《遗传与发育》PPT课件.ppt

学习要点,1、真核生物的基因组 2、真核生物基因组DNA序列的复杂度 3、DNA序列的类别 4、卫星DNA 5、基因家族、基因簇和假基因的含义 6、真核生物基因组的包装过程 7、真核生物基因的丢失、扩增和重排 8、遗传标记的类型和特点、应用,遗传学,一、 真核生物基因组,一、基因组与C值 基因组：一个物种单倍体的染色体的数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组 （genome）。 C值：一个物种单倍体基因组的DNA含量是相对恒定的，它通常称为该物种DNA的C值 。 不同物种之间C值相差极大。,遗传学,遗传学,遗传学,遗传学,二、真核生物基因组的结构特点 1真核生物基因组大部分位于细胞核中，一般由多条染色体组成，每条染色体又是由DNA分子与蛋白质稳定地结合成染色质的多级结构 . 2每条染色体的DNA分子具有多个复制起点，基因内存在着不表达的插入序列，即内含子。,遗传学,3存在大量不编码蛋白质的DNA序列，如果蝇的基因数估计约为5000个，占基因组DNA序列的10左右，人的基因数推测为50000个，约占基因组DNA序列的1。 4真核生物的蛋白质编码基因往往位于基因组DNA单拷贝序列中，除单拷贝序列外还存在大量重复序列（repeat sequence），重复序列的拷贝数可高达百万份以上，在人的基因组中，至少具有20份拷贝的DNA可占总DNA的30左右。,遗传学,5真核生物基因组中，有许多结构相似、功能相关的基因组成所谓的基因家族（gene families）。同一基因家族的成员可以紧密地排列在一起，成为一个基因簇。也可以分散在同一染色体的不同部位，或位于不同的染色体上。 6真核生物除了主要的核基因组外，还有细胞器基因组，而且细胞器基因组对生命是必须的，,遗传学,二、 真核生物基因组DNA序列 的复杂度,一、重复序列的检测 通过复性动力学来检测基因组DNA序列的复杂性。 也就是通过DNA的变性（denaturation）和复性（renaturation）反应的动力学过程分析DNA序列的性质。 公式： 单链消失速度的微分方程为：,遗传学,其中：C为单链DNA的浓度（单位是每升的核苷酸摩尔数）； t为时间（单位为s）； k为重组速率常数（单位是Lmols），k取决于阳离子浓度、温度、片段大小和DNA序列的复杂性。,遗传学,当t=0时，CC0，表明所有DNA都是单链，C0为DNA总浓度。,复性的分数CC0是起始浓度和经过时间的乘积C0t的函数,遗传学,遗传学,从方程式可见控制复性反应的参数是C0t，如当tt1/2时，即,遗传学,如果基因组中每一种基因只有一个，即都是单拷贝序列，那么基因组愈大则基因组的复杂性愈大，复性速率愈小，k也愈小，所以C0t1/2与非重复序列的基因组大小呈正比。即,遗传学,二、DNA序列的类别 （一）单拷贝序列（unique sequence）亦称非重复序列（nonrepetitive sequence）在一个基因组中只有一个拷贝或2-3个拷贝。 （二）中度重复序列（moderately repetitive sequence）中度重复序列中的重复单位平均长度约300bp，重复次数为10102。,遗传学,（三）高度重复序列（highly repetitive sequence）顾名思义，高度重复序列就是在基因组中存在大量拷贝的序列，一般重复次数在106以上。通常这些序列的长度为6200bp，如卫星DNA。,遗传学,遗传学,三、卫星DNA 卫星DNA(satellite DNA)是一类高度重复序列 DNA在介质氯化铯中作密度梯度离心，离心速度可以高达每分钟几万转；此时DNA分子将按其大小分布在离心管内不同密度的氯化铯介质中，小的分子处于上层，大的分子处于下层；从离心管外看，不同层面的DNA形成了不同的条带。,遗传学,根据荧光强度的分析，可以看到在一条主带以外还有一个或多个小的卫星带。这些在卫星带中的DNA即被称为卫星DNA，这种DNA的GC含量一般少于主带中的DNA，浮力密度也低。,遗传学,卫星DNA按其浮力密度的大小可以分成I、四类，其浮力密度分别是1687，1693，1697和1700 gcm3。各类卫星DNA都是由各种不同的重复序列家族所组成。卫星DNA通常是串联重复序列。,遗传学,卫星DNA按其重复单元的核苷酸的多少，可以分为两类。一类是小卫星DNA(minisatellite DNA)，由几百个核苷酸对的单元重复组成。另一类是微卫星DNA(microsatellite DNA)，由2个到20个左右的核苷酸对的单元重复成百上千次所组成。,遗传学,三、 基因家族,一、基因家族的类型和Alu家族 、含义：真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样的一组基因称为一个基因家族（gene family）。 、分布 可在分布在一条染色体上，也可以分布在不同染色体上。,遗传学,、分类 简单的多基因家族；复杂的多基因家族；不同场合表达的复杂多基因家族（图7-7）。,遗传学,遗传学,、常见的基因家族 5SrRNA基因家族 海胆和果蝇的5个组蛋白基因家族 、Alu家族（Alu family） 成员众多，大约平均每6kbDNA就有一个，总数大约有300000个。都是由300bp的短序列构成。 结构特点：,遗传学,在这些300bp的顺序中含有一个限制性内切酶AluI的特异性识别顺序AGCT，由此将这些300bp的序列切割为两个片段，一个片段为170bp，另一片段为130bp，说明这是一类长度相似、性质相似的重复序列，因此称之为Alu家族。 、其他家族 如KpnI家族、Hinf家族与多聚（dT-dG）家族 等。,遗传学,二、基因簇和假基因 、基因簇 一个基因家族的成员紧密连锁成簇状排列在某一染色体上，形成一个基因簇（gene cluster）。 、假基因 在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，但在结构和DNA序列上与有功能的基因具有相似性，这种成员称为假基因（pseudogene）。,遗传学,四、 真核基因组的包装,一、DNA与染色体 1、染色体和染色质 2、染色体的主要组分 二、核小体结构和包装模型 核小体是构成染色质的基本结构单位。其结构如下图所示。,遗传学,遗传学,从核小体到染色体 140bp的双螺旋DNA缠绕于4种组蛋白形成的八聚体外面 -核小体 理论：140bp0.34nm47.6nm，实际核小体为直径9nm， DNA分子长度被压缩了56倍。 60bp的双螺旋DNA及组蛋白1-间隔区,遗传学, 每6个核小体通过间隔区相连-空心螺线管 空心螺线管外径30nm ,螺距10nm， DNA分子长度又被压缩了6倍。,遗传学, 120个螺线管又盘绕-超螺线管（染色体的单位纤维） 超螺线管直径400nm，高30nm，长1060nm, DNA分子长度又被压缩了40倍。,遗传学, 超螺线管进一步螺旋或盘旋-染色单体 染色单体实际长度为210nm, DNA分子长度又被压缩56倍。,遗传学, 人体每个细胞中长约1.7米的DNA双螺旋链经许多核小体组成的串珠样纤维经多层次螺 化，最终压缩了约8400倍形成染色单体。46个染色单体长仅200m左右，储于细胞核中。,遗传学,遗传学,核小体组装成染色体的过程,遗传学,五 、 真核生物基因的丢失、 扩增与重排,一、基因的丢失 通过丢失染色体，丢失某些基因而去除这些基因的活性的现象。,遗传学,二、基因扩增 基因内某些基因的拷贝数专一性地大量增加的现象。 三、基因重排 指DNA分子核苷酸序列的重新排列。,遗传学,六、遗传标记,遗传标记的特征: 亲本间存在着多态性（即差异），也就是说具有 可识别性。 亲本间存在的多态性在后代中可以重演，即具有 可遗传性。,遗传学,遗传标记的类型: 形态标记,或可见标记（visible markers） 细胞学标记 （cytological markers） 同工酶标记（isozyme markers） DNA标记（DNA markers）,遗传学,形态标记或可见标记（visible markers）: 是指在个体上可以看见的遗传标记，如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆）等。,遗传学,水稻部分形态学标记性状及其基因 性状分类 标记性状 已鉴定的基因举例 色素 紫色叶耳 Pau 紫色叶舌 Plg 紫色谷壳 Pr 黑色谷壳 Bh 紫色柱头 Wh 紫色叶鞘 Psh 籽粒 有芒 An-1, An-2, An-3 内颖发育不全 dp-1, dp-2 大胚 ge 圆粒 rk-1,rk-2 多雌蕊 mp-1,mp-2,遗传学,细胞学标记（cytological markers）: 是指细胞学上能观察到的遗传标记，主要是指染色体上可以识别的特征，如染色钮（玉米第9染色体末端）、带纹等。,遗传学,同工酶标记（isozyme markers）: 是指以同工酶带型为标记，通过电泳使同工酶带型产生多态性，如酯酶同工酶、过氧化氢酶同工酶等。,遗传学,DNA标记（DNA markers）: 是指以DNA片段为标记，通过DNA片段的电泳使DNA产生多态性，如RFLP等。,遗传学,形态标记、细胞学标记、同功酶标记存在的问题是： 这些标记在数量上都是有限的。虽然经过近百年的努力，目前这些标记的数量仍然不多，因此限制了这些标记的利用。 这些标记在操作上比较麻烦，难以开展大规模的研究和利用。,遗传学,DNA标记具有的优势： 在数量上是巨大的； 操作相对简单，适合大规模开展工作； 标记比较明显，容易识别； 受环境影响少，标记本身就是遗传物质；,遗传学,同工酶标记和DNA标记都是分子标记。但目前分子标记一般指DNA标记。,遗传学,RFLP (Restriction fragment length polymorphism)，译为限制性片段长度多态性。 Botstein 等1980年首次发现，以后被大量利用，在微生物、植物、动物和人类上都得到了广泛的利用。RFLP标记是最早利用的DNA标记，在技术上比较复杂，涉及多个环节。,6.2 RFLP 6.2.1 DNA提取,遗传学,遗传学,RFLP标记是最早利用的DNA标记。做RFLP分析，需要提取生物体内的DNA，并对DNA进行体外处理。因此，DNA提取是RFLP分析的第一个环节。 DNA提取的方法很多，不同的生物所用的方法也不同。DNA提取的基本原理和过程主要包括以下几个方面。,遗传学,生物体样品的选取: 动植物生物体由不同的器官和组织构成。应选用生物体中生长旺盛的器官、组织和细胞提取DNA，如植物幼苗或新长出的叶片、动物的血等。DNA提取的效果由DNA的质量和得率来评价。选用适当的生物器官和组织是获得高质量和高得率DNA的保证。取样后应尽快在低温中保存，长时间保存应在超低温中保存。,遗传学,细胞的裂解： 作为DNA提取的开始，多细胞的生物体样品首先需要经过研磨，使样品破粹。然后样品粉末再通过裂解液把细胞裂解。裂解液通常是由Tris Tris（hydroxymethyl）aminomethane，即三羟基甲基氨基甲烷 缓冲液加裂解剂组成，如SDS（Sodium dodecyl sulfate）即十二烷基磺酸钠、CTAB（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide）即十六烷基三甲基溴化铵等。,遗传学,蛋白质的沉淀： 通常使用能使蛋白质变性的试剂，如醋酸钾、醋酸钠、氯仿等。 RNA的消化： 通常使用RNA酶。,遗传学,DNA沉淀： 通常使用冰冻的异丙醇（2-ropanol）、70%乙醇等。 DNA溶解： 通常使用TE缓冲液（10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0，灭菌）。 EDTA（didodium ethylenediaminetetra-acetate）即乙二胺四乙酸。,遗传学,6.2 RFLP 6.2.2 Southern blotting,印迹转移（Southern blotting）是由E.M. Southern于1975年发明的，故名。,遗传学,限制性片段的产生： DNA是大分子。水稻基因组的大小是4.3x108bp,小麦是1.6x1010bp。 限制性内切酶能识别DNA上的限制性位点。 利用限制性内切酶可以把DNA分解为具有一定长度的片段，这就是限制性片段。,遗传学,遗传学,电泳： 电泳用的凝胶由琼脂糖（agarose）制备，琼脂糖的浓度通常为0.9-1.0%。 酶切后的DNA样品通过电泳，使DNA片段分离,并按分子量的大小排列。,遗传学,杂交膜的制备： DNA从凝胶转移到特制的杂交膜上，常用Hybond N+（Amersham） 的尼龙膜。 凝胶的处理： 脱嘌呤处理：0.25M HCl 变性处理：0.4M NaOH DNA转移： 转移液：0.4M NaOH。 洗膜： 洗膜液：2xSSC缓冲液,遗传学,6.2 RFLP 6.2.3 探针的制备,用于RFLP分析的探针（probe）是DNA片段，长度约0.5-2.5kb。探针的来源有：基因组的随机片段、cDNA 等。 探针以克隆的方式保存，以质粒（plasmid）载体，如pUC19等，通过大肠杆菌繁殖。,遗传学,载体： 用作载体的质粒必须具备三个特性： 一个复制起始点（Ori）； 一个显性的选择标记，如氨苄青霉素（ampicillin）抗性基因（Ampr）； 单一的限制性酶切位点。,遗传学,遗传学,探针的标记(labeling)： 利用放射性同位素（32P-dCTP）等对探针进行标记，以跟踪探针。 同位素标记：利用DNA聚合酶（Klenow），在DNA复制的过程中，把32P-dCTP合成到DNA片段上。,遗传学,6.2 RFLP 6.2.4 DNA杂交,预杂交: 杂交液 + 鲑精DNA ( sheared salmon sperm DNA, SSS DNA ) 杂交液: 20 X SSPE 250 ml 100 X Denhardts 50 ml 10% (w/v) SDS 50 ml Make up to 1000 ml 65C保温，2小时以上。 杂交: 把已标记的探针加入到杂交液中，加入经预杂交的杂交膜。 65C保温，过夜。,遗传学,洗膜： A. 2X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min; B. 1X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min; C. 0.5X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min,遗传学,6.2 RFLP 6.2.5 放射自显影,包膜: 用塑料薄膜把已杂交的杂交膜包起来。放入暗盒中。 照射： 放入X光片，紧压。-80 C冷柜中曝光2-4天。 显影： 在暗房中取出X光片，显影、定影、冲冼。,遗传学,6 Molecular Markers 6.3 PCR,PCR (polymerase chain reaction)即多聚酶链式反应，是一种DNA扩增（DNA amplification）技术。它是由美国Cetus公司人类遗传实验室的Mullis K.B.等人于1983年发明的。,遗传学,6.3 PCR 6.3.1 DNA复制的原理,DNA复制的半保留性: DNA既然是主要的遗传物质，它必然具备自我复制的能力。DNA分子的复制首先是从它的一端沿氢键逐渐断开。当双螺旋的一端拆开为两条单链，而另一端仍保持双链状态时，以分开的双链为模板，从细胞核内吸取游离的核苷酸，按照碱基配对的方式（即A与T配对，G与C配对），合成新链。新链与模板链互相盘旋在一起，形成DNA的双链结构。这样，随着DNA分子双螺旋的完全拆开，就逐渐形成了两个新的DNA分子。由于新合成的DNA分子保留了原来母DNA分子双链中的一条链，因此DNA的这种复制方式称为半保留模式（Semiconservative model）。,遗传学,DNA复制的半不连续性 ： 当双链DNA分子解链成为两个单链的DNA模板以便DNA复制时，DNA分子就象“Y”型，这个结构称为复制叉（replication fork）。复制时，复制叉向一个方向移动。 在复制叉的两条链上，一条链的35方向与复制叉的移动方向相同，这条链能够连续不断地合成新链。而另一链的35方向与复制叉的移动方向相反，这条链只能以不连续的方式合成新链。因此，整个DNA复制是半不连续的（semidiscontinuous）。,遗传学,引物和DNA聚合酶： 在DNA复制的过程中，引物酶（primase）复合体（引物单体）结合DNA单链上，合成短片段的RNA引物（primer）。在DNA多聚酶（polymerase）的作用下，以引物链为起点，合成与模板链互补的DNA链。,遗传学,遗传学,6.3 PCR 6.3.2 PCR技术,基本原理: PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。其主要步骤是： 高温变性：置待扩增DNA于高温下解链成为单链模板。 低温退火：人工合成的两个寡聚核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合。 适温延伸：DNA聚合酶在72C将单核苷酸从引物3端开始掺入,沿模板53方向延伸，合成DNA新链。,遗传学,由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经过25-30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上至少可扩增105，一般可106-107。,遗传学,PCR反应液（例子）: 10x PCR buffer 2.5 15mM MgCl2 2.5 (可变) 1mM dNTP 5.0 Taq (1u) 1.0 (可变) Primer (100ng/l) 1.0 x 2 Genomic DNA (20ng/l) 5.0 H2O x Total 25.0 (l) 10x PCR buffer： 500mM KCl 200mM Tris-HCl（pH8.2） 0.01% gelatin,遗传学,Primers bind to DNA strands (30-65C, 30 s),Denature to separate DNA strands (94 C, 30 s),Polymerase synthesizes new DNA strands (65-75 C, 2-5 min),Denature DNA sample to separate DNA strands (94 C, 5 min),The PCR cycle,遗传学,影响PCR的因素： PCR方法操作简单，但影响的因素较多，欲得到好的反应结果，需要根据不同的情况，摸索最适条件。 A模板 B引物 CMg+浓度 DdNTP浓度 ETaqDNA聚合酶用量 F循环参数,遗传学,TaqDNA聚合酶： 在PCR中，最初使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。由于该酶不能耐受反应循环中解链所需的高温（93C -95C），因此在反应过程中必须不断补加聚合酶以满足每次扩增的需要。这样造成操作繁琐，反应低效及费用增加。另一方面，由于Klenow片段聚合反应温度低（37C），容易形成引物与DNA模板的非专一性配对，或受某些DNA二级结构干扰，结果产生许多非专一性的产物带。,遗传学,TaqDNA聚合酶： Taq酶的性质： Taq DNA聚合酶是从生长在温泉中的水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离纯化出来的。这种栖热菌能在70C-75C中生长。 Taq DNA聚合酶的分子量为93.9kD，活性可达200,000U/mg蛋白。 Taq DNA聚合酶的功能是：在有四种核苷酸三磷酸盐的反应系统中，以高温变性的DNA为模板，从分别结合在模板DNA两端的引物为出发点，按5 3的方向，沿着模板顺序合成新链。 Taq DNA聚合酶具有较高的热稳定性。以实验为证，将反应系统分别置于92.5C、95C、97.5C，分别经过130分钟、40分钟和5-6分钟后，Taq DNA聚合酶的活性仍保持50%。,遗传学,TaqDNA聚合酶： 影响酶活性的因素： 虽然Taq DNA聚合酶有很强的温度适应范围，但高于90C的环境仍会使部分酶变性失活。反之，如果温度过低，不但酶活性受影响，而且由于引物在低温下（特别是25C-27C）可能与基因组中别的部分同源的序列结合，使得一些扩增产物并非为目的序列。适当提高温度，错配碱基多会解离，反应产物的特异性增加。Taq DNA聚合酶的最适应温度为70C。 Taq DNA聚合酶活性对Mg+的浓度非常敏感。Taq DNA聚合酶与其它聚合酶一样，是Mg+依赖性酶。测定表明，在MgCl为2.0mM的条件下，酶的活性显示最高。 KCl的最适浓度是50mM，高于75mM时，聚合反应受到明显的抑制。,遗传学,引物设计： 引物是决定PCR结果的关键。引物设计的原则是： （1）引物长度以15-30个碱基为宜，（G+C）含量约 50%，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列； （2）避免引物内部形成二级结构； （3）两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端， 避免形成“引物二聚体”； （4）引物的3端应为G或C。,遗传学,Marker Primer forward Primer reverse RM1 gcgaaaacacaatgcaaaaa gcgttggttggacctgac RM2 acgtgtcaccgcttcctc atgtccgggatctcatcg RM3 acactgtagcggccactg cctccactgctccacatctt RM4 ttgacgaggtcagcactgac agggtgtatccgactcatcg RM5 tgcaacttctagctgctcga gcatccgatcttgatggg,遗传学,PCR产物的检测和多态性分析： PCR产物通常在琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，在紫外光下观察。 PCR产物通常以共显性的带型出现。,遗传学,6.3 PCR 6.3.4 RAPD,RAPD是随机扩增的PCR技术： RAPD与一般PCR的主要差异是利用随机引物。引物通常是10核苷酸的长度，引物是随机设计的，因此利用RAPD引物通常可以从基因组中扩增出多个DNA片段。,RAPD Primer KITS KIT A: A-01 CAGGCCCTTC A-02 TGCCGAGCTG A-03 AGTCAGCCAC A-04 AATCGGGCTG A-05 AGGGGTCTTG A-06 GGTCCCTGAC A-07 GAAACGGGTG A-08 GTGACGTAGG A-09 GGGTAACGCC A-10 GTGATCGCAG A-11 CAATCGCCGT A-12 TCCGGGATAG A-13 CAGCACCCAC A-14 TCTGTGCTGG A-15 TTCCGAACCC A-16 AGCCAGCGAA A-17 GACCGCTTGT A-18 AGGTGACCGT A-19 CAAACGTCGG A-20 GTTGCGATCC,遗传学,A B C,A B C,B C A,B C A,Amplified fragment length polymorphisms,6 Molecular Markers 6.4 AFLP,选择性限制性片段扩增（SRFA）：,前面已经介绍了RFLP和PCR的技术，这两种技术都有许多优点，但也都存在一些不足之处。RFLP具有分子标记较多、可以对整个基因组作指纹分析，但其技术较为复杂。PCR具有技术比较简单，但特异性引物不易发展，数量有限，难以用作指纹分析。如果把这两种技术结合在一起，有可能发展出一种方法简单，可以快速产生大量标记，适合作指纹分析的方法。AFLP就是基于这一考虑而发展起来的。 从广义来说，PCR以及由PCR产生的相关方法如 RAPD等产生的多态性都是AFLP（扩增性片段长度多态性）。这里讲的AFLP指的是SRFA（Selective restriction fragment amplification） 。,遗传学,6.4 AFLP 6.4.1 限制性片段的产生,限制性片段的设计： SRFA的主要目的是指纹分析。指纹分析要求从基因组中快速产生较多的带。从基因组中快速检测出较多的带通常是使用测序胶进行的。测序胶是聚丙烯酰胺凝胶，最有效的分离片段约100bp-500bp。因此，为了达到最好的分辨效果，用于SRFA的限制性片段应主要为100bp-500bp。,遗传学,限制性酶的选择： 前面已经介绍过限制性酶。这里需要考虑的是，用什么限制性酶能使基因组酶切后，大多数片段在100bp-500bp的长度。经过估算和试验，选用一个6-bp识别位点的酶和一个4-bp识别位点的酶，同时处理DNA后能达到这一效果。通常，在SRFA实验中，6-bp识别位点的酶选用PstI，而4-bp识别位点的酶选用MseI。,遗传学,6.4 AFLP 6.4.2 限制性片段扩增,接头的设计和连接： 接头（adapter）是人为设计的、连接到限制性片段两侧的一小段DNA。它的作用是为设计引物提供已知的碱基序列。 设计接头的原则是： （1）接头必须能连接到酶切位点上。 （2）接头的两条寡核苷酸链应能互补，形成双链结构。 （3）接头的碱基序列应符合引物设计的要求。 接头的连接是利用T4 DNA连接酶，把接头与限制性片段连接起来，每个限制性片段的两侧分别连接两个不同的接头。连接后，接头成为模板DNA的一部分。,6.4 AFLP 6.4.3 选择性限制性片段扩增,选择性扩增： 选择性扩增是通过利用选择性引物来实现的。其扩增的方法与非选择性扩增相似。为了使扩增产物通过放射自显影检测到，在PCR反应中加入32P-dCTP（2.5Ci=0.0015mM），使扩增产物产生放射性。,遗传学,遗传学,Selective restriction fragment amplitication,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳。 通过放射自显影显带。,6.4 AFLP 6.4.4 选择性扩增产物的检测,遗传学,6 Molecular Markers 6.5 SSLP,SSLP (simple sequence length polymorphism) 即简单序列长度多态性，是由于简单序列的重复次数不同，导致扩增片段长度的不同而产生的多态性。,遗传学,6.5 SSLP 6.5.1 微卫星DNA,微卫星（microsatellite）又称简单序列重复（simple sequence repeat，SSR），或称短串联重复（short tandem repeat，STR），是一类由几个（一般2-4个）核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。,遗传学,DNA序列通常划分为单一序列和重复序列。在真核细胞，当把DNA裂解成大约104bp的片段，然后氯化铯密度离心，结果会出现一个主峰和一些小峰。这些小峰的DNA称为卫星DNA。在氯化铯密度离心中，出现在主峰的DNA其碱基分布均匀，GC/AT的比例比较固定。而出现在卫星峰中的DNA其碱基分布不均匀，G-C含量与主峰不同，造成密度上的差异，因此偏离主峰。G-C含量小，其密度变小。卫星DNA实质上重复序列的DNA。,遗传学,由于重复单位的不同，微卫星存在着多种不同的类型。各类微卫星的频率在不同的生物体之间存在着显著的差异。在人类基因组中，最丰富的微卫星是(AC)n和(GA)n。(AT)n是植物基因组中最丰富的微卫星。在水稻基因组中，最丰富的微卫星是(GA)n和(GT)n。不同生物的基因组中，微卫星的丰度也差异较大。哺乳动物基因组中微卫星的丰度约为植物基因组的5倍。在植物中，双子叶植物微卫星的丰度约为单子叶植物的3倍。,遗传学,遗传学,6.5 SSLP 6.5.2 多态性信息量,在微卫星DNA中，简单序列的重复次数在同一物种的不同品种或不同个体中存在着较大的差异。或者说，微卫星座位上存在着非常丰富的等位基因。例如，在水稻中，RFLP座位的等位基因数为2-4个，而微卫星的等位基因数为2-25个。从多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）来衡量，RFLP的PIC值为0.39，而微卫星的PIC为0.69。 由于微卫星座位具有丰富的等位基因，因此微卫星标记是一类比较理想的分子标记。,遗传学,遗传学,遗传学,6.5 SSLP 6.5.3 微卫星标记的发展,微卫星标记是通过对微卫星序列作特异PCR扩增产生的。对微卫星序列作特异PCR扩增，需要根据微卫星两侧的序列设计引物，这种引物特异性的，即在基因组中是独一无二的。设计引物的前题是要知道引物所在座位的DNA序列。因此，微卫星两侧DNA的测序便成为微卫星标记发展的最大限制因素。,遗传学,微卫星标记的发展主要有两种途径： （1）通过构建文库和测序 构建文库 筛选文库 测序 设计引物,遗传学,（2）从已知的DNA序列中筛选 从现有的DNA序列资料中寻找微卫星序列 设计引物,遗传学,Marker Primer forward Primer reverse RM1 gcgaaaacacaatgcaaaaa gcgttggttggacc