给生物制药的复习

生物制药 陈一楠绪论一、概念生物药物（Biological medicinal products）生物制药（Biopharmaceuticals）1.药物指用来预防、治疗和诊断或用于调节机体生理功能，促进机体康复、保健的物质。药物一般可分为预防药、治疗药、诊断药和保健药，有些药物同时具有预防、治疗和保健作用。常见药物有三大类：化学药物、生物药物、中草药2.生物药物是指利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法进行加工、制造而成的一大类预防、诊断、治疗疾病的制品。3.广义的生物药物包括从动物、植物、微生物等生物体中制取的以及运用现代生物技术产生的各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。包括：天然生化药物、生物制品、生物技术药物（1）天然生化药物：指天然存在于生物体（动物、植物、微生物和海洋生物），通过提取、分离、纯化获得的药理有效成分。其化学本质多数已比较清楚，故一般按其化学本质和药理作用进行分类和命名。分为氨基酸类药物、多肽和蛋白质类药物、酶和辅酶类药物、核酸及其降解物和衍生物、多糖类药物、脂类药物、细胞生长因子与组织制剂等。（2）生物制品：预防用制品-主要指各种疫苗（如卡介苗、甲肝疫苗、白喉类毒素）；治疗用制品-特异性治疗用品（如狂犬病免疫球蛋白）和非特异性治疗用品（白蛋白）；诊断用制品-免疫诊断用品如结核菌素单克隆抗体（3）生物技术药物：基因重组药物-通过基因重组方法获得的各种生物活性蛋白质、多肽及其修饰物、抗体、疫苗、连接蛋白、嵌合蛋白、显性阴性蛋白、可溶性受体等；基因药物-治疗基因，反义药物和核酶等。广义生物技术药物的一般概念：利用生物技术生产的在生物体内存在的天然活性物质。生物技术，包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程、微生物发酵工程、生物电子工程、生物信息技术与生物芯片、生物材料、生物反应器、大规模蛋白纯化技术制备技术等。天然活性物质，即生物技术药物的来源是细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等各种生物内的特征细胞产物。广义生物技术药物：从血液中提取的多克隆抗体、凝血因子；用微生物发酵生产的抗生素如青霉素；用生物技术生产的人用兽用疫苗如流感疫苗、甲肝疫苗等；从动物、植物、微生物或海洋生物中提取的活性物质，如从猪胰中提取的胰岛素，从红豆杉中提取的紫杉醇等。更广义的生物技术药物利用现代生物技术发现、筛选或生产得到的药物。包括利用生物技术作为发现药物的研究工具（drug discovery research tool）而发现的小分子药物，如基因敲除技术或高通量药物筛选技术等确定药物靶标，筛选得到的小分子药物；包括利用生物技术作为药物生产新技术（new process technology）的药物。新生物技术药物（New Biotech Drug）：脂质体包埋的两性霉素Abelcet；三氧化砷（Trisenox）注射液；化学合成多肽FUZBON；4.狭义的生物技术药物利用基因工程、抗体工程或细胞工程技术生产的源自生物体内的天然物质，用于体内诊断、治疗或预防的药物。二、特征生物技术药物产品的来源：包括细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物等各种表达系统得到的特征细胞产物。生物技术药物的适应症：人体内诊断药物、治疗药物或预防药物生物技术药物的活性物质：蛋白质或多肽，蛋白多肽类似物或衍生物，由蛋白多肽组成的药物产品。生物技术药物的主要生产技术：基因工程技术，抗体工程技术，细胞工程技术生物药物的特性1、药理学特性（1）治疗的针对性强、疗效高（2）营养价值高、毒副作用小（3）免疫性副作用常有发生2、原料的生物学特性（1）原料中有效成分含量低，杂质多（2）原料的多样性（3）原料的易腐败性3、生产制备的特殊性4、检验的特殊性5、剂型要求的特殊性三、生物药物的分类1、按照药物的化学本质和化学特性分类（1）氨基酸类药物及其衍生物：单一氨基酸制剂-如胱氨酸用于抗过敏、肝炎及白细胞减少症；蛋氨酸用于防治肝炎、肝坏死、脂肪肝；谷氨酸用于肝昏迷、神经衰弱和癫痫等复方氨基酸制剂-由多种单一纯品氨基酸按比例配制而成,并添加高能物质、维生素、糖和电解质等，可作为血浆代用品；要素膳（2）多肽和蛋白质类药物：多肽-在生物体内浓度很低，但活性很强，如催产素、加压素、ACTH等蛋白质类药物-有单纯蛋白质（如人白蛋白、人丙种球蛋白、胰岛素、生长素等）与结合蛋白类（促甲状腺激素、人绒毛膜促性腺激素等）细胞生长因子-不是细胞营养成分，对细胞生长有调节作用，如NGF、EGF、PGF、CSF、EPO等（3）酶类药物：助消化的酶类-如胃蛋白酶、胰酶、纤维素酶、麦芽淀粉酶等消炎酶-如弹性蛋白酶、激肽释放酶、尿激酶、纤溶酶等心血管疾病的治疗酶-如弹性蛋白酶、激肽释放酶、尿激酶、纤溶酶等抗肿瘤类-L-门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶等其他酶类-SOD、PEG-腺苷脱氨酶、DNA酶和RNA酶、细胞色素C辅酶类药物-NAD、NADP、FMN、FAD、辅酶Q10、辅酶A（4）核酸及其降解物和衍生物：核酸类-猪、牛肝提取的RNA制品对治疗慢性肝炎、肝硬化和改善肝癌症状有一定疗效多聚核苷酸-多聚胞苷酸、多聚次黄苷酸等是干扰素诱导剂，用于抗病毒、抗肿瘤核苷、核苷酸及其衍生物-如混合核苷酸、混合脱氧核苷酸注射液等，经人工化学修饰的核苷酸常用于治疗肿瘤和病毒感染（5）多糖类药物：多糖类药物在抗凝、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力可抗衰老方面具有较强的药理活性。如肝素有很强的抗凝作用，小分子肝素有降血脂、防治冠心病的作用；胎盘脂多糖是一种促B淋巴细胞分裂剂，能增强机体免疫力。（6）维生素与辅酶：是一类必须由食物提供的小分子化合物，不为机体提供能量，但对机体代谢有调节整合作用（7）脂类药物：磷脂类-脑磷脂、卵磷脂多用于肝病、冠心病和神经衰弱多价不饱和脂肪酸和前列腺素-亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等有降血脂、降血压、抗脂肪肝作用，前列腺素是一大类含五元环的不饱和脂肪酸胆酸类-去氧胆酸可治胆囊炎固醇类-主要有胆固醇、麦角固醇和-谷固醇，可降低血胆固醇卟啉类-原卟啉、血卟啉用于治疗肝炎和肿瘤，血红素是食品添加剂，胆红素是人工牛黄的重要成分（人工牛黄是由胆固醇、胆红素、胆酸和一些无机盐、淀粉混合而成的复方制剂，具有清热、解毒、抗惊厥、祛痰、抗菌作用）2、按原料来源分类 人体组织来源的生物药物 动物组织来源的生物药物 微生物来源的生物药物 植物来源的生物药物 海洋生物来源的生物药物3、按功能用途分类 治疗药物 预防药物 诊断药物 其他用途四、现代生物技术的基础学科和分支：六、主讲内容现代生物制药技术概论微生物制药动物及植物细胞制药基因工程制药抗体工程制药酶工程制药生物技术药物的研发与生产的管理广义生物制药参考资料吴梧桐主编. 生物技术药物学. 高等教育出版社，2002朱宝泉主编. 生物制药技术. 化学工业出版社，2004甄永苏等主编.现代生物技术制药丛书（共10册）. 化学工业出版社，20022003 第一章现代生物制药技术概论了解医药生物技术的发展历史了解国际、国内生物技术药物的市场现状和研究 现状了解几类主要生物技术药物的特点了解现代医药生物技术的主要研究方向 一、生物制药发展历史1、传统生物技术阶段公元前6000年古代巴比伦人酿造啤酒、公元前4000年埃及人发酵面包我国殷朝 制酱、周朝 制醋特点:自然发酵、全凭经验神农最早应用生物材料作为治疗药物，用厣（包括甲状腺的头部肌肉）治疗甲状腺肿大，用紫河车（胎盘）作强壮剂，用鸡内金止遗尿及消食健胃；10世纪，民间使用天花患者衣服预防天花；秋石治病，出自11世纪沈括所著的 沈存中良方 ；明代李时珍的本草纲目等。1860年荷兰微生物学家列文虎克发明显微镜发现了微生物、1865年法国科学家巴斯德证明了发酵原理、1928年英国 Fleming发现青霉素、1940年英国弗洛里、钱恩分离出青霉素20世纪40年代，抗生素工业化生产，发现和提纯了肾上腺皮质激素和脑垂体激素；50年代，发酵法生产氨基酸类药物；60年代，从生物体分离、纯化酶制剂及技术日趋成熟；80年代，生化药品有350多种；90年代，生化药品500多种，临床诊断试剂100多种。2、近代生物技术阶段（1）英国细菌学家弗莱明：1928年弗莱明发现青霉菌的抑菌现象，并证实青霉菌的分泌物具有强大的杀菌能力。青霉素的杀菌作用：青霉素对动物无毒性，对人体白血球也无毒性。给几位患者做试验，尽管其含量很低，效果却非常明显。遗憾的是，弗莱明没有浓缩青霉素的技术。而医学界此时正把眼光集中在刚刚问世的磺胺制剂上，没有更多的人注意青霉素的诞生。在此后10年中青霉素一直躺在实验室中，未能走入临床。（2）英国生物化学家，1945年诺贝尔生理学或医学奖得主钱恩：第二次世界大战爆发，传染病又一次在欧洲肆虐。钱恩和弗洛里在浩瀚文海中找到了弗莱明9年前发表的论文，开始研究青霉素。钱恩和弗洛里从青霉菌培养一星期后的溶液提取得到了一种性质稳定的化学物质。用这种青霉素注射到老鼠体内，老鼠依然活蹦乱跳。1941年2月12日他们用青霉素治疗了一位因脸部刮伤而感染的警官，2天后，病人病情稳定。1942年冬，第二次世界大战正打得难分难解之际，英国首相邱吉尔突然患肺炎，医生决定用青霉素治疗，结果没几天邱吉尔就康复了。青霉素从此名声大振。青霉素在美国得到大规模的工业化生产，在第二次世界大战的军队中投入使用，挽救了许多病人和伤员的生命，其临床效果得到了充分肯定。1945年，青霉素的发现者弗莱明和青霉素生产技术的发明者钱恩和弗洛里博士一起获诺贝尔生理学医学奖。（3）来自土壤的结核菌克星链霉素：19391943年，俄裔美国微生物学家瓦克斯曼和助手们共从土壤中分离出10000株放线菌，发现其中有一种丝状微生物链霉菌属的提取物能够对结核杆菌和其它多种革兰氏阴性杆菌产生抑制作用，而且毒副作用较小。瓦克斯曼为后人寻找新抗生素奠定了方向，由此荣获1952年诺贝尔生理学或医学奖。抗生素（antibiotics）是瓦克斯曼于1941年首次提出并使用的，指的是在其代谢过程中能产生杀灭或抑制其它种生物（真菌、放线菌或细菌等微生物）作用的化学物质。自青霉素以后，抗生素的研究与生产迅速发展。至今为止，人们发现和发明的抗生素已有几千种，常用的不到百种。每种抗生素都有一定的抗菌范围，每种抗生素都不是万能的。3、现代生物技术阶段（1）J.D.Watson & F.H.C.Crick：1953年4月25日，英国自然杂志发表了沃森和克立克的文章“核酸的分子结构 DNA的一个结构模型”。标志着DNA双螺旋结构的建立，从此，遗传学和生物学的历史从细胞阶段进入了分子阶段。（2）F.Sanger & W.Gilbert： 桑格（英国化学家）最早测定胰岛素的氨基酸顺序获得1958年诺贝尔化奖。22年后，他因测定了一种噬菌体的一级结构获1980年的诺贝尔化学奖。吉尔伯特在DNA测序领域，因其卓越的工作获得1980年诺贝尔化学奖。（3）Paul.Berg： 伯格（美国生物化学家）通过把两个不同来源的DNA连结在一起并发挥其应有的生物学功能，证明了完全可以在体外对基因进行操作。他作为“重组DNA技术之父”于1980年获诺贝尔化学奖。（4）Kary.B.Mullis：1985年穆利斯发明了高效复制DNA片段的聚和酶链式反应（PCR）技术，利用该技术可从极其微量的样品中大量生产DNA分子，使基因工程获得了革命性发展。二、生物技术药物的市场现状和研究现状（一）生物制药涛头弄潮 近20年来，国际生物技术飞跃发展，特别是基因操作技术、生物治疗技术、转基因动植物技术、人类和其他生命体基因组工程、基因治疗技术、蛋白质工程技术、生物信息技术、生物芯片技术等发展较快。 生物技术的创新正在带动着生物技术巨大产业的发展，它包括：基因药物、重组疫苗、生物芯片、生物反应器、基因工程抗体、基因治疗与细胞治疗、组织工程、转基因农作物、兽用生物制品、生物技术饲料、胚胎移植工程、基因工程微生物农药、环保、海洋生物技术，以及现代生物技术对发酵、制药、轻工食品等传统产业的改造。1.国际上生物技术领域已取得的研究成果中60%以上是医药领域的；2.各国对生物技术的投资80%以上集中在医学生物技术领域；3.生物技术研究开发的60-80%的力量主要集中在医学领域；生物制药已经成为朝阳产业中的“朝阳”，突出表现在：4.总销售额超过10亿美元的生物技术产品主要为医药生物制品；5.美国1300多家生物技术公司的60%以上，欧洲800多家生物技术公司中近80%集中在医药领域；6.生物制药市场资本总额达3500亿美元，主要生物技术药品有红细胞生成素、胰岛素、干扰素等，年销售额均在10亿美元左右。7.美国FDA正式批准上市的已有117种生物技术药物用于治疗各种疑难病和常见病，仅2001年上半年就批准了27种；8.处于临床研究阶段的有1000多种；9.近20年来，生物技术制药占国际药物和生物制品的份额逐年递增，到2002年已达到13%。（二）我国生物制药产业发展现状1.1986年启动“863”高技术研究计划，确立生物技术制药产业为优先发展和扶持重点。近15年来，我国有617家从事生物技术的公司，其中有81家从事生物技术药物的生产；至1998年已有14个基因工程药物，3个基因工程疫苗和数十个基因重组诊断试剂投放市场；另有26种基因工程药物处于临床试验；2. 1997年中国生物技术药品市场规模超过30亿元，专家预测，2005年将达到300亿元；3.基因工程制药产业发展迅猛，基因工程药物与疫苗的销售额1996年2.2亿元，2000年则高达22.8亿元，平均每年增长79.42%。4.1999年我国生物制药行业的盈利约为12亿元，2000年全国生物制药业的盈利达到25亿元。预计在今后几年，生物制药业将会保持2030%的年增长速度，到2005年利润将达4048亿元。（三）影响我国生物制药产业发展的主要因素1.研发投入：国外：23亿美元/基因药物；国内：10多年来，对生物制药的总投入仅有40多亿元2.投融资与产业化模式：国外：政府、企业、科研院所三位一体，大、中小企业结成战略联盟创投基金（风险资金）体系相对成熟；国内：政府、企业、科研院所各自为政或偶尔两两结合投融资机制不健全3.市场竞争环境：国外：市场竞争激烈，但秩序较好，市场份额多为大公司所垄断；国内：仿制与重复建设、重复生产现象非常严重，出现了一哄而上的过热现象，市场恶性竞争，无法实现规模效益4.产品信誉：国外：产品信誉较好；国内：产品信誉低，“出现信洋不信中，买洋不买中”现象5.创新与知识产权：国外：创新意识高，特别注重知识产权（主要是专利、商标）保护；国内：创新意识低，严重缺乏自主知识产权产品，当前，我国已产业化的21种基因工程药物和疫苗中只有3种拥有自主知识产权，其他均为仿制产品三、生物技术药物的主要品种类型1、细胞因子干扰素类：主要有干扰素、干扰素、干扰素2、细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子：临床应用的有IL-2和突变型IL-2，肿瘤坏死因子有TNF-和TNF受体3、造血系统生长因子类：G-CSF、M-CSF、GM-CSF、EPO、TPO等4、生长因子类：IGF、EGF、PDGF、NGF及各种神经营养因子5、重组蛋白质与多肽类激素：Humulin、rhGH、FSH、LH、HCG等6、心血管病治疗剂与酶制剂：主要有水蛭素、尿激酶、链激酶、SOD等7、重组疫苗与单抗制品：重组乙肝表面抗原疫苗（酵母）、乙肝基因疫苗、艾滋疫苗、肿瘤疫苗等8、基因药物：基因药物是指应用于基因治疗的目的DNA片断重组物，用于遗传性疾病、肿瘤、艾滋病、囊性纤维变性、糖尿病和心血管病等的治疗四、生物技术药物主要涉及医疗领域肿瘤：Herceptin可缓解转移性乳腺癌病情和使肿瘤缩小；Rituxan用于非何杰金氏白血病；Panorex用于治疗结、直肠癌神经退化性疾病：如老年痴呆、帕金森病、脑中风及脊椎外伤等疾病，GDNF、NGF、BDNF自身免疫性疾病：如哮喘（人源化单抗免疫球蛋白-E）、风湿性关节炎（TNF-）及红斑狼疮（LJP394）等；人体器官移植，ortho OKT-3和zenapex心血管疾病：如冠心病的防治(单抗及基因治疗)，脑卒中的防治(重组tPA)病毒感染性疾病：FluMist是一种鼻内用流感疫苗，CytoGam可预防巨细胞病毒感染，Preveon是一种口服逆转录酶制剂基因治疗和转基因技术：基因治疗用于治疗肿瘤、肝炎、艾滋病、老年痴呆、帕金森病和遗传性疾病，如NIH发现p53肿瘤抑制基因。转基因技术用于构造转基因动、植物，生产生物药物已进入产业化五、生物技术药物研究新进展1、与疾病相关基因的发现，将促进并加快新型生物药物开发2、新型疫苗的研制：如肥胖症、肿瘤、艾滋病等3、基因工程活性肽的生产：用基因工程技术制备的具有生物活性的多肽称为基因工程活性肽。4、蛋白质工程药物的开发：改善重组蛋白产品的稳定性，提高活性，延长在体内的半衰期，提高生物利用度，降低免疫原性等5、新的高效表达系统的研究与开发：多在E.coli、CHO、幼仓鼠和酿酒酵母中表达，正在改进的重组表达系统有真菌、昆虫细胞和转基因动植物6、生物药物新剂型的研究：如埋植型缓释注射剂和非注射剂型7、医药产业的其他方面将不断被改造和发展：预防性基因治疗；“转基因药材”；利用转血红蛋白基因的烟草植物大量生产人造血浆第二章 微生物制药44一、微生物药物的几个相关基本概念二、微生物药物的分类三、微生物药物的应用四、药源微生物及微生物药物的筛选技术五、微生物药物的发酵生产技术六、微生物药物的分离、精制和鉴别七、废弃的综合利用和环境保护广义微生物药物能以极低浓度有选择地抑制和影响其他生物机能的微生物或微生物的代谢物。狭义微生物药物微生物在其生命活动过程中产生的，能以极低浓度选择地抑制或影响其他生物机能的低分子量的代谢物。一、微生物药物的几个相关基本概念1、最小抑制浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）药物活性测定常用的参数。定义为在经过一个适当时间后，指示生物没有生长或生物分子失去活性的最小药物浓度。MIC50半抑制浓度，即抑制50活性的最小抑制浓度值。测定方法：向接种了测试菌（103106个/ml）的培养基中添加浓度逐渐降低（减半稀释）的待测药物，能够完全抑制活性的最低浓度即为MIC，用mg/ml表示。试管/微孔培养板、液体/固体培养基2、抑制谱：药物能够选择性抑制/影响（即MIC值较低）的生物或生物分子的范围。不同的药物抑制谱的差别很大。药敏实验抑菌圈与MIC的关系3、药物活性:药物对病原体作用的强弱。一般可用体外和体内两种方法来测定。体外试验对于临床用药具有重要的指导意义。药物活性用效价单位表示。效价单位定义为每ml或每mg测试药物中所含某种有效成分的多少。4、毒性: 药物对宿主生物细胞的抑制或杀死作用，通常用半致死剂量（lethal dose，LD50）表示。5、化疗指数: 判断一种药物的安全性和有效性的综合指标。6、抑制曲线：药物对作用对象的抑制活性随时间变化的曲线。7、药物敏感性：药物对其所作用的对象的抑制活性的高低。要求操作流程严格标准化。8、药物的相互作用：累加作用（相互无关）；协同作用（相互促进）；拮抗作用（相互抑制）二、微生物药物的分类1、根据产生药物的生物来源进行分类放线菌产生的抗生素：链霉素；四环素；红霉素等真菌产生的抗生素：青霉素、头孢霉素等细菌产生的抗生素：多粘菌素等植物或动物的抗生素：被子植物蒜中制得的蒜素；从动物脏器中制得的鱼素等。2、根据药物的作用对象进行分类广谱抗菌药物：氨苄青霉素、氯霉素、红霉素抗革兰氏阳性菌药物：青霉素抗革兰氏阴性菌药物：链霉素抗真菌药物：制霉菌素、放线菌酮抗病毒药物：霉素、四环类抗生素抗肿瘤药物：丝裂霉素、阿霉素抗原虫、昆虫药物：嘌呤霉素、巴龙霉素除草剂：杀草霉素、双丙氨膦酶抑制剂：氨肽酶A、B抑制剂、碱性磷酸酶抑制剂免疫调节剂：环孢霉素、FK5063、根据抗生素的化学结构分类内酰胺类抗生素：头孢霉素、青霉素氨基糖苷类的抗生素：链霉素、庆大霉素大环内酯类的抗生素：红霉素、麦迪霉素四环类抗生素：四环素、土霉素多肽类抗生素：多粘菌素、杆菌肽蒽环类抗生素：阿霉素、柔红霉素喹诺酮类抗生素：环丙沙星、诺氟沙星4、根据抗生素的作用机制分类抑制细胞壁合成的抗生素：头孢霉素、青霉素影响细胞膜功能的抗生素：多烯类抗生素抑制病原菌蛋白质合成的抗生素：四环素抑制核酸合成的抗生素：丝裂霉素C抑制生物能作用的抗生素：抗霉素5、根据抗生素的生物合成途径分类氨基酸、肽类衍生物：头孢霉素、青霉素糖类衍生物：链霉素以乙酸、丙酸为单位的衍生物：红霉素三、微生物药物的应用1、治疗疾病选用药物需要考虑的因素：抑制谱、毒副作用、药代动力学、流行病学和耐药性、联合用药（1）控制细菌感染性疾病；（2）抑制肿瘤生长；（3）调节人体生理功能；（4）器官移植；（5）控制病毒性感染2、预防疾病：谨慎运用预防药物，尤其是抗菌药物。3、其他应用领域畜牧业上的应用禽畜感染性疾病控制，用作饲料添加剂农业上的应用植物保护，促进或抑制植物生长食品保藏中的应用罐装食物的防腐剂工业上的应用防霉，提高特定发酵产物的产量作为研究工具的应用生物化学和分子生物学的研究工具， 建立药物筛选与评价模型等四、药源微生物及微生物药物的筛选技术新微生物药物的筛选流程天然的微生物药物是微生物的次级代谢产物。l 次级代谢产物的合成在微生物不同类群中的分布是普遍的，但不是随机的，有些菌类群的产物较多；l 能够较为丰富的产生次级代谢产物的细菌通常是那些具有细胞分化能力的类群；l 在不同属、同属不同种、同种不同菌株之间，产生次级代谢产物的能力和代谢产物的种类是不同的；l 某种生物活性次级代谢产物的合成与菌株生活的生态环境可能有密切的联系；l 土壤是微生物的大本营，也是分离生物活性代谢物的良好资源；l 在一些新的微生物类群，即研究较少的类群种分离新型活性代谢产物的可能性要大得多；l 极端环境，或特异环境下生活的微生物往往可以产生一些新奇作用机制或化学结构的次级代谢物。（一）微生物药物的产生菌：主要包括放线菌、真细菌和丝状真菌等。1、放线菌：应用于临床的微生物药物大部分来源于放线菌的次级代谢产物。放线菌产生的抗菌药物中化学类别较多。（1）抗菌药物产生菌：-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、紫霉素类、糖肽类、多烯类、其他抗细菌抗生素主要是抗细菌抗生素，有抗G+和G-细菌活性，抑制细菌细胞壁合成。具有广谱抗细菌活性，临床应用多。抑制细菌蛋白质合成。产生菌主要为链霉菌属和小单孢菌属。具有广谱的抗细菌活性。作用于细菌的蛋白质合成。产生菌均为链霉菌。大环内酯类抗生素的产生菌均为链霉菌。主要抗G+细菌，对军团菌、支原体、衣原体有抗菌作用。阻断蛋白质的合成。多烯类抗生素产生菌主要是链霉菌，作用于真菌，能与真菌细胞膜中的固醇结合，使膜受损，影响细胞正常代谢，导致细胞死亡。（2）抗肿瘤药物产生菌：蒽环类、糖肽类、色霉素类、烯二炔类、丝裂烷类、其他抗肿瘤抗生素（3）其他药物产生菌2、细菌3、真菌：真菌是第一个应用于临床的抗生素青霉素的产生菌，并从此进入了抗菌治疗中的抗生素时代。4、其他药物产生菌（二）新药产生菌的分离1、土壤微生物的分离：土壤是微生物的重要栖息地。（1）采集样品：分离放线菌的样品除土壤以外，还有河（湖、海）泥和水、枯树叶、堆肥、动物粪便等。土壤样品通常采表层土（5cm以下），样品以未开垦过的土壤为佳，要尽可能选择不同地理和生态环境的土壤。（2）分离微生物：样品的处理、分离培养基、抑制剂的使用、分离方法、培养条件、稀有放线菌的选择性分离、其他微生物的分离样品的处理：利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不同属间放线菌孢子间的耐性差异，用物理或化学的方法除去细菌及目的外放线菌，或者用花粉作为诱饵，增加某些特定放线菌的分出率。A）温度B）化学试剂的处理SDS-酵母膏处理法，SDS对放线菌孢子基本无害，酵母浸膏以及温和的热休克可以促进放线菌孢子的出芽，使细菌数明显减少。 风干的土壤与CaCO3混合后在26培养79 d，然后分离放线菌。风干的土壤减少了细菌的数量，CaCO3有利于放线菌生长而不利于绝大多数真菌的生长。用0.01 mol/L NaOH处理土壤510 min（15）可减少细菌的数量，有利于分离小单孢菌。用1.4%酚处理土样10 min或用1.4%酚130处理30 min，分别有利于获得链霉菌或小单孢菌。用乙酸乙酯或氯仿和苯处理样品，过滤风干后用来分离微生物，可以除去样品中的真菌。C）物理方法的处理离心，1600 g离心20 min，上清液主要有放线菌孢子，沉淀含有细菌和真菌孢子。超声波处理，分离小单孢菌和链霉菌。特殊器具捕集空气中的游离孢子，分离糖多孢菌。搅动，使干草上孢子脱落，用于从干草中分离高温放线菌。膜过滤，将水经膜（孔径0.45滤膜）过滤，浓缩水中微生物，再将膜直接贴在琼脂平板上培养。诱饵法，在培养基中添加特殊物质，如花粉、蛇皮、头发等，可分离小瓶菌和发仙菌。分离培养基 ：总的要求：尽量使样品中的全部放线菌都生长出来，而其他微生物（细菌和真菌）又尽可能不长。合成培养基精氨酸培养基，高氏合成一号培养基，天门冬素培养基，察氏培养基等有机培养基Waksman培养基，Bennett培养基几丁质培养基只有放线菌能够利用几丁质，生长的菌落小，白色，需转接到产可溶性色素的适当培养基上加以区分HV培养基以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源的培养基抑制剂的使用：加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素B、放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的rose bengal等），抑制真菌生长；加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，增加放线菌的分出率；加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。分离方法：稀释法最常用，将土壤样品用无菌水（或生理盐水、磷酸缓冲液）制成悬液，倍比稀释，涂布平板，恒温培养。干土喷射法用喷土机或其他方法将风干碾细的土样直接喷在分离平板上。孢子飞扬法将0.220.45m的滤膜放在分离平板上，接种菌悬液或喷撒干土，适温培养一段时间，放线菌菌丝可穿过滤膜小孔生长到培养基上，细菌只能在滤膜表面生长，去掉滤膜，深入培养基的放线菌经继续培养后长出菌落。滤膜法将样品置于特制瓶中，其瓶口刚好能倒置一个分离平板，剧烈振荡使孢子飞扬，撞到分离平板上进行分离培养。培养条件：一般培养温度为2530，也有3237，培养714 d，生长慢的放线菌可延长培养1个月；稀有放线菌的选择性分离：稀有放线菌的特征：生长速度比较缓慢；营养需求较为复杂；比较缺乏孢子分化的能力；不能稳定保存。其他微生物的分离（3）选留菌种及保存将菌株的优良特性保存下来，保持微生物的活力低温保藏法、传代培养保藏法、液体石蜡保藏法、沙土保藏法、冷冻干燥保藏法2、海洋微生物的分离分离海洋放线菌的培养基：（1）SC培养基：可溶性淀粉10 g酪蛋白1 g人造海水500 ml蒸馏水500 ml琼脂1.7%pH 7.4（2）Z培养基：蛋白胨5 g磷酸铁0.1 g酵母膏1 g人造海水1000 ml琼脂1.7%pH 7.6（3）普通分离放线菌培养基适当稀释，再加入人造海水3、极端微生物的分离极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、高盐、高碱、高压等）中形成的一类特殊的微生物，因而在分离这类微生物时，需考虑它们生长繁殖所需的特殊条件，以设计分离与培养条件。分离嗜热微生物，有些菌株的最适生长温度高达80，pH在16；分离嗜盐微生物时培养基中的盐浓度可高达2.5 mol/L。4、其他微生物资源粘细菌：纤维素堆囊菌（Sorangium cellulosum）大环内酯类抗生素堆囊菌素，琥苍菌素（抗真菌）基因重组微生物：利用基因工程技术构建产生新的次级代谢产物的基因重组微生物，逐步创立组合生物合成。利用基因重组微生物提高已有抗生素的产量和有效组分的含量。组合生物合成将产生不同抗菌药物或其他生理活性中间体的基因重组到一种微生物中，使其生物合成途径重新组合，生产迄今自然界还没有的新的抗生素或生理活性化合物。5、难培养微生物的分离与培养研究VBNC（viable but nonculturable）指那些可培养的不分化的微生物在受到外界压力刺激后，通过一系列的类似分化的遗传程序而使自身处于一种能抵抗饥饿和压力的状态；尽管此后不能用常规的培养方法恢复其生长繁殖，但实验证明它们仍保持生存力与致病因子和/或基因。（三）新微生物药物的筛选1、初筛发酵：初筛发酵是能否产生抗生素的关键，需要选择适合的发酵培养基和培养条件，以利于抗生素的合成。培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料。培养基成分碳源糖类、脂肪、某些有机酸、醇或碳氢化合物供给微生物生命活动所需要的能量以及构成菌体细胞成分和代谢产物。氮源蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、肉膏、酒泥硫酸铵、氨水、硝酸盐等供给微生物生长所需的氮素，构成菌体原生质无机盐、微量元素磷、镁、钾、钠等铁、铜、锌、锰、钴、钼等可以作为生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物初筛方式：固体平板发酵便于大量筛选抗菌物质时采用。液体振荡培养放线菌大都为好氧菌，增加溶解氧有利于放线菌生长和抗生素的合成。2、筛选模型的研究与应用（1）常规的筛选方法：琼脂扩散法利用多种微生物作为检定菌，筛选有抗菌活性的物质。非致病菌、抗生素耐药突变株和超敏菌株、厌氧菌、协同活性检测（2）定靶筛选：从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。a) 以作用机理为依据的筛选方法b) 以耐药机制为依据的筛选方法：抗生素的广泛使用和一些不合理的滥用，引起细菌耐药性的增加，而细菌耐药机制的研究进展又使耐药性的解决成为可能。细菌的耐药机制主要有4种：l 细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的抗生素，使之失去生物活性；l 抗生素的作用靶点由于发生突变或被细菌的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗生素作用的靶酶的结构发生改变使之与抗生素的亲和力下降；l 由于细菌细胞膜渗透性的改变或其他有关特性的改变；l 细菌具有一种依赖于能量的主动转运机制，它能够把进入胞内的药物泵至胞外。-内酰胺酶抑制剂的筛选： -内酰胺酶是一类能够破坏具有-内酰胺结构抗生素的钝化酶的总称。许多致病菌由于产生-内酰胺酶而对青霉素和头孢菌素具有抗性。 -内酰胺酶抑制剂的筛选主要依据抑制剂抑制-内酰胺酶，使酶失去活性，不能水解-内酰胺类抗生素，使抗生素保持生物活性，从而抑制细菌生长繁殖。 耐药菌株平板法、液体测定法、联合使用-内酰胺酶以及敏感和耐药突变株、通过颜色变化来检测-内酰胺酶抑制剂、诱导-内酰胺酶方法的应用3、高通量筛选高通量筛选（high throughput screening）技术是20世纪80年代后期形成的寻找新药的高新技术。将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培养后用计算机记录结果，并进行分析，可以实现大规模的筛选。高通量筛选的模型： 细胞模型观察待测样品对细胞的作用，反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括各种正常细 胞和病理细胞。 分子模型包括受体、酶等，药物作用的靶点明确。 其他模型现阶段的微生物药物筛选主要研究方面：产生菌的来源、微生物的初筛发酵、新的筛选模型和方法（四）微生物药物产生菌的菌种改良目的将产生菌的一些有益变异，通过不断的筛选和培育，为研究和生产提供更多合乎需要的高产优质新菌种。自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程技术改良菌种1.自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做 自然选育或自然分离。自然选育包括：从自然界分离获得菌株、根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。（1）从自然界分离获得菌株一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。 （2）从自发突变体中获得菌株 变异是育种的基础。 自然突变是指自然条件下出现的基因变化。 自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株诱变育种。2.诱变选育人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。诱变育种的主要环节：以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子）以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高；用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。（1）诱变剂物理诱变剂：各种射线，如紫外线、X射线、射线、射线、射线和超声波等化学诱变剂：乙基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。生物诱变剂：噬菌体、转座因子（2）影响诱变效果的因素：出发菌株的遗传特性；诱变剂；菌种的生理状态；被处理菌株的预培养和后培养条件；诱变处理时的外界条件等。选择合适的出发菌株；采用分散状态的孢子悬浮液处理；采用单核细胞（或核质体）处理；注意微生物的生理状态；适宜的诱变剂量（3）筛选的方法制定筛选方案-方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程。突变株的筛选方法：一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。影印平板（Replica plating）法是Lederberg夫妇在1952年建立根据形态变异淘汰低产菌株，根据平皿反应挑取高产菌株。随机筛选：摇瓶筛选法、琼脂块筛选法、筛选自动化和筛选工具微型化理性化筛选：运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。n 初级代谢产物高产菌株的筛选：降低终产物浓度、筛选抗反馈突变菌株n 次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选：利用营养缺陷型筛选、筛选负变株的回复突变株、筛选去磷酸盐调节突变株、筛选去碳源分解代谢调节突变株、筛选氨基酸结构类似物抗性突变株、筛选二价金属离子抗性突变株、筛选前体或前体结构类似物抗性突变株、筛选自身所产的抗生素抗性突变株3、杂交育种杂交育种一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。1）常规的杂交育种：遗传标记、异核体形成、杂合二倍体的形成、染色体交换和单倍体2）原生质体融合A.标记菌株的筛选 供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。 采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。 通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。B.原生质体的制备：在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。（细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理，酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶）影响原生质体制备的因素：菌体的预处理（用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，使菌体细胞壁对酶的敏感性增强。）菌体的培养时间（一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。）酶浓度酶解温度（一般控制在2040）酶解时间（充足的酶解时间）渗透压稳定剂：对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用KCl和NaCl等。一定浓度的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性。C.原生质体的融合和再生融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体的融合。原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。影响原生质体融合的因素：菌体的前处理；菌体的培养时间；融合剂的浓度；融合剂作用的时间；阳离子的浓度；融合的温度；融合体系的pH值等。影响原生质体再生的因素：菌种自身的再生性能；原生质体制备的条件；再生培养基成分；再生培养条件等。检查原生质体形成和再生的指标：原生质体的形成率、原生质体的再生率将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上，计出原菌数A；将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程的处理：a) 用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活，所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数B；b) 用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和C。D.融合子的选择：融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。原生质体融合与传统杂交方法相比有以下几个特点： 重组频率高并可能有几个亲株同时进行杂交； 可以进行种间甚至属间杂交并形成稳定的重组体，但重组 的频率比较低； 被灭活的原生质体进行融合后，仍可能活的重组体； 原生质体的形成与再生本身就可作为链霉菌的一种育种方法。4、基因工程技术改良菌种体外重组DNA技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。（1）DNA重组过程：基因的分离-DNA分子的切割与连接-载体-引入宿主细胞-重组体的选择和鉴定-外源基因的表达（2）重组DNA技术在微生物药物菌种改良研究中的应用A提高微生物药物的单位产量1.增加限速酶基因拷贝数,提高菌种的生产能力2.引入抗性基因和调节基因,增加微生物药物单位产量3.克隆抗生素的全部结构基因,改变表达体系提高产量B.阻断支路代谢，增加有效组分的含量 抗虫抗生素阿弗米丁基因工程菌的构建阿弗米丁是十六元大环内酯的齐墩果二糖衍生物，由除虫链霉菌产生，在发酵过程中还产生一种结构差别大的大环内酯类抗生素寡霉素。C.构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌 许多半合成抗生素的中间体是由一些天然产物经过化学修饰获得的，但是制备工艺较为复杂。例如半合成头孢菌素的中间体是头孢菌素C的衍生物7-ACA，或青霉素G和V的衍生物7-ADOCA。D. 构建产生新化合物的基因工程菌 由于许多微生物次级代谢产物酶系的底物特异性不强，当某种抗生素的生物合成基因克隆至另一结构相似、生物合成途径有关的抗生素产生菌中，可使其产生不同于二亲株产物的具有生物活性的新化合物，即“杂合抗生素”。例如，将放线紫红素的生物合成基因导入紫红链霉菌，产生了新化合物二氢榴菌紫红素；聚酮类化合物（PK）。E. 引入血红蛋白基因，改善微生物的工业性状 充足的氧气供给是稳定和提高发酵工业生产水平、降低生产成本的关键，传统方法是改良生物反应器及增大通气量。专性好氧菌透明颤菌中发现了血红蛋白（VHb），能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上，使细胞在贫氧状态下也能很好生长。（五）微生物药物产生菌的保藏1、菌种保藏的目的：按人们的不同要求，把从自然界分离到的野生型，或经过人工选育得到的变异型微生物纯种，使其存活，不丢失、不混乱、不污染、不发生或少发生变异，保持其优良性状或生理特性，使其处于休眠状态（一般使用多种方法保存）。2、菌种保藏的基本原理微生物菌