《胚胎工程》PPT课件 (2).ppt

第6章 胚胎工程,本章重点,体外受精,胚胎分割,胚胎移植,性别控制,6.1.1 胚胎发育的基本过程,1.生殖细胞的发生,1）卵细胞内的生殖质决定生殖细胞的发育命运 2) 生殖细胞向生殖腺的迁移：生殖细胞迁入生殖腺后先进行几次有丝分裂，然后开始分化为精子和卵子。 3) 生殖细胞的分化 卵子发生：有两次停顿。 精子发生：精原细胞（胚胎）精母细胞四个精子。,2.受精,定义 : 精子和卵子自发融合成为受 精卵（合 子）的过程 地点: 输卵管壶腹部 时间: 排卵后24小时内 准备: 成熟的精子和卵子 （条件） 精子获能及顶体反应,精子通过子宫和输卵管时, 覆盖在其表面的精浆蛋白被去除，从而获得使卵子受精的能力，称为获能。,在体外也能完成获能，卵泡液、输卵管分泌物、血清、房水等可使精子获能。,（1）精子的成熟与获能,2.卵子的成熟与排放,（1） 卵泡细胞的成熟：卵细胞的发育过程要依赖其它细胞的协助和营养。 （2）卵子的排放与激素的影响： a. 排放：初级卵母细胞 次级卵卵细胞 +第一级体 卵细胞+第二级体 b.激素的影响：促性腺激素FSH+LH 卵泡成熟并排卵，形成黄体黄体分泌孕酮+雌激素受精卵着床,第一次减数分裂,第二次减数分裂,24h内受精,3.顶体反应 透明带反应：有精子受体蛋白。 顶体反应：精子释放顶体酶熔蚀放射冠和透明带的过程。 4.多精受精的阻断 透明带反应：精、卵结合后，透明带的结构发生变化，阻止了其它精子穿越透明带。保证了正常的单精受精。,受精过程三步曲：, 精子穿过放射冠； 精子穿过透明带； 精、卵质膜融合，细胞核融合。,3.卵裂,受精卵 卵裂 卵裂球 2 细胞期 16细胞期（桑椹胚） 30小时，输卵管 72小时，近子宫腔 内细胞群 胚泡 滋养层 第5天，子宫腔 胚泡腔,卵裂与胚泡形成（第1周）,内细胞群,2. 雌原核与雄原核融合,3. 卵裂开始,4. 2细胞期,透明带,极体,卵裂球,5. 4细胞期,6. 8细胞期,滋养层,7. 桑椹胚,胚泡腔,8. 胚泡,1. 雌原核与雄原核形成,4.囊胚的形成,卵裂的结果是分裂球形成中空的球状胚。,排卵、早期胚发生,子宫内膜,子宫肌层,子宫外膜,卵巢,发育中的卵泡,阔韧带,受精, 受精卵进行卵裂并逐渐向子宫运行,胚泡开始脱离透明带, 胚泡与子宫内膜接触准备植入, 桑椹胚进入子宫,输卵管壶腹部,卵泡破裂排卵,输卵管,子宫,着床定义 胚泡逐渐埋入子宫内膜 的过程 着床时间 受精后6-7天开始， 11-12天完成 着床部位 子宫体、子宫底,5.原肠胚的形成,形成方式有：内陷、内移、分层、内转、外包,6.中胚层用体腔的形成,7.胚层分化,初级卵黄囊 胚外中胚层 胚盘 羊膜囊,体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。它的基本原理是在人工模拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、PH等，使卵丘卵母细胞复合体的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精。,6.2.1 体外受精的研究历史,早在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术，但一直没有获得成功。 直到1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展。 现在试管小鼠、婴儿、牛、山羊、等相继出生。,6.2.2 体外受精技术,1、卵母细胞的采集和成熟培养,主要包括以下几个过程： （1）卵母细胞的采集 （2）卵母细胞的选择 （3）卵母细胞的成熟培养,掌握超数排卵和体外受精的的定义,附加说明,（1）卵母细胞的采集 1）超数排卵：是指人为注射外源促性腺激素，促使卵巢排出较正常情况下更多的成熟卵子。 a.超数排卵所用激素： 对卵巢产生作用并能引起卵的成熟和排卵的激素主要有：孕酮、雌二醇（F2），促卵泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）、促性腺激素释放激素（GnRH）,所用的外源激素除上述几种外，近年来最常用的有前列腺素（PG）及其类似物和孕马清促性腺激素（PMSG）。,PG是一类有生理活性的不饱和脂肪酸，不仅可引起子宫强烈收缩，而且还有溶解黄体的作用，黄体退化前，卵泡的发育被抑制，因此，PG可通过促进黄体消退而引起下一轮卵泡的发育和排卵。,b.超数排卵的方法： 各类激素搭配使用，FSH在动物体内的半衰期比较短，必须每日注射1到2次，连续应用5天，以后用PMSG，在发情周期的卵泡期皮下或肌肉注射一次即可。 FSH+其它激素：采用小剂量多次注射的方法，每天注射2次，连续注射3到4次。 PMSG+其它激素：由于PMSG的生物半衰期较长，因而只需注射一次。,c.影响超数排卵的因素有： 供体的年龄例如产奶年龄在3-8岁，超排效果好，超过10岁，超排的卵明显下降。 供体品种差异 激素处理的剂量：一般说来，激素剂量越大。排卵越多，但同样也要看到，过剂量的激素反应可能抑制排卵，或者影响卵的质量。 营养、季节、地域、药物质量等。,2）从活体卵巢中采集卵母细胞：借助超声波探测仪、内镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。 3）从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞：直接摘出卵巢，放入30-37度灭菌生理盐水中，快速运送到实验室。,（2）卵母细胞的选择：一般只培养A级和B级卵母细胞。 （3）卵母细胞的成熟培养： 在成熟培养基里添加胎牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成分。COC经成熟培养后,卵丘细胞层扩散,靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列,出现放射冠,通过染色体分析,卵母细胞处于第二次减数分裂中期.,2、精子的获能处理,洗涤: 在选择精子时可用上浮分离法，即在精液上面加入少量培养液，有活力的精子会游到培养液上部。收集培养液上部的精子，即可得到有活力的精子，这种方法叫做上浮法。,获能: 1）钙离子在精子获能时起关键作用，诱发顶体反应。 2）氨基多糖（GAG）来诱导精子获能，肝素是高度硫酸化的GAG，咖啡因能增强肝素的诱导作用。 3）在精子获能过程中，BSA可以降低精子顶体膜中胆固醇的浓度，有利于顶体反应。精子获能后，BSA可促进迅速穿透卵子。,3、体外受精,4、受精卵的体外培养,5、胚胎移植,选择繁殖性能强、体格健壮的母畜作为受体，进行同期发情处理，按常规方法将体外受精并发育优良的胚胎移植入受体的母畜的子宫中，使其怀孕产仔。,不懂交配养仔 9成大熊猫需要人工授精组图,开始研究大熊猫繁殖时，所有技术人员都傻眼了：由于生殖系统退化，100只大熊猫中只有78只有配种能力；即使配上种，只有3040的雌性大熊猫能成功受孕；而幼仔成活率不到40！ 不能自然交配，卧龙的饲养专家们最后只能选择通过人工授精的方式来为大熊猫家族延续后代，饲养专家们会先取成年、健康的雄性大熊猫的精液放在冷库里保存，然后通过针管注射到雌性大熊猫的阴道里，再通过体外促性腺激素的刺激，增加雌性大熊猫的受孕几率。,2002年3月7日，成都大熊猫繁育基地的雌性大熊猫“苏苏”接受了科研人员为它进行的人工授精。今年18岁的大熊猫“苏苏”已经是大熊猫中的“高龄孕妇”。据了解，大熊猫怀孕的最高年龄为19岁。,2009年12月13日，Nature杂志刊登了由深圳华大基因研究院领衔，对大熊猫基因组测序完毕。样品取自“晶晶”，大能猫有染色体21对，基因组大小为2G，重复序列含量36%，基因2万多个，经二倍体测序，证明大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒临灭绝。并发现大熊猫不喜欢吃肉主要是由于一个基因T1R1失活了，无法感觉到肉味的鲜味。,北京首例试管婴儿.jpg,妇科教授张丽珠与试管婴儿的母亲郑桂珍在一起.jpg,产科专家张丽珠教授怀抱刚出生的试管婴儿郑萌珠.jpg,1998年3月6日，中国第一例试管婴儿郑萌珠回到她的诞生地北京医科大学第三附属医院，喜度l0周岁生日。这是郑萌珠与当年主持这一尖端科研项目的张丽珠教授共切生日蛋糕。 唐师曾摄.jpg,湖北省武汉大学人民医院第四代试管婴儿出生唯一的右.jpg,徐望明教授欣喜地看着中国唯一的第四代试管婴儿小宝宝.jpg,吸取精子,显微注射,授精,移植,胚胎移植成功的羊,6.3.1 胚胎移植的概念及应用,1、概念及应用 胚胎移植（embryo transfer)也称受精卵移植，是指一头母畜（称为“供体”）发情排卵并经过配种后，在一定时间内从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或胚胎，然后把它们移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的输卵管或子宫角。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。 “借劣质动物之腹怀优秀个体之胎”,2.胚胎移植的生理基础及原则,（1）胚胎移植的生理学基础 （2）胚胎移植的基本原则,（1）胚胎移植的生理学基础,成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十数个 每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育 早期胚胎处于游离状态 胚胎发育不存在免疫问题 胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组联系 胚胎的遗传性不受受体的影响,（2）胚胎移植的基本原则,胚胎移植前后所处的环境的同一性 供体和受体在分类学上的相同属性 动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性 动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性 胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内 胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响,6.3.2 胚胎移植技术,1.供体、受体的选择 2.超数排卵 3 同步发情 4.人工受精 5.胚胎采集 6.胚胎的检查与鉴定 7.胚胎移植,胚胎移植的技术程序,1.供体和受体的选择,畜牧学选择：胚胎移植的供体一般是需要加速繁殖的生产能力较高的优良品种，供体应具有相当高的育种价值,供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健；受体则是繁殖性能较高的本地品种，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种。 兽医学选择：主要任务是排除病毒，尤其是要把那些生殖器官患有疾病的个体清理出去。 生理学选择：重点是检查超排和同期发情处理前的卵巢活性，即卵泡发育和黄体功能。,2. 超数排卵处理,利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation） 意义：让每个供体提供更多的胚胎,3.受体同期发情处理,1)前列腺素处理法：有溶黄体作用 产品：氯前列烯醇ClO、氨基丁三醇前列腺素F2 、美国普强公司的律胎素、英特威公司的保顺产 用法： 肌肉注射：容易操作，用药量较大 子宫内注射：将激素注入到母畜子宫内或阴道穹窿内，用量约为肌注的半 阴道粘膜注射：从阴道内壁刺入0.5cm左右，注入激素。用量约为肌注的半,2）孕激素处理法：对母畜施以孕酮激素类药物，在血液中保持一定量，造成人为黄体期，使卵巢内卵泡的发育和成熟受到抑制。给药的方法可以是阴道海绵栓塞、注射、口服、皮下埋植等。 阴道栓法：可靠，但成本较高 口服法：方法简单，用量不可靠 注射法：量准确，但非常麻烦 埋植法：较少应用,3）促性腺释放激素和促性腺激素类,促性腺释放激素类：LHRHA3等 促性腺激素类：PMSG（eCG)、FSH，LH、HCG（hCG） 用法：一般为肌肉注射，HCG、LHRH、LH均可在发情时静脉注射,CIDR和放栓枪,放栓,羊同期发情放栓,孕激素埋植枪,供体超排处理,4.人工受精 发情后12小时开始第一次输精，时隔12小时进行第二次输精，输精量是常规量的2倍。,5.胚胎的收集 胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布林斯特液SOF合成输卵管液 手术法收集胚胎 输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚 子宫角冲胚 非手术法收集胚胎 二路法 三路法,移胚,配种后3天的供卵巢,供体羊胚胎收集,收集到的冲洗液静置，冲洗液分离。 拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中。 胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别。,6.胚胎的检查,6天收集的胚胎（未拣）,二细胞至四细胞胚胎,手术法移植 非手术法移植,7.胚胎移植,8.供体和受体的术后观察及处理,供体和受体的抗炎处理 健康状况检查 返情状况检查 妊娠检查及妊娠确定,胚胎移植产出的犊牛,一次移入三枚胚全部成活,受体母羊与所生羔羊,所谓胚胎分割即是一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分胚甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术，也是胚胎克隆的一种方法。,6.4.1 胚胎分割方法,胚胎分割的原理 根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点，人们就考虑用这种实验技术，生产同卵双胎或多胎，以加速优良种群的繁殖。,6.4.2 分割胚胎的培养,1.分割的胚胎一般用较晚期的胚胎，因为晚期胚胎已转运到子宫内，可非手术获取，透明带不需要软化，可直接分割。 2.分割后的胚一般都要在体外做短暂培养后才移植。,6.4.3 胚胎分割目前存在产问题和发展前景,需要掌握：,1.发育阻滞的定义：在体外受精的早期胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为发育阻滞。 2.造成发育阻滞的原因：a 基因调控的转换 b 对环境敏感；c 过氧化物。 3.克服发育阻滞的方法：通过改进培养液万分和建立体细胞共同培养体系。,动物的性别控制是指通过人为干预，使动