课件：第三章蛋白质的通性纯化与表征.ppt

第三章 蛋白质的通性、纯化与表征,1、蛋白质的理化性质： 酸碱性质、胶体性质与沉淀、变性、颜色反应 2、分离纯化的方法： 盐析、电泳、等电聚焦、层析等 3、表征： 活力、比活力,蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳,1、酸碱性质,可解离基团有末端和侧链 故pI与酸性、碱性氨基酸的数目有关 如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性 有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定,没有盐类干扰时的等电点叫等离子点,蛋白质分子的颗粒直径已达1-100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,2、蛋白质的胶体性质：,蛋白质的胶体性质,布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力,蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）； 2）带相同电荷。 3)大小为1-100nm的胶体颗粒,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,蛋白质的沉淀作用,加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。 分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。 2. 加有机溶剂 加重金属盐 加生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和条件有机溶剂沉淀法等。,可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、常温有机溶剂、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,不可逆沉淀,一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性。,二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，并不引起一级结构的改变。,蛋白质的变性,三、蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都变性后的蛋白质。,四、加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。,4、蛋白质的颜色反应：鉴定蛋白质的量,OH,N,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色,5、蛋白质的紫外吸收,分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整 难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）,蛋白质的分离与纯化方法,（一）盐析与有机溶剂沉淀： 盐溶 盐析： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。,常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。,分段盐析：,半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。,2019/8/5,17,可编辑,2. 有机溶剂沉淀蛋白质：,凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理是： 脱水作用； 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。,（二）电泳：,带电粒子在电场中移动的现象称为电泳（electrophoresis) 蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。,电泳,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。 （2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 （3）双向电泳,4）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。,5）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。,两种凝胶电泳,等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。分离同工酶,通电,SDSPAGE中SDS的作用： 阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态 屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷 使得蛋白质的形状趋于一致,所以在这种特殊的电泳中，迁移率与蛋白质电荷无关，与蛋白质的形状无关，处决于蛋白质的大小（分子量）,（三）层析：,层析（chromatography)是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。 主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析、HPLC等。,凝胶过滤分离蛋白质,（四）超速离心：,利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。,蛋白质相对分子量在10 000-1 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25-50*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。,沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。,v =沉降速度（dx/dt） =离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）,沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）,蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系,酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶促反应速率,酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml）,在最适的反应条件（25）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1IU=