重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达

实验报告 题目:单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达 指导老师:邓庆丽 日期:2013/10/31-201311/1一实验目的：(1) 了解和掌握IPTG诱导表达的原理和操作方法。(2) 了解降解物阻遏的现象及其机理。2 实验原理：本实验使用的是载体是已重组好的 pGFPuv ，宿主细胞为大肠杆菌，目的基因的产物为融合蛋白，目的蛋白为绿色荧光蛋白GFP，非目的蛋白即融合部分为标签6His，用于单元四的亲和层析分析。本实验采用的启动子为可调控的强启动子乳糖操纵子lac。操纵子是原核基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成，如下图1所示：乳糖操纵子的调节包括诱导效应和降解物阻遏效应。(1) 诱导表达当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因（本实验中的绿色荧光蛋白基因GFP）不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态，如下图2所示：当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导，如下图3所示： 乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。(2) 葡萄糖降解物的阻遏作用代谢物基因激活蛋白（Catabolite gene Activation Protein）CAP，又称cAMP受体蛋白属于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合DNA促进乳糖操纵子的转录。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制乳糖操纵子的转录。本实验使用的表达载体 pGFPuv 上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因表达的是带 6His 的重组绿色荧光蛋白。在IPTG的诱导下，融合蛋白表达可增强105倍，并且可用金属螯合亲和层析分离纯化，最终获得纯的重组绿色荧光蛋白。三材料与试剂：(1)材料工程菌：BL21(DE3)p32a、BL21(DE3)pGFPuv(2)试剂LB 液体培养基 ：蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g，加800mL双蒸水溶解，用10M NaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。 分装，高压灭菌，4保存。氨苄青霉素溶液：无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20保存，使用终浓度为50g/mL或100g/mL。IPTG溶液（100 mM）：将238.3mg IPTG溶解于10mL双蒸水，0.22m细菌滤器过滤除菌，分装，-20保存备用，贮存浓度为100 mM。20%葡萄糖溶液超声平衡缓冲液：50mM Tris-HCl, 500mM NaCl pH7.04 实验仪器：超净工作台、 低温摇床、高速冷冻离心机、超声破碎仪等。5 实验步骤、现象、结果及分析：1.工程菌的活化(10月30号教师准备) 分别挑取工程菌BL21(DE3)p32a和BL21(DE3)pGFPuv的单菌落接种到5mlLB液体培养基（含氨苄，终浓度为100g/mL，以下同）晚上7点接种37、250rpm培养14h过夜至对数生长期第二天早上9点左右取出放入4 备用2.放大(10月31号) 往装于500ml三角瓶中的170ml LB液体培养基中加入170L Amp，摇匀，取三支灭菌试管，用5ml枪各加入5ml LB液体培养基(含氨苄），分别编号为1#，2#，3#，剩下的装于三角瓶中的液体培养基（含氨苄），编号6#， 全部按1：50的比例接种菌种，操作如下：1#接种100L BL21(DE3)p32a2#接种100L BL21(DE3)pGFPuv3#接种100L BL21(DE3)pGFPuv6#接种3mL BL21(DE3)pGFPuv下午接种于37、250rpm培养约2h，顺便配制单元四蛋白质纯化及电泳所需试剂。3.诱导1#、 2#不需处理3#加入20葡萄糖250L，至终浓度为1.0；加入25L 100mM IPTG至终浓度为0.5mM。6#加入100mM IPTG约750 L至终浓度为0.5mM。于25、250rpm培养过夜4.收菌 （注意采集标本并编号）（11月1号早上9点开始）从6#三角瓶培养的150mL菌液中取出5mL置于一支试管中（编号为4#）。(1)分别从2 # ，3#， 4#培养物各取100L于EP管用于电泳。（相应编号为S2,S3,S4）。 (2)将1#，2 # ，3#， 4#试管中的菌液分别收集到4个1.5mLEp离心管中(收3次），编上相应编号。 1#，2 # ，3#离心弃上清(10000rpm离心1min)； 4#第三次离心后上清液收集到另一个Ep管，编号为5#。 6#三角瓶中剩余菌液用两管50mL离心管于8000rpm，4，离心5min，弃上清收集菌体。5.观察及超声破碎于紫外灯下观察1# -5#管收集的菌体或上清液，观察哪支管有荧光（荧光强弱），记录观察到的现象，并拍照。结果如下图一所示：图一：1# -5#管紫外观察结果，从左到右依次为1# -5#管。(1)全部菌体用50ml超声平衡缓冲液重悬（50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl pH7.0)，即每管用25ml超声缓冲液重悬，用枪吹散，后倒入50ml烧杯中，置于装满碎冰的1L烧杯中，使小烧杯高出大烧杯1cm左右，便于超破时观察菌液液面。(2)超声波破菌，破碎之前测得OD600为0.381，三周期后测得OD600为0.134，然后用50ml离心管收集并于8000rpm，4，离心10min，取上清（弃沉淀），保存于-20冰箱，下周层析实验备用。六.思考与讨论(1) 对紫外灯下观察到的结果作出解释。答：图一中从左到右依次为1# -5#管，可以看出4#管绿色荧光最强，2#次之，其余1#、3#、5#均无颜色。原因是1#管中质粒为非重组质粒p32a，不含GFP，因而无法表达产生绿色荧光蛋白，为阴性对照；2#管-4#管中大肠杆菌均含重组质粒 pGFPuv，2#管中未经诱导，绿色荧光蛋白为本底水平的表达，因而显示出淡淡的绿色荧光；4#管中经过IPTG的诱导表达，GFP产量很高，因而显示出很深的绿色荧光；而3#管虽然加入了IPTG进行诱导表达，但是还加入了浓度为1%的葡萄糖，导致cAMP浓度降低，从而抑制了乳糖操纵子上游的激活位点，抑制了乳糖操纵子的转录，因而无法产生绿色荧光；5#管为4#管最后一次离心的上清液，因菌体未破碎，因而上清液中不含GFP，因而也就无法产生绿色荧光。(2) 为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD600浓度约为0.5时加入IPTG？ 答：大肠杆菌要在其OD600浓度约为0.5时基本进入对数生长期，菌体生长旺盛，增殖快，对诱导表达而言，会有一个比较好的收率。若浓度较低时，菌体吸收的营养都用于表达外源蛋白，势必会严重影响它的繁殖，菌体量少了，总的外源蛋白表达量也会变少，当在对数增长期，培养液中已经有足