B/u),3）传质阻力项 (Cu),传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。,a）气液色谱：气体为流动相，C 包括气相传质阻力系数 Cs 和液相传质阻力系数 Cl 。,3）传质阻力项 (Cu),降低传质阻力方法：减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气。,k为分配比； Dg 、DL为扩散系数；dp为填充物大小； df液膜厚度,a）气液色谱：,3）传质阻力项 (Cu),b）液液色谱：液体为流动相，传质阻力项 C 包括流动相传质阻力系数 Cm 和固定相传质阻力系数 Cs 。,3）传质阻力项 (Cu),降低C的方法：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D等,K：分配比 Dm 、Ds：扩散系数 Dp：填充物大小 df：液膜厚度,3）传质阻力项 (Cu),4）流速u,H = A + B/u + Cu,涡流扩散项A与流速u无关； 低流速区，分子扩散项 (B/u) 大 分子量大气体如N2和Ar为载气提高柱效 高流速区，传质阻力项 (Cu)大 分子量小气体如H2和He为载气提高柱效,曲线最低点对应最佳线速uopt下最小板高Hmin 采用较uopt略高的线速度缩短分析时间,H-u曲线,三、 色谱分离方程,对于相邻难分离组分，它们的分配系数 K 相差小，可合理假设 k1 k2 = k，W1 W2 = W。导出R与n（neff