细胞核的分离与纯化及RNA、DNA的定量测定.ppt_第1页
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文档简介

喻娟娟,生物化学与分子生物学教研室,联系电话:Email: ,细胞核的分离纯化 及RNA、DNA的定量测定,实验六,1. 了解细胞核分离纯化的基本原理和方法 2. 掌握DNA、RNA定量测定的原理及方法 3. 掌握离心机的使用,一、细胞核的分离与纯化(上午) 二、RNA的定量测定 三、DNA的定量测定,(下午),一、细胞核的分离与纯化,DNA、RNA在细胞中的分布:,DNA,胞核内(98%),胞质内(2%),RNA,胞核内(10%),胞质内(90%),核酸的种类:,DNA、RNA,结论:DNA主要存在于细胞核, RNA主要存在于细胞质。,二、核酸的种类及其分布,核 酸,核苷酸,磷 酸,碱 基,戊 糖,定糖法(戊糖的差异),三、核酸的鉴定,浓HCl, 3H2O,+, D核糖,糠醛,糠醛,3,5二羟基甲苯,绿色化合物,RNA,水解, D核糖 + Pi + A.G.C.U,地衣酚法:,(1)核糖核酸RNA的测定,DNA,水解,D脱氧核糖 + Pi + A.G.C.U,-H2O,硫酸,脱氧核糖, 羟基酮基戊醛,蓝色化合物,二苯胺法:,(2)脱氧核糖核酸DNA的测定,1、0.25mol/L蔗糖柠檬酸(含3.3 mmol/L CaCl2) 称取蔗糖86g及CaCl2363mg,用1.5拧檬酸液溶解并稀释至1000ml。 2、0.88mol/L蔗糖柠檬酸液(含3.3mmol/LCaCl2) 称取蔗糖301g及CaCl2363mg,用1.5柠檬酸液溶解并稀释至1000ml。 3、核洗液:即0.05mol/L,TrisHCl(pH7.5)0.15mol/L NaCl液。 在0.2mol/L TrisHCl pH7.5缓冲液250ml中加NaCl8.7g再用蒸馏水稀释至1000ml。 4、 1.5拧檬酸 5、0.9NaCl 6、0.02N NaOH 7、离心机 8、水浴箱 9、常规玻璃仪器,试剂与器材,用颈椎脱臼法杀死小白鼠后,迅速剖开腹部取出肝脏,除去结缔组织,尽快置于盛有0.9%NaCl的小烧杯中,反复洗涤,尽量除去血液。洗完后将肝脏一分为二,每个小组半个肝,直接将半个肝放在小烧杯里剪碎,剪碎的肝脏放入匀浆器中,加入 1.5柠檬酸钠溶液4.5ml,反复研磨制成匀浆,从而破碎细胞。研磨完后,将匀浆液用单层纱布进行过滤,以除去未研碎的组织。,(1)肝细胞匀浆的制备,(2)分离细胞质和细胞核,将过滤好的匀浆液,放入普通离心机,以3500r/min的转速,离心15min。缓慢倒出上清液(细胞质),移入另一试管中,保留待测定核酸时使用。 余下的沉淀物为粗制的细胞核,加入0.25mol/L蔗糖-拧檬酸溶液1ml ,用玻捧搅匀,制成细胞核悬液。 另取离心管一支,先加入0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液9ml,用滴管吸取上述核悬液,沿管壁缓缓铺于0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液液面上,再以2000r/min转速离心10分钟,倾去上层液,将管倒立于滤纸上,以吸干余液。沉淀为初步纯化的细胞核。 加入TrisHClNaCl核洗液5ml洗涤沉淀,以2000r/min离心10min,除去上层液。得到的白色沉淀即为纯化的肝细胞核。 加5ml 0.02mol/L的NaOH使细胞核溶解为核液,保留,待测定核酸。,半个肝脏1.5%柠檬酸溶液4.5ml,制成匀浆,单层纱布过滤1次,滤液,离心:3500r/min;15min,上清液 (保留!),沉淀,加入0.25mol/L 蔗糖柠檬酸溶液1ml,核悬液,沿壁缓铺于9ml 0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上,离心:2000r/min;10min,上清液(弃去),沉淀,核洗液5ml洗涤沉淀,上层液(弃去),沉 淀,纯化的细胞核,5ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核,待测样品,鉴定,离心:2000r/min,10min,细胞核的分离与纯化实验流程,2. 显色与比色:取试管三支,编号,按下表操作:,1. 水解:取试管二支,编号,按下表操作:,混合各管,沸水浴(10min),冷却,加入5%三氯醋酸 (8ml),搅匀后离心,2000r/min;5min,上清液,立即混合各管,沸水浴(10min),冷却,660nm比色测定,二、RNA的定量测定,混合各管,冷却,离心,上清液,立即混合各管,冷却,2000r/min;5min,三、DNA的定量测定,2. 显色与比色:取试管三支,编号,按下表操作:,1. 水解:取试管二支,编号,按下表操作:,沸水浴(10min),沸水浴(12min),595nm比色测定,表1. RNA的定量结果,提取液中RNA浓度(ug/ml)=显色反应试管中RNA含量稀释倍数,(细胞质液稀释倍数为10倍,细胞核液的稀释倍数为5倍),表2. DNA的定量结果,酸性溶液,取用要小心。 混匀要充分,并且要注意安全,防止液体溢出。 沸水浴操作时,要注意自己和别人的安全。 离心完后,一定先将上清液转出到另一试管,再吸取所需量的水解液。,3. 除了定糖法来测定DNA和RNA的含量,还有已经学

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