微量克氏定氮法定量测定蛋白质含量.ppt

微量克氏定氮法测定蛋白质含量,一、实验目的,掌握微量克氏定氮法定量测定蛋白质含量的原理和操作技术。,二、实验原理,天然含氮有机化合物（如蛋白质）与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在克氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸气蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量（mol）相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。,因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将克氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 整个反应过程可分为消化、蒸馏及滴定三大步骤。 样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，氮转变出的氨，进一步与硫酸作用生成硫酸铵，此过程通常称之为“消化”。,但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以加快反应速度。以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下： CH3NH2COOH + 3H2SO4 3CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 （1） 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 （2） (NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 （3） 反应（1）、（2）在克氏定氮烧瓶中完成。反应（3）在克氏定氮仪内进行。,浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨。借水蒸气将产生的氨蒸馏到定量、定浓度的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。最后根据所用标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。,三、实验器材,1微量克氏定氮仪：参见图5-1，1套/组。 2克氏定氮烧瓶：2只/组。,3取样器：，5mL、1 mL各1只/组。,使用指南：接好套头（不漏气）通过旋钮调节容量（如500表示5mL）用活塞第一挡吸液用活塞第一挡和第二挡放液换套头继续使用。注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中而损坏仪器。 4电炉：公用。 51微量滴定管（5 mL）：1只/2组。 6酒精灯：1只/组。 7锥形瓶（100 mL）：4只/组。 8铁架台、十字夹、龙爪、打火机、表面皿、吸管、量筒等。,五、实验操作,.消化：将两个50mL的克氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口附近），一只烧瓶内加1.0mL蒸馏水，作为空白。另一只烧瓶内加入1.0mL样液（卵清蛋白液）。然后用取样器各加浓硫酸2mL（取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上），用药勺加硫酸钾硫酸铜混合物约20mg（不必称重，一点点即可），所有试剂要尽量加到克氏定氮烧瓶的底部。烧瓶口插上小漏斗（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化，参见图5-3，注意先启动抽风机。消化时间为24h。在消化时可以同时进行第二步。,消化装置,.蒸馏：取100mL锥形瓶3只，洗涤干净，用取样器各加入2%硼酸溶液5.0mL，加入几滴指示剂，溶液显紫色，用 表面皿盖好备用。如锥形瓶内液体呈绿色，需重新洗涤。 安装好微量克氏定氮仪。微量克氏定氮仪实际上是一套蒸馏装置，注意保证每个夹子夹紧而不漏气，保证加样口的小漏斗口朝上并斜靠在定氮仪上（这可以通过调整其下方夹子的方位来实现）。,a)蒸馏瓶的洗涤 参见图5-6，将自来水由5经7注入到蒸馏瓶夹层2（即蒸汽发生室）中，使水面达到蒸馏瓶颈部的转弯处。把装有蒸馏水的锥形瓶9置于冷凝器4下方，并将冷凝器下方的导管12下端插入锥形瓶液面以下，再将少量蒸馏水由漏斗3注入到蒸馏瓶的反应室1中，把所有夹子夹紧，打开冷凝水。用酒精灯11将蒸馏瓶夹层2内的水煮沸，然后移去火源，锥形瓶9中的蒸馏水就会从冷凝器下方的导管 12倒流到蒸馏瓶的反应室1内，再倒流至蒸馏瓶的夹层2中，由废液排出口8排出。按照上述方法将仪器洗涤23次。最后，反应室1中的余液可以按下法清空：把所有夹子夹紧，将蒸馏瓶夹层2内的水煮沸，先移去锥形瓶9，然后移去火源，反应室1中余液将倒流至夹层2中，由7排出。以后每次在做下一次蒸馏之前都要先将蒸馏瓶洗涤23次，并将反应室1清空。,b)空白和样品的蒸馏 把装有5.0mL的2%硼酸溶液的锥形瓶9置于冷凝器的下方，将冷凝器下方的导管12下端插入液面以下，锥形瓶内须事先加入指示剂（注意此时的颜色，它将是后面滴定终点的颜色）。先将克氏烧瓶中消化好了的空白消化液由小漏斗3注入到蒸馏瓶的反应室1中，用蒸馏水洗涤克氏烧瓶2次（每次约2mL），洗涤液皆由漏斗3注入反应室1。用取样器取40%氢氧化钠溶液10mL，注入小漏斗（小漏斗必须始终保持口朝上的状态），放松夹子，使其缓缓流入反应室1。当小漏斗内仍有少量NaOH溶液时，立即夹紧夹子（以上操作勿将NaOH溶液溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上）。再加约3mL蒸馏水于小漏斗内，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。把所有夹子夹紧，打开冷凝水，开始用酒精灯加热，将蒸馏瓶夹层2内的水煮沸。注意，在样品蒸馏的整个过程中，要保持火苗的稳定，严禁中途移去火源，以防倒吸。从蒸馏瓶内的水溶液沸腾开始计算时间，大约10min即可蒸馏完毕。将导管12的下端抽出液面，继续蒸馏1min，使导管内的余液落回锥形瓶9中，移开锥形瓶，用表面皿盖好等待滴定。移去火源，反应室1中的残液将会倒流至夹层2中，由8排出。将蒸馏瓶洗涤23次，并将反应室1清空，按空白蒸馏的方法进行样品蒸馏。,改良式微量克氏定氮仪各部示意图,.滴定：参见图5-6，将微量滴定管先后用蒸馏水和0.01mol/L的HCl溶液润洗，用洗耳球将0.01mol/L的HCl溶液吸入微量滴定管中，滴定锥形瓶中的硼酸液至呈淡葡萄紫色（也就是前面加了指示剂后的标准硼酸溶液的颜色）。记录所耗HCl溶液毫升数。,.再次将蒸馏瓶洗涤干净，拆卸克氏定氮仪装置，清洗所使用过的所有玻璃仪器，清洗取样器套头，整理好桌面上的仪器和