细胞核的分离与纯化及RNA、DNA的定量测定.pptVIP

喻娟娟,生物化学与分子生物学教研室,联系电话:Email: ,细胞核的分离纯化 及RNA、DNA的定量测定,实验六,1. 了解细胞核分离纯化的基本原理和方法 2. 掌握DNA、RNA定量测定的原理及方法 3. 掌握离心机的使用,一、细胞核的分离与纯化（上午） 二、RNA的定量测定 三、DNA的定量测定,（下午）,一、细胞核的分离与纯化,DNA、RNA在细胞中的分布：,DNA,胞核内(98%),胞质内(2%),RNA,胞核内(10%),胞质内(90%),核酸的种类：,DNA、RNA,结论：DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。,二、核酸的种类及其分布,核 酸,核苷酸,磷 酸,碱 基,戊 糖,定糖法（戊糖的差异）,三、核酸的鉴定,浓HCl, 3H2O,+, D核糖,糠醛,糠醛,3，5二羟基甲苯,绿色化合物,RNA,水解, D核糖 + Pi + A.G.C.U,地衣酚法:,（1）核糖核酸RNA的测定,DNA,水解,D脱氧核糖 + Pi + A.G.C.U,-H2O,硫酸,脱氧核糖, 羟基酮基戊醛,蓝色化合物,二苯胺法:,（2）脱氧核糖核酸DNA的测定,1、0.25mol/L蔗糖柠檬酸（含3.3 mmol/L CaCl2） 称取蔗糖86g及CaCl2363mg，用1.5拧檬酸液溶解并稀释至1000ml。 2、0.88mol/L蔗糖柠檬酸液（含3.3mmol/LCaCl2） 称取蔗糖301g及CaCl2363mg，用1.5柠檬酸液溶解并稀释至1000ml。 3、核洗液：即0.05mol/L，TrisHCl（pH7.5）0.15mol/L NaCl液。 在0.2mol/L TrisHCl pH7.5缓冲液250ml中加NaCl8.7g再用蒸馏水稀释至1000ml。 4、 1.5拧檬酸 5、0.9NaCl 6、0.02N NaOH 7、离心机 8、水浴箱 9、常规玻璃仪器,试剂与器材,用颈椎脱臼法杀死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，除去结缔组织，尽快置于盛有0.9%NaCl的小烧杯中，反复洗涤，尽量除去血液。洗完后将肝脏一分为二，每个小组半个肝，直接将半个肝放在小烧杯里剪碎，剪碎的肝脏放入匀浆器中，加入 1.5柠檬酸钠溶液4.5ml，反复研磨制成匀浆，从而破碎细胞。研磨完后，将匀浆液用单层纱布进行过滤，以除去未研碎的组织。,（1）肝细胞匀浆的制备,（2）分离细胞质和细胞核,将过滤好的匀浆液，放入普通离心机，以3500r/min的转速，离心15min。缓慢倒出上清液（细胞质），移入另一试管中，保留待测定核酸时使用。 余下的沉淀物为粗制的细胞核，加入0.25mol/L蔗糖-拧檬酸溶液1ml ，用玻捧搅匀，制成细胞核悬液。 另取离心管一支，先加入0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液9ml，用滴管吸取上述核悬液，沿管壁缓缓铺于0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液液面上，再以2000r/min转速离心10分钟，倾去上层液，将管倒立于滤纸上，以吸干余液。沉淀为初步纯化的细胞核。 加入TrisHClNaCl核洗液5ml洗涤沉淀，以2000r/min离心10min，除去上层液。得到的白色沉淀即为纯化的肝细胞核。 加5ml 0.02mol/L的NaOH使细胞核溶解为核液，保留，待测定核酸。,半个肝脏1.5%柠檬酸溶液4.5ml，制成匀浆,单层纱布过滤1次,滤液,离心：3500r/min；15min,上清液 （保留！）,沉淀,加入0.25mol/L 蔗糖柠檬酸溶液1ml,核悬液,沿壁缓铺于9ml 0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上,离心：2000r/min；10min,上清液（弃去）,沉淀,核洗液5ml洗涤沉淀,上层液（弃去）,沉 淀,纯化的细胞核,5ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核,待测样品,鉴定,离心：2000r/min，10min,细胞核的分离与纯化实验流程,2. 显色与比色：取试管三支，编号，按下表操作:,1. 水解：取试管二支，编号，按下表操作：,混合各管,沸水浴(10min),冷却,加入5%三氯醋酸 (8ml),搅匀后离心,2000r/min；5min,上清液,立即混合各管,沸水浴(10min),冷却,660nm比色测定,二、RNA的定量测定,混合各管,冷却,离心,上清液,立即混合各管,冷却,2000r/min;5min,三、DNA的定量测定,2. 显色与比色：取试管三支，编号，按下表操作:,1. 水解：取试管二支，编号，按下表操作：,沸水浴(10min),沸水浴(12min),595nm比色测定,表1. RNA的定量结果,提取液中RNA浓度（ug/ml）=显色反应试管中RNA含量稀释倍数,（细胞质液稀释倍数为10倍，细胞核液的稀释倍数为5倍）,表2. DNA的定量结果,酸性溶液，取用要小心。 混匀要充分，并且要注意安全，防止液体溢出。 沸水浴操作时，要注意自己和别人的安全。 离心完后，一定先将上清液转出到另一试管，再吸取所需量的水解液。,3. 除了定糖法来测定DNA和RNA的含量，还有已经学