目的基因与克隆载体的体外重组.ppt

第五章 目的基因与载体的 体外重组,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,连接时考虑因素,实验步骤尽量简单易行 连接形成的节点序列应能被重新切割 对转录、转译中密码阅读不发生干扰,粘性末端连接 平末端连接 末端延伸连接：,连接方式,同聚物加尾 加人工接头 加DNA衔接物,粘性末端连接单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,5,5,AATTC,G,5,5,5,EcoRI,粘性末端连接单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶）,BamHI,5,5,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,T4-DNA ligase,5,5,5,5,BclI,5,5,粘性末端连接双酶切产生的粘性末端的连接,5,5,EcoRI,退火,G,CCTGA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,GACTT,A,5,5,EcoRI,Bam,Bam,平末端连接,HpaI,5,GTT,CAA,AAC,TTG,5,5,5,GGG,CCC,3,T4-DNA ligase,5,5,5,5,StuI,3,平末端连接-不同粘性末端的平端连接,BamHI,5,5,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,G,ACGTC,3,T4-DNA ligase,5,5,5,5,PstI,3,T4-DNA pol,切平,5,5,G,C,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,5,粘性末端的更换,BamHI,5,5,T4-DNA ligase,Klenow,补平,GATCC,5,G,5,G,CCTAG,5,5,5,GGATC,CCTAG,5,GATCC,CTAGG,5,5,GGATCCTGCAGGATCC,CCTAGGACGTCCTAGG,5,5,PstI,CTGCAG,GACGTC,PstI linker,末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTP 随机加于DNA分子的3-OH端,AAAAAAAAAAAA OH 3,同聚物尾巴 Poly（dA）,末端延伸连接同聚物加尾,C 3,G,G,5,G 3,C,5,C,3 G,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dTTP,dATP,GTTTTTTTTTT 3,C,退火,C,3 TTTTTTTTTTG,CAAAAAAAAAA 3,G,G,3 AAAAAAAAAAC,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,S1,C,3,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,加热,末端延伸连接同聚物加尾 （平齐末端）,末端延伸连接同聚物加尾 （3突出末端）,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,Pst I,Pst I,C,3CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,Pst I,Sph I,末端延伸连接同聚物加尾 （5突出末端）,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,5 AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,Klenow,补平,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,GAATT,CTTAA 5,5,5 AATTC,TTAAG,TdT,TdT,dGTP,dCTP,GAATTGGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGGTTAAG,GGATCCCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCCCTAGG,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,5,5,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,退火,BamH I,BamH I,EcoR I,BamH I,人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面 带有一 至数个限制酶识别位点 作用：加至待克隆的平末端DNA片段两侧，酶切后 产生粘性末端,末端延伸连接人工接头加尾,CCGAATTCGG,5,GGCTTAAGCC,5,EcoR I,末端延伸连接人工接头加尾,5,5,5,5 AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,T4-DNA ligase,5,CCGAATTCGG,5,GGCTTAAGCC,EcoR I,CCG,GGCTTAA,AATTCGG,GCC,CCGAATTC,GGCTTAAG,退火,EcoR I,EcoR I,EcoR I,CCGAATTCGG,GGCTTAAGCC,DNA衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端 （与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘 性末端（与载体粘端连接）,末端延伸连接DNA衔接物加尾,CCG,5,GGCTTAA,5,EcoR I,AATTCGG,5,GCC,5,EcoR I,重组率,重组率的定义：,重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 （在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%） 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。,重组率,提高重组率的方法：,提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 10 : 1,载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：,5,5,EcoRI,5,G,CTTAA p,AATTC,G,5 p,5,5,AATTC,G,5 HO,退火,5,G-A-A-T-T-C,C-T-T-A-A G,5,G A-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,OH,HO,OH,HO,碱性磷酸酶,5,5,重组率,提高重组率的方法：,人工构建粘性末端：,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C