《菌种保藏》PPT课件.ppt

第三章 发酵工业菌种的选育、保藏与复壮,第一节 菌种选育 一、发酵工业常见微生物 （一）细菌（bacteria） 醋杆菌属（Acetobacter） 乳杆菌属（Lactobacillus） 芽孢杆菌属（Bacillus） 短杆菌属（Brevibacterium） 棒杆菌属（Corynebacterium） （二）放线菌（actinomyces） 最大的经济价值在于产生多种抗生素 链霉菌（Streptomyces） 小单孢菌属（Micromonospora）,蜡样芽孢杆菌,乳酸杆菌,（三）霉菌（mould） 1.曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger） 米曲霉（A. oryzae） 黄曲霉（A. flavus） 2.青霉属（Penicillum） 桔青霉（P. citrinum）,青霉,桔青霉,3. 根霉属（Rhizopus ） 米根霉（R. oryzae） 华根霉（R. chinensis） 4. 红曲霉属（Monascus）,（四）酵母（yeast） 酵母属（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 2.假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis） 3.毕赤酵母属（Pichia）,（五）其它微生物 1.担子菌（basidiomycetes）即菇类（mushroom） 2. 藻类（alga）,几种菌落,（六）噬菌体（phage） 危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。,二、微生物发酵工业对菌种的要求 1.生长迅速，目的产物产量高。 2.易控制培养条件，发酵周期较短。 3.抗杂菌和噬菌体的能力强。 4.不易变异和退化，不产生任何有害物质和毒素。,三、工业微生物菌种的选育 （一）自然选育 1. 自然选育的目的： （1）保持菌种优良性状的稳定性 （2）减少变异或降低变异退化的速度 （3）获得优良菌种,2.自然选育的方法 采样、增殖培养、分离培养和筛选。 （1）采样 土样（野生性菌株） 发酵液（生产性菌株）,（2）增殖培养 方法： 控制培养基成分 控制培养条件 抑制不需要的菌类 一般情况下采来的样品可以直接进行分离培养，但如果样品种所含菌类的含量不多，而有大量的杂菌时，可以通过选择性配制培养基（营养成分、添加抑制剂）、选择一定的培养条件（如培养温度、培养基的酸碱度）来控制。,分离细菌时可加入制霉菌素或放线菌酮，抑制真菌生长。G-菌时可加入结晶紫、煌绿、胆汁。培养基呈微碱性。 分离放线菌时加入植物、岩石、有机混合腐质等的浸出液作为促生因子，也可用营养贫瘠或含几丁质的琼脂培养基。 分离霉菌用低碳/氮比的培养基，再加入一定的抗生素；微酸性培养基。也可加入1：3000的玫瑰红,（3） 纯种分离 划线法：简单、快捷。 稀释法：菌落单一均匀。,接种针先以火焰灭菌法灭菌,步骤一,划线分离法：,轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却,步骤二,以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。,步骤三,更换一个新的无菌营养平板,步骤四,将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区 。,步骤五,重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。,步骤六,由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。,步骤七,重复第六以及第七步骤，由第七步骤的 第二区中划出第三区，如右上图。,步骤八,重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。,步骤九,在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。,步骤十,固体培养基的稀释涂抹接种法,需要使用的仪器震荡机,吸取准备好欲稀释的菌液,吸取充分均匀后的菌液,取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。 将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。,将试管于震荡机上，使菌液混合均匀,取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL， 加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。 重复此步骤直至所需要的稀释浓度。,从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内。,将三角玻璃棒浸于酒精中,将三角玻璃棒在火焰上燃烧 （须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）,使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。,（4） 生产性能的测定 一般采用两步法： 初筛：以量为主 复筛：以质为主,初筛： 通过表现形态来淘汰不良菌株 从菌落的大小、生长速度、颜色、孢子形成等形态特征分析判断，去除可能低产的菌落，而将高产性菌落分离、筛选出来。使琼脂平板培养基上的主要菌落占90%以上。,复筛 经过分离培养，在平板上出现 很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。 复筛的菌种应及时保存，避免过多传代而造成新的退化。,a.通过目的代谢产物的考察 通过摇瓶培养进行复筛，以进一步考察菌种的生产能力的稳定性。 b.传代的稳定性试验 随着菌种的逐级扩大，经过多次传代产量仍保持稳定的菌种才能用于生产。 在传代过程中要保持试验条件的一致性，以便能正确的反应各代间生产能力的差异。,（二）诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变，从而获得高生产能力的菌种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。,诱变剂的种类,物理：紫外线，快中子,化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,1.诱变育种的主要环节 （1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液 诱变 （2）用合适的方法淘汰负效应变异株， 选出性能优良的正变异株筛选,2.诱变处理的基本方法 1）诱变剂的选择 （1）诱变剂选择的原则： 根据实际操作方便； 采用已成功的经验； 考虑诱变剂的作用机制，选择不同的方法。 如紫外线作用于DNA分子的嘧啶上，而亚硝酸作用于DNA分子的嘌呤上，二者混合使用可使突变谱增宽，但需经过多次分离纯化才可获得稳定的变异株。,（2）诱变剂剂量的选择： 能够提高正变异幅度的诱变剂量,称为诱变剂最适剂量 一般选用致死量达70-80%的剂量。 不稳定的菌株，选用缓和诱变因子和低诱变剂量。稳定的菌株选用强诱变剂和高诱变剂量。 （3）增效（变）剂 把与诱变剂混合使用后提高诱变率的化学物质，称为诱变增效剂。 一般常用的有氯化锂、乙烯亚胺、重金属离子、咖啡因、氨基酸等,2）诱变的程序 出发菌株 用来进行诱变育种试验的原始菌种。,出发菌株,菌种纯化,制备斜面孢子和菌落,单细胞或单孢子悬液,诱变剂处理,平板涂布,变异菌株斜面培养,斜面传代,放大实验,菌种用于生产、保藏,性能精测,性能粗测,形态变异观察,处理液活菌计数,悬浮液活菌计数,3）物理诱变 （1）制备单细胞或单孢子悬浮液 a.单细胞悬浮液（细菌、酵母）： 菌种移种到新鲜肉汤培养基中进行培养，以获得分散且生长活跃的菌体 。 b.单孢子悬浮液（霉菌、放线菌）： 将琼脂斜面培养基上的孢子用适当稀释液洗脱下来，并用玻璃珠或石英砂振荡打散孢子，用滤纸或棉花过滤，对某些黏性大的加入0.05%分散剂（如Tween 80)。 c.制成的单细胞或单孢子悬液含菌量： 细菌和放线菌10ml,霉菌和酵母106/ml;,（2）照射,5ml单细胞 单孢子悬液,15w紫外线,30cm照射,预热 20min,暗室、红光,繁殖体3-5min,芽胞10min,具有光复活性的微生物，利用致死剂量的紫外线与日光（300-500w灯光）反复交替照射。 紫外线照射时间应不短于10-20秒，不长于10-20分,4）化学诱变(以亚硝酸盐为例） (见P25） (1)处理真菌 药物浓度0.025mol/l,2ml孢子悬液,1ml0.1mol/lNaNO2,1ml醋酸缓冲液,2710min,2ml处理液,10ml0.07mol/l pH8.6Na2HPO4,加入,下降至pH6.8,终止诱变,稀释平板分离,挑取单个菌落、筛选,每种诱变剂处理的时间需做多次试验确定,出发菌株,5ml肉汤培养基,离心收集菌体,（2）处理细菌 药物浓度0.05mol/l,无菌生理盐水洗涤、离心,菌体悬浮于2.5ml0.1mol/l 醋酸缓冲液(Ph4.5),375min,终止诱变,稀释平板分离,挑取单个菌落、筛选,37振荡培养,+,2.5ml0.1mol/lNaNO2,设计或采用高效筛选方案或方法,（三）微生物杂交育种 是指两个基因型不同的菌株通 过吻合（接合）使遗传物质重新组 合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。 1.杂交育种使用的培养基： 完全培养基 P29 基本培养基 有限培养基 补充培养基（鉴别培养基） 2.杂交育种的方法（以青霉菌为例）,亲本菌株,亲本菌株,液体培养基,诱变处理,亲本型二倍体 重组型二倍体,重组离子二倍体,二倍体分离,二倍体,樟脑熏蒸,紫外线,提高培养温度,菌丝碎片长出菌丝,基本培养基,1-2d,菌丝体,7d,在一条菌丝里含有二个遗传特性不同的细胞核，共同生活在均以的细胞质里，能够互补营养，因此在基本培养基上能生长,异核体 形成,杂合二倍 体形成,染色体交换 和单倍化,遗传 标记,细胞A,细胞B,原生质体发生融合,加入10%的聚乙二醇,原生质体A,原生质体B,长出菌落,涂在细胞壁再生的培养基上(P33),检查出重组合子的菌落,（四）原生质体融合 通过酶解作用将两个亲株细胞的细 胞壁去除，制成原生质体，再用聚乙二 醇（PEG)促进原生质融合，从而获得异 核体或重组合子，这一技术称为原生质体融合。,用脱壁酶处理除去细胞壁,（五）基因工程技术 是一种DNA体外重组技术。 是在分子水平上根据需要用人工的方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体上，再转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译，表现除供体基因原有的遗传性状。,基本程序： （1）含目的基因DNA片段的制备 （2）选择合适的载体DNA （3）带有目的基因的DNA片段与载体连接 （4）将重组的DNA分子转入受体细胞，在受 体细胞内增扩。 （5）筛选出带有重组DNA分子的转化细胞 （6）表达、鉴定外源基因的表达产物,第二节 菌种保藏与复壮,一、菌种保藏 （一）生产菌种应具备的条件 （1）菌株有稳定的遗传性 （遗传性稳定） （2）在相当长的一段时间内菌株易于保存 （易保存） （3）菌株必须容易产生许多营养细胞和孢子（生长迅速） （4）菌株接入种子罐后能迅速旺盛的生长 （适应性强） （5）菌种必须是纯培养物 （纯培养） （6）菌株最好本身具有抗污染的能力 （抗污染） （7）菌株应能受诱变剂的作用而发生突变 （易诱变）,（二）菌种保藏的方法 1.低温保藏法 将斜面种子、液态种子、斜面孢子以及用麸皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子放在4冰箱内保存。适用于细菌、酵母、霉菌、放线菌等。 优点：方法简单、操作方便 缺点：保存期较短，一般1-2月；易变异,2.低温定期移植法 将菌株接种于合适斜面培养基上，待生长好后置于4冰箱保藏，每隔3-6个月移接培养后继续保藏。适用于细菌、酵母。 优点：方法简单，存活率高，易于推广； 缺点：保存时间不长，而且传代多，因此菌种容易产生变异。,3、石蜡油封保藏法 适于保存部分酵母、细菌，对某些能 同化烃类的微生物则不适用。,菌种接种于 琼脂斜面,琼脂斜面 培养物,加入灭菌液体石蜡高出琼脂1cm,无菌操作,-4至4 保藏,适温培养 一定时间,优点：操作简便，保存时间较长，一般可长达l年以上。 注意：a.琼脂柱斜面不宜过长 b.石蜡油灭菌时不能留有水分 c.在加液体石蜡要求严格的无菌操作,5、砂土管保藏法 适用于细菌的芽孢、霉菌和放线 菌孢子的保藏，不适于对干燥敏感的 无芽孢的细菌和酵母菌。 将孢子悬浮液转移至灭过菌的砂土管中，于真空干燥器内用真空泵抽干，再转至有干燥剂的容器中，密封低温保藏。本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。 主要包括砂土（河沙：土壤=3：2或1：1）制备和真空抽干两步。,河（海）沙过筛、 浸泡、洗涤,菜园土过筛与沙混合 沙：土3：2或1：1,小试管分装1cm、灭菌,斜面培养物用无菌水制成孢子悬液106/ml,无菌加入1ml 孢子悬液,混匀,真空干燥器内干燥,管口熔封、低温保存,6、真空冷冻干燥法 适用于细菌（有芽孢和无芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放线菌孢子和病毒等。 此法的原理是在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异和死亡，因而能长期保存，微生物在此条件下易死亡，所以需加入一些物质作保护剂，一般常用的是脱脂牛奶、血清等。 优点：该法存活率高，变异率低，应用广泛，保存时间长，一般为5-10年。 缺点：是手续麻烦，操作复杂，要求严格，并需有一定设备条件。,安培瓶准备,菌种用脱脂乳制成悬液 （108-1010/ml）,火焰熔封管口,低温、真空干燥 （水分达1-3%）,-30-40 20-60min,冷藏或冷冻保藏,-30以下的低温干燥箱，真空度达66Pa,缓慢升温干燥,菌种呈酥块或松散片状,7、液氮超低温保存 大多数病毒、噬菌体、立克次 氏体、放线菌、支原体、霉菌、酵 母、细菌、藻类和原虫，特别是冷 冻真空干燥法无法保存的微生物。 把将要保存的菌种（菌液或琼脂块）置于10%甘油等保护剂中，密封于安培瓶内，先将菌液降至0，再以每分钟降低1的速度降至-35 ，然后将安培瓶放入液氮瓶中保存（-150 以下达-196 ）,（三）保存菌种的注意事项 1.菌种保藏前所处的状态 （1）休眠体（如孢子或芽胞） （2）新鲜的、生长良好的斜面培养物 2.菌种保藏所用的基质 （1）斜面培养基碳源比例较低 （2）保藏所用基质应不含其他有机物质 （3）保护剂灭菌时防止有害物质的产生 3.防止操作过程中对细胞结构的损害 （1）加入保护剂 （2）冷冻时防止形成冰晶,二、菌种的复壮 （一）菌种的提纯 1.退化不严重时用划线分离法或稀释分离法 2.退化严重时用单细胞分离法 （1）在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。 （2）用特制的毛细管用显微镜在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。,（二）菌种复壮 1.淘汰已衰退的个体 2.选择合适的培养基 3.通过寄生体复壮,第三节 国内外主要的菌种保藏机构 一、国内菌种保藏机构,1.中国典型培养物保藏中心 简 称：CCTCC 所 在 地：武汉大学 邮 编：武汉430072 保存范围：专利菌种,2.普通微生物菌种保藏中心 简 称：CCGMC 所 在 地：中国科学院微生物研究所（北京） 中国科学院病毒研究所（武汉） 邮 编：北京100080 武汉430071 保存范围：真菌、细菌、病毒,3.农业微生物菌种保藏中心 简 称