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人骨肉瘤差异表达基因的筛选 作者：李丁苏海川陈军阎小君范清宇 【关键词】 骨肉瘤 关键词: 骨肉瘤;差异表达基因;PCR技术;克隆;序列分析 摘 要:目的 研究人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的差异表达基因，探讨骨肉瘤的基因改变，为建立骨肉瘤的基因诊断方法打下基础. 方法 采用mRNA差异展示技术，应用3条锚定引物和8条随机引物从人骨肉瘤组织与正常骨组织中分离出差异表达基因，对其进行克隆、测序，用打点杂交技术证实其是否为差异表达基因，将筛选出的差异表达基因在GenBank检索进行序列同源性分析. 结果 筛选及克隆出6条差异条带，为ZOL03，ZOL51，1C82，1C74，2A21及2G12，RNA打点杂交证实它们在骨肉瘤中表达，在正常骨组织中不表达.6条差异片段经序列测定，在GenBank数据库中进行序列相似性分析，证实ZOL03，ZOL51同源性极低;1C82，1C74，2A21，2G12同源性较低，此6条片段为新基因序列，ORF finder分析未发现具有开放读框，均属于非编码区序列.其中ZOL03和ZOL51两个序列在GenBank数据库中登录，接受号为BI894276和BI936370. 结论 分离并克隆了人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的6条差异表达基因，同源性差，均确认为新基因，可能是骨肉瘤差异表达相关基因. Keywords:osteosarcoma;differential expressed gene;PCR;cloning;sequence analysis Abstract:AIM To explore differentially expressed genes between human osteosarcoma tissue and normal bone tissue and to discuss the alteration of genes in osteosarcoma.METHODS By way of mRNA differential display PCR，us-ing3anchor primers and8stochastic primers，differentially expressed genes between human osteosarcoma tissue and nor-mal bone tissue were isolated，cloned and sequenced.Then the genes were approved with technique of dotblot，searched and analyzed against GenBank.RESULTS Six genes were screened and cloned.RNA dotblot approved that they were expressed in osteosarcoma tissue and non-expressed or lowly expressed in normal bone tissue.Sequencing and searching in GenBank for comparability found that the6sequences were partially similar to sequences in GenBank.6sequences were new genes and2of them were accepted by GenBank，the ac-cepted numbers were BI894276and BI936370.CONCLUSION 6new differentially expressed genes between human osteosarcoma and normal bone tissues were isolated and cloned with low comparability.They are probably correlative differential expressed genes of human osteosarcoma. 0 引言 骨肉瘤是骨科最常见的高度恶性肿瘤.只有找到骨肉瘤特异性基因（差异表达基因）才有可能建立高度敏感且准确的基因诊断方法.因此，能否找到与骨肉瘤发生发展密切相关的差异表达基因已成为制约研究骨肉瘤治疗及早期诊断的关键因素.我们采用差异展示PCR（DD-PCR）技术研究人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的差异表达基因，探讨骨肉瘤的基因改变，为建立骨肉瘤的基因诊断方法打下基础. 1 材料和方法 1.1 材料 唐都医院全军骨肿瘤研究所确诊、未经任何治疗且无法保肢的骨肉瘤患者之截肢标本，选取骨肉瘤组织及相同肢体来源的正常骨组织.差示PCR引物采用GenHunter公司Liang和Pardee1996-04提供的第三代序列，由上海生物工程公司合成，5端引物为8条，3端引物为3条，其序列为:H-AP1 :5-AAGCTTGATTGCC-3;H-AP2 :5-AAGCTTCGACTGT-3;H-AP3 :5-AAGCTTT-GCTCAG-3;H-AP4 :5-AAGCTTCTCAACG-3;H-AP5 :5-AAGCTTAGTAGGC-3;H-AP6 :5-AAGCTTGCACCAT-3;H-AP7 :5-AAGCTTAA-CGAGG-3;H-AP 8 :5-AAGCTTTTACCGC-3;H-T11 G:5-AAGCTTTTTTTTTTTG-3;H-T11 A:5-AAGCTTTTTTTTTTTA-3;H-T11 C:5-AAGCTTTTTTTTTTTC-3.JM109为本所保存，pGEMR -T载体购自Promega公司.无RNA的DNA酶，Sal和Sph购自TaKaLa公司;Su-perscriptTM RNase H-反转录酶及DNA凝胶回收试剂盒购自Gibco公司;-32 P dATP及-32 P dATP购自北京亚辉生物工程公司. 1.2 方法 取新鲜截肢标本，无菌条件下，即取截肢体正常骨段骨组织，剔除骨膜，除净松质骨和骨髓，将此皮质骨咬至0.5cm0.5cm大小，以4生理盐水反复冲洗后，迅速置液氮中保存.将保存的骨组织取出置室温下35min，再放回液氮中，反复冻融58次.取此冻融骨组织约200mg浸入装有2mL预冷变性液的离心管中，冰浴下以高速离散器快速粉碎、匀浆，以备提取总RNA2 .参照奥斯伯标准酚/氯仿法抽提正常骨组织和骨肉瘤组织匀浆液中总RNA1 ，用无RNA的DNA酶处理后以DEPC处理水溶解，紫外分光光度仪测定总RNA吸光度（A260nm ，A280nm ），变性琼脂糖凝胶电泳观察总RNA完整性.mRNA差异显示按GenHunter RNAim-ageTM kit1说明书（GenHunter公司）进行.0.2g总RNA反转录为cDNA，在-32 P dATP存在的条件下，以5端8条随机引物和3端3条锚定引物相组合对反转录产物进行PCR扩增.PCR产物经60g・L-1 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影.选择并切取在骨肉瘤标本泳道中有而在正常骨组织标本泳道中无的差异显示条带的凝胶2 ，煮沸法回收其中的cDNA并对其进行重扩增.重扩增产物经电泳以凝胶回收试剂盒回收3 后克隆入pGEMR -T载体，用Sal和Sph双酶切鉴定插入片段的大小.采用末端标记法在PCR产物标记上-32 P dATP作探针，对上述骨肉瘤组织及正常骨组织总RNA进行打点杂交，以确认并筛选在骨肉瘤组织中表达而在正常骨组织中未见表达的序列.在上海基康生物技术公司（ABI PRISMTM ）对纯化并克隆入pGEMR -T载体的序列进行测序;在Internet网上对测序结果进行序列相似性分析，序列相似性分析工具为GenBank NCBI BLAST2.0高级版本，开放读框分析工具为NCBI ORF FINDER.确认为新序列后，递交给GenBank申请序列号. 2 结果 2.1 总RNA的纯度和完整性 紫外分光光度仪对总RNA进行定量:A260nm =1.1916，总RNA量为0.953g・L-1 .总RNA质量判定:A260nm /A280nm 比值为1.9340，表明所提骨组织总RNA质量较好.变性琼脂糖凝胶电泳结果表明总RNA较为完整（Fig1）. 图1 总RNA变性凝胶电泳图略 2.2 mRNA差异显示结果 mRNA差异显示结果清晰，条带分隔良好（Fig2）. 图2 部分mRNA差异显示结果略 2.3 差异片段克隆 从差异条带中分离回收了6条有明显表达差别的cDNA，命名为ZOL03，ZOL51，1C82，1C74，2A21及2G12.筛选的差异条带重扩增后电泳与重组克隆酶切产物电泳相一致（Fig3），表明所筛选的差异条带成功可隆入pGEMR -T载体;可看到片段大小介于150bp和500bp之间. 2.4 打点杂交分析结果 所筛选的6条差异条带均在骨肉瘤组织中表达而在正常骨组织中未见表达，说明它们确为差异表达基因片段（Fig4）. 图3 图4 略 2.5 序列测定及序列分析结果 序例测定结果显示，5端随机引物和3端锚定引物均存在，片段ZOL03长度为240bp，片段ZOL51长度为180bp，片段1C82长度为294bp，片段1C74长度为242bp，片段2A21长度为226bp，片段2G12长度为455bp.开放读框分析结果显示此6个基因片段不具开放读框.在GenBank中进行序列同源性分析，表明6个片段同源性较低，认为是新序列;其中片段ZOL03和ZOL51在GenBank中登录，接受号为BI894276和BI936370. 3 讨论 一些基因与骨肉瘤的发生发展相关4，5 ，但还知之甚少.现代分子生物学研究表明，人类基因表达的 变化处于控制生物学调节机制的中心位置6 .基因 表达水平的变化是最根本的变化，也是最敏感的变化.正常骨组织与骨肉瘤组织间存在特征性差异表达基因，因此，研究骨肉瘤不同发展阶段的基因表达变化，不仅有助于阐明骨肉瘤的发病机制，而且还能为进一步开展骨肉瘤的基因诊断和基因治疗提供重要的理论依据.可见，能否找到与骨肉瘤发生发展密切相关的一种或多种特异性或相对特异性差异表达基因，已成为制约研究骨肉瘤治疗及早期诊断的关键因素.我们以基因背景、生长环境、组织来源都完全一样的一对骨肉瘤组织和正常骨组织作为研究对象，运用差异展示PCR技术获取了6条差异表达基因片段，它们在GenBank中同源性低或无，我们还很难阐明这6个基因片段在骨肉瘤发生或发展中的具体作用，只有获取全基因序列并阐明其结构与功能，才能最终了解它们的全部意义. 参考文献: 1Li D，Su HC，Zhao JR，Fan QY，Yan XJ.Extraction of total RNA in bone tissue J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（12）:1056. 2Zhao JR，Yan XJ，Han FC，Cui DX，Hou Y，Yan QJ，Su CZ.Overexpressed gene YA61cloned from human gastric carcinoma cell SGC-7901and its sequencing J.Prog Biochem Biophys，2001;28（1）:99-101. 3Cui DX，Yan XJ，Su CZ.Differentially expressed genes in GC7901or GES-1were isolated by optimized differential display and primary clinical significance J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（7）:601-605. 4Li D，Cui DX，Su HC，Yan XJ，Fan QY.Alteration of mdm2and p53in musculoskeletal tumors and its clinical significance J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（8）:1002-1004. 5Lonardo F，Ueda T，Huvos AG.P53and MDM2alterations in osteosarcoma:correlation with clinicopathologic