物料管理_有机物料腐熟剂制备条件的优化论文

郑州大学 硕士学位论文 有机物料腐熟剂制备条件的优化 姓名：狄源宁 申请学位级别：硕士 专业：环境科学 指导教师：郭夏丽 201205 摘要 摘要 我国是一个农业大国，秸秆资源丰富，但是大部分的秸秆资源被直接在田间 焚烧或被丢弃乱堆，造成资源浪费和环境污染。为了解决这一问题，一种新型的 微生物肥料一有机物料腐熟剂应运而生。本研究针对有机物料腐熟剂生产上的主 要问题，经过初筛得到纤维素酶活性及半纤维素酶活性较高的枯草芽孢杆菌，并 通过摇瓶试验研究提高枯草芽孢杆菌芽孢量的最佳培养基组合和最优培养条件。 主要结论如下： 1 在枯草芽孢杆菌培养基成分的优化试验中，长效的碳、氮源麸皮和玉 米粉比速效碳、氮源有更好的效果，细胞总数量以及芽孢数量都较高，产芽孢率 可达到7 0 左右；当N a C l 与K H 2 P 0 4 浓度比为5 ：1 时，芽孢数均高于这两种单 一无机盐的芽孢数。同时，在培养基中添加适量的锰离子也有利于芽孢的产生。 2 在枯草芽孢杆菌培养条件的优化试验中，通过对培养温度、初始p H 值、 溶氧水平几方面的研究发现：在3 0 的培养温度时，芽孢数及细胞数量最高， 分别为6 2 1 0 f um L 以和8 6 X 1 0 8 c f um L “ 1 ，其产芽孢率达到7 2 1 ；在初始 p H 中性条件下时，芽孢数量最大：芽孢数在一定范围内随着装液量的增加而升 高，而后随着装液量的继续升高而减少，装液量为5 0 m L 2 5 0 m L 时，芽孢数量最 大，溶氧水平达到最佳：通过对培养基组成及培养条件的优化，得出最佳的产孢 培养基为：麸皮5 9 ，玉米粉1 0 9 ，N a C l5 9 ，K H 2 P 0 4lg ，M n S 0 4 H 2 00 4 9 ，水 1 0 0 0 m L 。在3 0 、初始p H7 0 时，其细胞数及芽孢数可达到4 1X 1 0 9 c f um L l 和3 4 X1 0 9 c f um L ，产芽孢率可到达8 2 9 。 3 在单一载体的微生物吸附试验中，吸附7 d 后麸皮能够增加菌体和芽孢数 而腐熟堆肥则能保持活菌体和芽孢数的稳定；将麸皮和堆肥按1 ：1 混合，吸附菌 体6 0 d 后，其有效活菌数保持稳定，数量可达到2 6 2 1 0 8 c f ug 一，满足有机物料 腐熟剂产品的技术要求；由于堆肥来源丰富，在大规模的工业生产中将其作为载 体生产固体微生物茼剂，可以大大节省成本。 关键词：有机物料降解：枯草芽孢杆菌菌剂；产孢条件；载体吸附 A b s t r a c t A b s t r a c t D e v e l o p m e n to f B a c i l l u ss u b t i l i sf o r m u l a t i o nf o ro r g a n i cm a t 舐a ld e g r a d a t i o n T h e r ea r ea b o u t9 0m i l l i o nt o n so fw h e a ts t r a wp r o d u c e da n n u a l l yi nC h i n a H o w e v e rm o s to fw h e a ts t r a wi Sb u r n ti nt h ef i e l d so rd i s c a r d e d T h i sc a u s e ss e r i O U S w a s t eo fr e s o u r c e sa n de n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n T h em i c r o b e si n o c u l a mu s e dt o a c c e l e r a t i o no fs t r a wd e c o m p o s i t i o ni nt h ef i e l di su r g e n t l yn e e d e d 。T h ea i mo ft h i s r e s e a r c hw a st op r o d u c eas t a b l eb i o l o g i c a lf o r m u l a t i o nw i t he n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l y m i c r o o r g a n i s mB a c i l l u ss t u b t i l i s 丽也h i 乒珂a c t i v i t yo fc e l l u a s ea n dh e m i c e U u a s eb y s t r a i ns c r e e n i n g , c u l t u r a lc o n d i t i o n s o p t i m i z i n ga n ds t r a i na d s o r p i n g T h e r e s u l t s c o u l db eu s e dt op r o v i d ear e l i a b l eb a s i sf o rs c a l i n gu pt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s st oa l l i n d u s t r i a ll e v e l T h em a i nc o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ： 1 、W i t hb r a na sc a r b o ns o u r c e ，t h es p o r el e v e lo fB a c i l l u ss u b t i l i si n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ，s h o w i n gt h eh ig h e s ts p o r ey i e l da m o n ga l lc a r b o ns o u r c et e s t e d 5 9 L _ w a ss e l e c t e da st h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fb r a nb e c a u s et h eh i g h e s ty i e l do fs p o r e s w a so b t a i n e da tt h i sc o n c e n t r a t i o n W i t hc o i np o w d e ra sn i t r o g e ns o u r c e ，t h eh i 曲e s t y i e l do fb o t hs p o r e sa n dv e g e t a t i v ec e l lsw a so b s e r v e d A m o n gt h em i n e r a l st e s t e d ， t h en u m b e ro ft h es p o r e sp r o d u c e di n5 ：1o fN a C la n dK H 2 P 0 4w a sg r e a t e rt h a nt h a t p r o d u c e di ns o d i u mc h l o r i d eo fp o t a s s i u mp h o s p h a t ea l o n e M e a n w h i l e ，a d d i t i o no f M n 2 + ( 2 4 r e t 0 0 1 L 1 ) s i g n i f i c a n t l yp r o m o t e ds p o m l a t i o n ，y i e l d i n g7 2X 10 8 c f u 。m L 1o f s p o r e s S ot h eo p t i m i z e dm e d i u mf o rs p o r e so fB a c i l l u ss u b t i l i sw a s5 9 L b r a n ， 10 9 L 1m a i z ef l o u r ，5 9 L N a C l ，l g L 1K H 2 P 0 4 a n d0 4 9 L - 1M n S 0 4 H 2 0 2 、I nc u l t u r ec o n d i t i o n s o p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t s ，t h ee f f e c to fi n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e ，i n i t i a lp Ha n dt h el e v e l o fd i s s o l v e d o x y g e no nB a c i l l u ss t u b t i l i s s p o m l a t i o nw e r ed e t e r m i n e d I tw a sf o u n dt h a tt h en u m b e r so fb o t hs p o r e sa n d n A b s t r a c t v e g e t a t i v ec e l l sr e a c h e dt h eh i g h e s ta tt h ei n c u b a t i o nt e m p e r a t u r eo f30 “ C ，u pt o 6 2 1 0 8 c f u m L “ 1a n d8 6 x1 0 8 c f u m L “ l ，r e s p e c t i v e l y T h en u m b e ro fs p o r e sw a st h e m a x i u ma tt h ei n i t i a lp H7 0 T h ey i e l do fs p o r e si n c r e a s e dw i t hi n c r e a s ei nw o r k i n g v o l u m er a n g i n gf r o m8 t o2 0 o f2 5 0m Lc a p a c i t yE r l e n m e y e rf l a s ka n dw a s m a x i u ma tw o r k i n gv o l u m e so f2 0 S ot h eo p t i m i z e dc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rB a c i l l u s s t u b t i l i ss p o r u l a t i o nw o r e3 0 “ C ，i n i t i a lp H7 0a n d5 0m Lm e d i u mv o l u m ei n2 5 0m L f l a s k T h eh i g h e s ty i e l do fb o t hs p o r e sa n dv e g e t a t i v ec e i l sw a sa c h i e v e da tp H 7 0 ，30 “ C a n di n2 5 0 - m lf l a s k sc o n t a i n i n g5 0m lo fo p t i m i z e dm e d i u m 3 、I nm i c r o o r g a n i s m sa s s a yo nas i n g l ea d s o r p t i o nc a r r i e r ，t h en u m b e ro fb o t h s p o r e sa n dv e g e t a t i v ec e U so f B a c i l l u ss t u b t i l i si n c r e a s e di nw h e a tb r a na n dw a ss t a b l e i nt h ef i n i s h e dc o m p o s ta f t e ra d s o r p t i o n7 d ；M i x i n gt h eb r a na n dc o m p o s ta tam a s s r a t i oo f1 ：1 ，t h en u m b e ro f v i a b l ec e l l sr e m a i n e ds t a b l ea n dc a nr e a c h2 6 2 1 0 8 c f u g - 1 a f t e r a d s o r p t i o n6 0 d , w h i c hc a nm e e tt h et e c h n i c a lr e q u i r e m e n t so ft h eo r g a n i c m a t e r i a l d e g r a d a t i o ni n o e u l a n tf o rc o m p o s t i n g I fc o m p o s ti su s e da sac a r r i e r p r o d u c i n gs o l i dm i c r o b i a li n o e u l a n ti nt h el a r g e s c a l ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n ，i tc a n r e d u c ec o s t ss i g n i f i c a n t l y K E YW O R D S ：o r g a n i cm a t m a l ，B a c i l l u ss u b t i l i s ，s p o r u l a t i o nc o n d i t i o n s ， t h en u m b e ro fs p o r u l a t i o n ，c a r r i e ra b s o r p t i o n 文献综述 第一章文献综述 我国是传统的农业大国，据资料显示，每年有高达数亿吨之多的秸秆产生， 占世界秸秆总量的2 0 3 0 【l 】，其中小麦秸秆占2 1 ，玉米秸秆占3 5 ，稻草 占1 9 t 2 1 。秸秆是农业生产的副产品，同时也是一种宝贵的生物质资源。如何利 用好农作物秸秆资源是当前亟待解决的问题。秸秆还田可以保持和提高土壤肥力， 保持土壤有机质平衡，有利于改善作物的生长环境和土壤的理化性状【3 弓】，是一 种比较理想的秸秆处理方式。但秸秆的直接还田由于秸秆不易腐烂，影响作物的 生长，为了加快秸秆的腐烂，有机物料腐熟剂应运而生。 有机物料腐熟剂又称生物菌剂、生物发酵剂等，是指能够加速各种有机物料 ( 包括农作物秸秆、畜禽粪便、生活垃圾及城市污泥等) 分解、腐熟的微生物活 体制剂。它是微生物肥料的一种，在秸秆还田中，通过施用腐熟剂加速秸秆的腐 熟分解。作为微生物肥料，其中所含的微生物活菌数是其性能优劣的重要判定指 标。在有机物料腐熟剂工业化生产的过程中，保证有效活菌的数量是关键之所在。 1 1 有机物料腐熟剂研究现状及存在的问题 1 1 1 国内外研究现状 有机物料腐熟剂是近些年来微生物肥料快速发展的一个新品种【6 】。2 0 世纪 9 0 年代，我国从日本引进酵素菌，主要生产酵素菌肥，当时把有机物料腐熟剂 与微生物肥料混淆了。后来在科学研究和生产中知道，有机物料腐熟剂是以分解、 腐熟有机物料为主要功能，将有机物转化为有机肥：微生物肥料是把特定功能的 微生物与营养物质进行组合，从而制成活体微生物制品，可以增加、保持或改善 植物营养，提高产量，改善农产品品质；因此，有机物料腐熟剂和微生物肥料在 功能和作用上是不同的。2 0 0 2 年，我国发布了农业行业标准一有机物料腐熟剂 ( N Y 2 0 0 2 ) ，从此，有机物料腐熟剂的生产走上了法制化、规范化的道路，加 快了其发展的步伐。目前主要广泛应用于以秸秆为主料的堆肥腐熟和秸秆还田中， 通过接种有机物料腐熟剂加速秸秆的腐熟分解。国内的秸秆腐熟剂主要有云南省 微生物研究所和中国科技开发院云南分院联合研发的福贝复合菌、北京中龙创科 文献综述 技有限公司开发生产的“满园春“ 生物发酵剂、恒隆态环保生物技术研究所研发 的H M 菌种、山东亿安生物工程有限公司研制的C M 菌、广东省高明市绿宝科 技有限公司开发生产的腐秆灵等；这些菌剂能够将各种农作物秸秆以及其他种类 的废弃物快速变成有机肥料，广泛应用于秸秆制作有机肥领域，但直接用于还田 效果不够理想。赵明文等人研究纤维素降解菌剂对还田秸秆催腐降解效果的实验 结果显示，和不接种降解菌的还田秸秆相比，经过3 4d ，秸秆分解率可提高1 3 6 2 【7 】；金海洋在水稻秸秆还田实验中发现，通过添加纤维素分解菌，水稻秸秆的强 度得到显著降低，并且土壤中的脲酶、转化酶、多酚氧化酶及纤维素酶活性有明 显增加，但只能增加5 5 1 0 7 的秸秆降解率【8 】：何伟松和谢柱存等人对3 种秸 秆降解菌剂进行了研究，结果表明3 种秸秆腐熟菌剂对秸秆的催腐效果以及对水 稻产量的影响差异较小：温从雨和王华良在微生物催腐剂的大田对比实验中发现， 施用菌剂1 个月后，对比实验的两组处理秸秆腐熟情况均不明显，水稻秸秆呈灰 白色，手感有戮痛、无味、干燥【9 】。国外的有机物料腐熟剂研究早在2 0 世纪初 就已经开始。日本微生物学家岛本觉也研发的酵素菌可用于堆沤秸秆腐熟，已在 二十多个国家得到迅速推广，达到秸秆还田的目的，对其它有机物也具有很强的 分解发酵能力：美国俄亥俄州的两个试验站进行了8 年的秸秆还田田间试验，结 果表明，在俄亥俄州还田的玉米增产5 1 ，而在较干旱的地区秸秆还田则造成 了减产【l o 】。这说明有机物料的降解与环境有一定的关系。德国东部在1 9 8 5 至1 9 6 2 年间做了8 7 个试验，结果表明，玉米产量平均增产5 ，未补加氮肥的则出现减 产【l u ：表明将有机物料腐熟剂与其他肥料配合使用可以使农作物增产。 总之，目前有机物料腐熟剂仍不能满足秸秆直接还田的要求，需要开发更加 高效的有机物料腐熟剂来满足秸秆直接还田的需求。 1 1 2 有机物料腐熟剂存在的主要问题 有机物料腐熟剂是近年来快速发展起来的一种微生物肥料。虽然我国有机物 物料腐熟剂行业取得了一定的成果，但是也面临着诸多的问题，和发达国家相比， 基础研究薄弱，工艺、设备、材料等关键技术相对较落后；尚未搭建起拥有自主 知识产权的产业化技术平台，产业化水平较低；肥料作用的机理、效果制约因素 与机理研究落后：筛选高效菌株的手段落后：肥料菌种缺少创新，种类少；载体、 工艺、发酵条件等关键技术的研究落后；发酵物料制成商品化有机肥料产品的剂 型、生物有机肥料制作、有机无机配伍、造粒粘结剂技术以及工业设备技术等都 2 文献综述 有待突破【1 2 】。这些问题都是我国有机物料腐熟剂行业面临的问题。 目前，在工业生产方面还存在着很多问题，与其他国家相比，我国有机腐熟 剂的品种种类多、应用范围较广，但是整体水平不高，技术创新不足，产品质量 和应用效果也有待提高，这些都是我国有机物料腐熟剂行业所面临的主要问题。 对于微生物菌剂来说，性能优良的菌株是决定肥料功效的核心，因此，一方 面采用常规筛选技术与现代基因工程技术相结合的手段。根据不同的功能需求筛 选出更多的性能更好的菌株；近年来，芽孢杆菌属是研究的热点，芽孢杆菌属 ( B a c i l l u s ) 是一类好氧或兼型厌氧、主要分布于植物体表面、土壤及水体中的杆 状细菌，由于能够产生抗逆性的内生孢子，因此它们对热、紫外线、电磁辐射和 某些化学药品具有很强的抗性，能忍受多种恶劣环境【1 3 1 。因此，芽孢杆菌可以作 为有机物料腐熟剂的新的研究菌株。另一方面，对生产工艺和技术设备方面进行 改进，采用现代化的发酵工程和自动化控制技术，以此提高发酵中的功能微生物 密度；利用保护剂和新材料包装来延长产品的保存期；使用自动化的生产设备， 合理的生产工艺流程，可以准确的确定运行参数的量化指标，同时降低生产成本。 从这两个主要方面入手，逐步提高我国微生物菌剂的质量和市场竞争力。 1 Z 有机物料腐熟剂中的微生物 有机物料主要包括农作物秸秆、畜禽粪便、生活垃圾及城市污泥等，目前市 场上的有机物料腐熟剂主要针对农作物秸秆和畜禽粪便，因此，根据秸秆和畜禽 粪便的物质组成选择合适的降解菌对腐熟剂的生产制作意义重大。用于有机物料 腐熟剂生产的菌种需具有对固体有机物发酵的能力、并能使有机固体废弃物腐熟、 除臭和干燥。有机物料腐熟剂的菌种主要有四大类：丝状真菌、酵母菌、放线菌 和细菌。丝状的真菌可以分泌多种代谢产物，可以分解含有纤维素的有机物料： 酵母菌能够分解营养物质，促进物质转化：放线菌能够分泌纤维素酶和半纤维素 酶，对秸秆类有机物有一定的降解能力，同时还可以分泌抗菌素、有机酸等物质， 在抑制病原菌的发生蔓延方面作用巨大，并可以参与土壤中氮、磷等化合物的转 化，可以促生作物生长，增加作物的抗病能力等：细茼主要以芽孢杆菌为主，具 有固氮、解磷、解钾等作用，可以把环境中的营养物质转化为作物生长的所需物 质。近年来的研究表明，枯草芽孢杆菌可以产生纤维素酶和半纤维素酶，对降解 农作物秸秆、畜禽粪便等起到了重要的作用，是生产有机物料腐熟剂的重要菌种 来源。 文献综述 1 2 1 秸秆降解菌 秸秆的组成主要包括纤维素、半纤维素和木质素，而纤维素的降解是秸秆降 解的关键。纤维素镶嵌在由半纤维素和木质素通过共价键联结成的网状结构之中， 因此，纤维素的直接降解相当困难。秸秆的降解必须要降低纤维素、半纤维素及 木质素之间的聚合度、结晶度，破坏木质素和半纤维素的结合层，增加纤维素酶 的可及度从而达到对纤维素的降解。因此，所选的微生物必须对纤维素、半纤维 素和木质素都有一定的降解能力。 纤维素的降解是内切型葡聚糖酶( C x 酶) 、外切型葡聚糖酶( C I 酶) 和B 葡萄糖苷酶( C b 酶) 等协同作用的结果。自然界中有很多微生物都能够降解纤 维素，其中真菌类和部分的细菌是分解纤维素的主要微生物，其中又以青霉、木 霉、曲霉的降解能力最为突出，例如：绿色木霉( T r i c h o d e r m av i r i d e ) 、康氏木霉 ( T r i c h o d e r m ak o n i n g i O 、里氏木霉( T r i c h o d e r m a r e e s e i ) 、拟康氏木霉( T r i c h o d e r m a p s e u d o k o n i n g i i ) 等；细菌的纤维素酶产量较低，且以胞内酶居多，主要包括纤维 茵属( c P 砌肠，l D 刀口J ) 、芽孢杆菌属( 肋c f 淞) 和梭状芽孢杆菌属( C l f D s 批朋) 等【】4 】。 半纤维素的分子链较纤维素分子链短，它是由不同单糖构成的异质多聚体， 其中包括木糖、半乳糖和甘露糖等，其聚合度大多在2 0 0 以下【”1 。因为其较小的 聚合度致使它呈粉末状，具有更好的吸湿性和润涨性从而更容易水解。多数能分 解纤维素的菌类都有较高的胞外半纤维素酶活【1 6 1 ，能很好的分解半纤维素。其中 绿色木霉、焦曲霉、纤维单胞菌、烟色曲霉、黑曲霉等具有较强的代表性【l 7 1 。 木质素是一种复杂的、非结晶性、三维网状酚类高分子聚合物，具有芳香族 特性，结构单元为苯丙烷型【1 8 】。木质素的降解是微生物群落共同作用的结果，其 中真菌起主要作用。真菌的菌丝可以进入到木质材料中，同时通过分泌特殊的胞 外酶作用于植物细胞壁的木质纤维素，造成木质素与纤维索的解聚合溶解。有研 究表明，木质素的降解发生于微生物的次生代谢过程中，能降解木质素的微生物 同时也能降解纤维素和半纤维素【1 9 1 。在降解木质素的微生物中，放线葡和细茼只 能部分改变木质素的结构，只有白腐菌才能彻底分解木质素：木腐菌是近年来木 质素降解研究的热点，其中研究较多的包括白腐蔺、褐腐蔺、变色真菌、软腐细 菌、软腐真菌【2 0 1 。 4 文献综述 1 2 2 畜禽粪便降解菌 随着我国集约化、规模化养殖的稳定发展，其在为我们提供丰富生活产品的 同时，也给环境带来了巨大的压力【2 1 1 。但是从资源利用的角度看，畜禽粪便含有 农作物所必须的氮、磷、钾等微量元素以及大量的有机物，是资源再利用的好原 料。 畜禽粪便中富含大量的有机物，其中粗蛋白含量比畜禽的饲料中的粗蛋白含 量高5 0 ，并且氨基酸占8 。1 0 t 2 2 1 。此外，还有粗脂肪、磷、钙、镁、钠、 铁等多种营养物质 2 3 1 。因此，一直以来畜禽粪便都是农户喜爱的优质天然肥。畜 禽粪便经发酵、除臭等步骤处理后可制成优质、高效的有机复合肥料。因此，利 用好氧堆肥发酵将畜禽粪便制作成有机肥，不仅能够得到清洁安全的肥料，同时 还解决了环境污染问题，可谓一举两得 好氧堆肥是指微生物在有氧的条件下降解底物的生物化学过程。在堆肥的过 程中，除了优化各种堆肥影响因素以外，还可以通过接种一些具有脱臭、降解能 力的微生物，增加有效微生物的数量和种类，从而提高堆肥的腐熟速度。因为畜 禽粪便含有大量的粗蛋白，因此，接种的微生物一般能够分泌蛋白酶，蛋白酶可 以水解蛋白质为短肽，短肽再进一步被水解为氨基酸。 在畜禽粪便好氧堆肥的过程中，加入的有机物料腐熟剂中的微生物必须有一 定的优势，否则，堆肥中的土著微生物与接种的微生物会产生竞争，接种微生物 在纯培养条件下的物质分解潜力不能得到充分的发挥。因此，选择有针对性的优 势菌群对腐熟剂的生产是关键的一步。在堆肥开始的升温阶段中，中温性微生物 占优判2 4 】，主要是一些无芽孢杆菌、球菌、芽孢杆菌、放线菌等。随着温度的逐 渐升高，达到5 0 6 0 “ C 时，堆肥进入高温阶段，此时高温微生物代谢活跃，嗜热 型微生物在堆肥中占据丰要地位，并随着温度的继续升高微生物的数量和种类也 不断变化。5 0 “ C 左右主要是嗜热纤维分解菌、普通小单胞菌、嗜热真菌类和嗜热 褐色放线蔺等，其中以放线菌占优。温度达到6 0 。7 0 时，中温蔺受到抑制或者 死亡，此时一些嗜热、好热微生物的活动占优，逐渐形成腐殖质。堆肥温度达到 7 0 “ C 以上时，高温会造成微生物大量死亡或者进入休眠期，此时，在各种酶的协 同作用下有机质继续分解腐化。温度持续一段时间后会逐渐下降，此时，硝化细 菌、固氮菌等微生物的活动异常旺盛，常温、中温菌数量和种类开始增加。由此 可以看出，在堆肥的整个进程中，是多种微生物共同作用的结果，不同的阶段其 优势微生物种类也是不同的，因此，针对不同的堆肥阶段，选择不同的微生物种 5 文献综述 类来生产腐熟剂，可以更有针对性的加快有机物料的腐熟。 1 3 微生物菌剂中芽孢的结构特性及形成 1 3 1 芽孢的结构及特性 芽孢是某些细菌( 多为杆菌) 在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的 一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。它具有抗热、抗化学物质、抗辐射、 抗压等抗逆性。芽孢具有如此多的抗逆性是由其独特的结构决定的，它由芽孢囊 和芽孢两部分组成，芽孢的组成由外到内包括胞外壁、芽孢衣、皮层和核心，芽 孢壁、芽孢质、核区三个部分共同构成核心。 芽孢衣的组成非常复杂，包括2 5 种多肽 2 5 1 ，芽孢衣是由来源于母细胞内并 在发展中的前芽孢表面沉积的蛋白质构成。这些蛋白质构成了芽孢衣的蛋白皮层， 可以有效的保护芽孢使其免受溶菌酶等大分子的攻击。完全丧失芽孢衣蛋白皮层 的枯草芽孢杆菌会对溶菌酶具有高度的敏感性，但是对热刺激只显示普通的抵抗 能力【溷。肽聚糖构成皮层位于芽孢衣内侧一层，它的重量几乎占总芽孢干重的 1 0 。近期有关枯草芽孢杆菌的芽孢肽聚糖生物合成的研究显示，芽孢肽聚糖的 低交联度只是起一种平衡的作用，并不是核心脱水所必须的，皮层的可降解性是 芽孢核心脱水效果和芽孢生长所必需的【2 。7 1 。芽孢的核心高度矿化，主要包含C a 2 + 、 M n 2 + 和M 9 2 + ，它们和毗啶二羧酸结合以螯合物的形式存在，内含细胞代谢的必 需成分。芽孢核心的矿质化与降低核心水分有关，而脱水后的芽孢使得它的内含 物具有抗热性，从而增加了芽孢的热抵抗能力。枯草芽孢杆菌的s p o V F A 或 s p o V F B 基因发生突变的菌株缺乏D P A ，它们编码D P A 合成酶的两个亚单元【2 引， 较大地增加了芽孢核心的水分并降低其对热和H 2 0 2 的抗性，但是芽孢中D P A 含 量减少的菌株对紫外线的抗性并没有降低，甚至比其野生亲本更具抗性。 成熟芽孢的核心只含营养细胞水分的1 0 3 0 ，因此芽孢的细胞质是胶态 结构，核心部分脱水大大增加了芽孢的抵抗化学物质的能力【2 9 1 ，如过氧化氢。芽 孢除了低水分的性质外，其细胞质的p H 值也低于营养细胞，而且酸溶小芽孢蛋 白( S A S P s ) 的含量较高。S A S P s 在芽孢形成过程中产生，S A S P s 与核中的D N A 紧密结合，可以保护其免受紫外线剪接及干热的损害从而增加其抗辐射能力： 文献综述 1 3 2 芽孢的形成过程 不同的菌种其形成芽孢的过程也不同。有的菌种在有氧的条件下形成芽孢， 有的则在无氧或缺氧的条件下形成芽孢。一般来说，当细菌体缺乏营养物质或C 、 N 、P 等元素饥饿时，菌体的生长速度就会减缓，此时芽孢形成基因启动，从而 使繁殖体形成芽孢。但是，也有一些菌种形成芽孢则要求适宜的生长条件。在形 态学上，可将芽孢的形成分为7 个时期，大约经过8 - 1 0 h 3 0 】。 0 期：对数生长期末期的繁殖体细胞。 I 期( 0 0 5 ) ：D N A 复制，形成轴索状的染色体。在这一阶段，细胞体内 蛋白质开始转化并形成抗生素和一些特殊的酶类。这些物质的作用可能是减缓细 胞代谢和控制芽孢阶段变化。 I I 期( 1 。5 - 2 5 ) ：此阶段染色体分开并形成非对称性的中膈，分成小的部分， 成为前芽孢( P r o s p o r c ) 。此阶段的变化与细胞分裂过程相似。 I 期( 2 5 - 4 5 ) ：芽孢母细胞的细胞膜磷脂大量合成，细胞膜快速增长，前 芽孢被极性相反的细胞膜包被，形成双层膜结构，同时包入少量的细胞质，并合 成磺基乳酸。该过程与吞噬过程相似。 期( 4 5 - 6 ) ：此阶段由于肽聚糖等物质的合成开始形成初生芽孢壁和皮质 物质，同时吸收钙离子。 V 期( 6 - 7 ) ：外膜芽孢母细胞在I I I 期合成的芽孢鞘角质蛋白沉淀于外膜 之外，形成芽孢鞘。同时有大量的半胱氨酸渗入芽孢鞘。 期( 7 8 ) ：芽孢进一步成熟。 期：此阶段，母细胞溶解，芽孢游离。 从芽孢的整个形成过程来看，前芽孢的形成好像改变了细胞的分裂过程；并 且它的化学特性和形态也发生了改变，同时又被母细胞吞噬，这是第期之前的 变化。随后各期在特定的环境下，由内向外逐渐形成各层保护装置，这可能是前 芽孢和母细胞相互作用的结果。 1 3 3 芽孢的形成机制 研究表明，影响芽孢形成的因素主要有三个方面： 0 0 4 及。因子、菌群密 度和遗传因素。根据芽孢形成的分子机制，活跃生长的细胞通过添加的碳源、氮 源及限量的磷源，在起始信号的作用下控制转录的调节子S p o O A 会通过磷酸化而 7 文献综述 活化，并在R N A 聚合酶口因子的一系列作用下形成芽孢 3 1 1 。S p o O A 磷酸化是芽 孢形成的一个重要因子，S p o O A 可以直接调节1 2 1 个基因的转录，甚至多达4 0 0 个基因都受S p o O A 的调控【3 2 1 。此外，口因子也是芽孢形成的关键因素。近年来 研究表明，许多类细菌都有“群体感应调节”这一现象，它是指在高细胞密度的 条件下，细菌可以通过化学信号的传递来监控细菌群体浓度的变化。芽孢的形成 和菌体密度有关，当细菌通过群体感应系统监控到菌体密度过高时，信号分子的 浓度就会相应增加，同时启动芽孢形成基因的表达【3 3 】。影响芽孢形成的另一个重 要的因素是遗传，研究表明，如果有关芽孢形成的基因发生了突变，则该菌株不 能形成芽孢。研究者通过构建C l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m 和C l o s t r i d i u mb e i j e r i n c k i i 的s p o O A 破坏和缺失菌株证明，这两个菌株均不能形成羧菌感受态的细胞和芽孢 【3 4 1 。 1 4 工业生产中获得较高芽孢率的措施 在微生物肥料工业化生产的过程中，越来越多的问题也不断的显现出来。微 生物工业的核心是进行规模化的微生物发酵，而微生物发酵的关键点就是筛选性 能优良的菌株、发酵用培养基、合适的发酵反应器以及合适的、良好的检验方法， 因此，解决好这几方面的问题对微生物肥料的工业化生产具有重要的意义。 1 4 1 营养成分种类和含量的选择 研究表明，有些细菌的芽孢是通过营养限量诱导形成的，因此，在工业化生 产过程中通过选择合适的碳、氮源和磷源，同时注意限量添加，并加入必要的无 机盐、金属离子，如M 9 2 + 、M n 2 + 、C a 2 + 等，可以有效的提高芽孢率。M n 2 + 不仅 是超氧化物歧化酶、黄嘌呤氧化酶、L 。阿拉伯糖异构酶等许多酶的辅助因子，也 是微生物生长和芽孢形成所需的一种微量元素【3 孓3 7 1 。在培养基中添加M n 2 + 可以 改善芽孢的皮层结构，提高芽孢的稳定性和产率，同时增加其热抵抗能力。 1 4 2 菌种的预处理 目前，国内微生物制剂的生产大多数是直接将冻干管菌种接种到适温培养基 中进行培养，培养前洗脱低温保护剂并更换新鲜培养液。而国外则不采用这种方 法，他们首先用8 0 “ C 或者更高温度水浴一定时间以有效杀死菌种中的营养体和 8 文献综述 潜在的杂菌以及可能存在的不产生芽孢的变异菌株，然后将芽孢接种到培养基中 进行活化培养，使之得到有效的提纯和复壮p 引。这种方法对提高芽孢数和芽孢率 都有显著的影响。菌种用培养基必须要选择营养丰富的合适的培养基，同时在最 佳条件下培养，这样可以有效的防止菌种退化。有研究表明，把C l o s 白 i d i u m p e r f r i n g e n s 在p H2 的环境中暴露3 0 m i n 后可有效提高芽孢形成率 3 9 】。这些研究 都表明，在工业化生产之前对菌种进行适当的预处理有利于芽孢产率的提高。 1 4 3 培养条件的优化 除了提供合适的培养基，培养条件和培养方式也是工业生产中的重要因素。 补料分批培养是工业上应用较广的一种培养方式，补料分批培养指发酵过程中将 某一种或几种限制性底物流加到反应器中，而目的生成物则要到收获时才提取出 来的操作方式【3 0 】。补料分批发酵培养技术一方面可以调节发酵过程中的还原糖浓 度，使还原糖的浓度维持在适合菌体生长的范围内；另一方面还可以起到缓冲的 作用，减缓由于初始糖浓度过高而酵解所生成的副产物对菌体带来的毒害抑制作 用。菌体的生长环境与芽孢的生长环境是不同的，因此，可以通过改变不同阶段 的培养条件来提高芽孢的形成率。在发酵的初始阶段，营养充足，是菌体快速生 长阶段，发酵一段时间后，通过补料发酵等高密度的培养方法来提高菌群密度， 接着在第二阶段通过改变培养条件来促进芽孢的形成。研究表明，通过这种两阶 段的培养方式，茵体增加了约5 5 ，每克干菌体中芽孢达到1 0 9 1 0 1 1 。 除了上面的几个影响因素外，芽孢形成的重要影响因素还包括溶解氧、接种 量、初始p H 和芽孢形成时的p H ，一些研究表明，发酵培养时间也是菌体浓度 和芽孢成熟率的重要影响因素【2 6 】。 1 S 工业生产中的微生物肥料载体 经过发酵后的微生物还需要经过进一步的固化处理，从而得到更利于保存、 运输及使用的固体或颗粒化的微生物肥料。因此，选择合适的微生物载体也是工 业生产中比较关键的一步。 目前，市场上的微生物肥料载体主要有草炭、硅藻土、蛭石、海绿石、粉煤 灰、食用菌菌糠等，其中以草炭的使用最为普遍【4 1 1 。草炭是一种天然的矿产资源， 它具有短期且不可再生的特性，对其大量的无限制的开采会造成生态环境的严重 文献综述 破坏 4 2 】。我国草炭资源分布广泛但不平衡，根据地理因素的差异草炭的特性也具 有很大的差异，这也会造成同一种微生物肥料肥效的差异。草炭的含氮量较高， 碳氮比为2 0 左右，因此用作微生物载体时还可以改善植物的碳素营养。草炭中 的含碳有机物在分解过程中能够产生大量的二氧化碳，直接被作物的根系和叶面 吸收，从而促进光合作用的进行，有利于植物的生长。 近年来，关于利用食用菌菌糠作为生物有机菌肥的载体的研究越来越多。改 革开放以来，食用菌产业也在我国得到了迅速的发展，据有关机构统计，食用菌 总产值在种植业中居第六位【4 3 】，仅次于粮、油、果、菜。由于栽培原料、菌种、 培养环境及种菇次数等各方面因素的差异，食用菌菌糠的成分也有较大的差异。 按照培养料的种类可分为：棉籽壳菌糠、秸秆菌糠、木屑菌糠、玉米芯菌糠及稻 壳菌糠【删；按照出菇次数的不同可分为：第一茬菌糠、第二茬菌糠、第三茬菌糠； 按照不同的真菌种类可分为：平菇、风尾菇、香菇、金针菇、木耳、猴头菇等菌 糠；其中棉籽壳菌糠蛋白质含量较高，并且含有无氮浸出物和多种氨基酸，营养 丰富，但是粗纤维含量也较高。平菇、凤尾菇、金针菇、蘑菇、猴头菇等木腐真 菌具有很强的纤维素和木质素分解能力，它们可以将培养料中的一些纤维素和木 质素分解并转化为人类可以食用的菌体蛋白，剩余的难降解的有机物部分和菌体 蛋白构成菌糠的主要组成部分。食用菌菌渣主要用于饲料、生物有机肥、土壤改 良剂、纤维素粗酶和环境修复材料等。食用菌菌渣中含有大量的食用菌菌丝、木 质纤维素降解酶及食用菌代谢产物，如糖类、生物活性物质等【4 5 删。目前国内已 有一些关于食用菌菌渣用作有机肥方面的报道，陈广银等【4 6 】研究表明在落叶堆肥 中添加食用菌菌渣能加快落叶中有机质的降解，孙建华等【4 7 】利用食用菌菌渣和猪 粪堆肥实现了废物资源化利用。利用食用菌菌渣作为微生物肥料的载体，既能提 高经济效益，又能保护环境，实现资源的合理利用。 另外一种可以作为生物菌肥载体的是畜禽粪便堆肥。在我国，畜禽粪便堆肥 来源十分广泛，同时畜禽粪便还具有易腐熟、成本较低、腐熟后细度高、吸附性 能好等优点，并且氮、磷、钾及有机质养分适宜，畜禽粪便堆肥所具有的这些优 点不但可以给微生物提供良好的生活环境，同时还可以提供微生物繁殖生长所需 的营养成分，是一种较好的微生物载体。 1 6 课题提出的意义及研究内容 中国是一个传统的农业大国，将微生物肥料应用于农业生产之中具有重要的 l O 文献综述 理论与现实意义，在国家的“十五”规划和2 0 1 0 年的远景规划纲要中都提出了 发展生态农业的战略，并且把生物肥料列入“规划“ 和“纲要“ 中。在国家的“十 一五”规划中对微生物肥料又提出了新的要求，其中就包括对秸秆等有机物料中 的快速腐熟功效方面的要求。 近年来关于腐熟剂方面的研究显示，腐解后的有机质比非腐解的有机质更能 提高土壤的生物活性【4 引，腐解后的玉米秸秆对土壤有更好的培肥作用【4 9 5 们，可促 使养分活化，改良土壤的理化性状。但是，秸秆直接还田后，在自然条件下腐解 速度慢，大量还田不但会影响作物的生根和成活，还造成生产管理上的不便。选 育高效的秸秆降解微生物菌剂可以有效的解决以上难题，在机械化还田时配合使 用可以达到秸秆快速腐熟、提高腐解效率的目的。根据有机物料腐熟剂产品的技 术指标要求，有效活菌的数量是保证产品质量的一个重要技术指标；然而，在有 机物料腐熟剂机械化生产的过程中，发酵后的发酵料需要经过晾晒、粉碎等一系 列的加工工序，在这个过程中一些机械设备难免会对微生物菌体造成破坏，导致 产品中活菌数量降低：解决这一问题的有效途径就是提高细菌的芽孢数量，从而 增加发酵料的抗逆性；本研究主要从活菌芽孢数量方面出发，通过对培养基和发 酵条件的优化提高微生物有效活菌的数量。发酵结束后通过试验选择合适的微生 物载体，并定期测定有效活菌的数量来确定合适的微生物载体。通过实验室的初 步研究为有机物料腐熟剂的工业化生产提供一定的技术支持。 腐熟剂降解菌的选择 第二章腐熟剂降解菌的选择 有机物料腐熟剂主要是指用于腐熟降解农作物秸秆、畜禽粪便等有机物料的 微生物菌剂。本实验的目的主要是研制针对农作物秸秆腐解的有机物料腐熟剂。 秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，由于纤维素的结晶状和不溶性的刚 性结构，因此造成了秸秆降解的天然抗性【5 1 1 。本实验从纤维素降解这个关键点出 发，以多种纤维素酶活性作为菌种筛选指标，同时测定菌株的纤维素酶活性和半 纤维素酶活性。 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种来源 巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、C G 酵母菌、米曲霉，这四种菌株均来源于 郑州大学环境与生态研究所实验室。 2 1 2 培养基 P D A 培养基：葡萄糖2 0 9 、土豆2 0 0 9 、水1 0 0 0 m L 。将土豆去皮并切成小块， 加入适量水在锅中煮沸3 0r a i n ，纱布过滤，在滤液中加入葡萄糖和2 0 9 琼脂粉。 自然p H 值，1 2 1 、O 1M P a 高压灭菌3 0r a i n 。 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 9 、蛋白胨l O g 、N a C l5 9 ，水1 0 0 0 m L 。 酵母菌培养基：葡萄糖l Og ，酵母膏5g ，琼脂2 0g ，蒸馏水1 0 0 0m L 。自 然p H 值，1 2 l 、0 1M P a 高压灭菌3 0m i n 。 液体产酶培养基：麸皮与秸秆粉质量比1 ：4 混匀，取2 9 加入到2 5 0 m L 锥 形瓶中，每瓶加入1 0 0 m L M a n d e l s 营养液。自然p H 值，于1 2 1 、0 1M P a 下 灭菌3 0r a i n 。 M a n d e l s 营养液：( N H 4 ) 2 S 0 41 4g ，尿素0 3g ，K H 2 P 0 42g ，M g S 0 4 7 H 2 00 3 g ，F e S 0