《转基因克隆动物》PPT课件.ppt

1,2,Call a spade ，a spade 实事求是 A fall in pit a gain in wit 吃一堑长一智 The man who has made up his mind to win will never say “impossible” 一个决心取胜的人从来都不会说“不可能” Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowed :a little bit more 成功的秘诀就是四个简单的字：多一点点（凡事比别人多一点点，多一点努力多一点实践多一点疯狂，多一点点就能创造奇迹）,3,你是一个富翁,如果早上醒来，你发现自己还能自由呼吸，你就比在这一周离开人世的100万人更有福气。 如果你从未经历过战争的危险、被囚禁的孤寂、受折磨的痛苦和忍饥挨饿的难受、你已经好过世界上5亿人。 如果你的冰箱里有食物，身上有足够的衣服，有屋栖身，你已经比世界上70%的人更富足。 如果你银行户头有存款，钱包里有现金，你已经身居世界上最富有的80%的人之列。 如果你的双亲仍然在世，并且没有分居或离婚，你已属于稀少的一群。 如果你能读到这段文字，那么，你更是拥有双份的福气，你比20亿不能阅读的人更幸福。,4,你要活得随意些,你就只能活得平凡些,你要活得辉煌些,你就只能活得痛苦些,你要活得长久些,就只能活得简单些。 每天多做一件“份外事” 饭疏食，饮水，曲肱而枕之，其乐亦在其中矣。不义而富且贵，于我如浮云 焉 “君子有三戒：少之时，血气未定，戒之在色；及其壮也，血气方刚，戒之在斗；及其老也，血气既衰，戒之在得,5,父母在,不远游,游必有方。 父母之年,不可不记。一则以喜，一则以忧。 夫树欲静而风不止，子欲养而亲不待。” 子曰:“古之孝者,是谓能养。至于犬马,皆能有养,不敬,何以别乎?”,6,休无休时，了无了时,人肯当下休，便当下了。若要寻个歇处，则婚嫁虽完，事亦不少。僧道虽好，心亦不了。前人云：“如今休去便休去。若觅了时无了时。”见之卓矣。,7,王维九月九日忆山东兄弟 独在异乡为异客， 每逢佳节倍思亲。 遥知兄弟登高处， 遍插茱萸少一人。 采桑子 重阳 - 毛泽东 人生易老天难老，岁岁重阳， 今又重阳，战地黄花分外香。 一年一度秋风劲，不似春光， 胜似春光，寥廓江天万里霜。 过故人庄 孟浩然 故人具鸡黍，邀我至田家。绿树村边合，青山郭外斜。 开轩面场圃，把酒话桑麻。待到重阳日，还来就菊花。,8,教你如何获取全免费论文,【免费搜索引擎】搜索你需要的论文。 1.Google Scholar 这个不多讲了，其用法，这里有一篇文章， 【浅谈用Google Scholar查找并获取外文文献的技巧和方法】/4every/blog/ . 43b0f852664fdd.html 2.Scirus Scirus科学搜索引擎由爱思唯尔科学公司(Elsevier Science)于2001年4月1日推出。 专为搜索高度相关的科学信息而设计的专业科学搜索引擎。 目前互联网上最全面的综合科技信息检索引擎（大约4亿5千万可搜索项目） 详细介绍见/html/200411/61239.html 3.Oaister 由密执安大学数字图书馆主办 一站式检索电子图书、电子期刊、录音、图片和电影等数字资源 4.Citeseer / CiteSeer主要收录计算机工程与计算机科学重要研究资料，已有超过30万笔的文件资料以及4百万笔的引用文献包含在数据库中 5. Sciseek / SciSeek是一个专注于科学与自然领域的搜索工具，采取人工收集处理的方式，提供农林、工程、化学、物理和环境方面的科技期刊及其他信息。,9,6. Ojose / OJOSE是一款免费的科学搜索引擎，用户只需要输入一个检索字段就可以在60多个不同的数据库之间进行检索 7. Cogprint / Cogprint系统主要集中于一些认知科学领域的电子存档文件 学科领域包括心理学、神经科学、语言学和计算机科学等 8.Socolar / Socolar是开放获取资源的平台，提供基于开放获取期刊和开放获取机构仓储的导航、免费文章检索和全文链接服务 收录7000余种开放获取期刊，其中90%以上期刊经过同行评审,收录约1100余万篇文章；900余个开放获取机构仓储，320余万条记录 数据每天更新 另外：常用的十七大学术搜索引擎 /toview.aspx?id=25921 【免费期刊全文数据库】获取查找到的论文的全文 1. DOAJ 2003年5月由瑞典Lund大学图书馆推出，提供2800余种期刊的篇目检索和900余种期刊的全文检索，收录论文16万余篇。 开放获取期刊：可以免费进行阅读、下载、复制、分发、打印、检索和全文链接的期刊 其特点是研究性和学术性强，且全文免费,10,2. HighWire Press 1995年由斯坦福大学HighWire出版社建立 生物医学和其它学科重要期刊的网络版，内容涉及生命科学、医学、物理科学以及社会科学期刊和其它的网络出版物 3. BioMed Central BMC属独立的非赢利性血红素出版机构，致力于提供生物医学文献的开放获取 180余种生物医学开放获取期刊 内容涵盖生物学和医学两大领域 4. PLoS journal PLoS于2000年10月成立，属非营利性组织出版商，致力于使全球范围内的科技和医学领域的文献成为可以免费获取的公共资源 5. 免费生物医学期刊 400多种期刊，9种语言 免费生物医学图书导航 6. Biovisa 收集了1000余种在选生物医学期刊信息 7. Bioline International .br,11,提供来自发展中国家的开放获取的期刊的全文 8. SciELO http:/www.scielo.br 提供近200种巴西网络版科技期刊 可看到英文文摘，论文全文为葡萄牙语或者英语 9. PubMed Central 生命科学期刊文献全文免费检索系统 共收录100余种期刊 10. 国外大学免费硕博全文数据库 Universitatsbibliothek Munchen ( Germany ) http:/edoc.ub.uni-muenchen.de/perl/advsearch University of Campinas Faculty of Education /cr/uchsc/main /Pubs/ETD/ University of Florida /etd.html Australian Digital Theses Program .au/ University of New Orleans / University of Pretoria : Electronic Theses and Dissertations http:/upetd.up.ac.za/,12,University of Puerto Rico Mayaguez Campus /tesisdigitales.htm University of Tennessee, Knoxville :90/cgi-perl/dbBroke.er.cgi?help=148 University of South Florida /cgi-bin/ETD-db/ETD-.D-search/search University of Texas - Austin /cr/utexas/main University Utrecht(Electronic Theses and Dissertations) http:/laurel.library.uu.nl/cgi-bin/mus212.server?DB=da_en UW Electronic Thesis Database http:/etheses.uwaterloo.ca/ Uppsala Universitiet http:/publications.uu.se/theses/ Virginia Commonwealth University /ETD-db/ETD-search/search Worcester Polytechnic Institute /ETD-db/ETD-search/search Yale University Library /ETD-db/ETD-search/search The George Washington University /ETD-db/ETD-search/search North Carolina State University /ETD-db/ETD-search/search The New Jersey Institute of Technologys Electronic Theses & Dissertations /etd/index.cfm Naval Postgraduate School Theses /home/theses.htm National Taiwan Normal University,13,50/cgi-bin/gs/egsweb.c.cgi?o=dentnucdr 1. 全球免费全文科技期刊/zwqk/ 2. 中国研学资源网 免费学习资源,免费论文全文期刊,电子书下载,开放课程,专业学习网站,硕博论文库 / 3.国外免费-开放获取期刊 1/kfqk.htm 免费全文期刊大全 /bbs/showpost.aspx?id=14214 4. 知网，维普，万方等各大数据库的免费账号：/zh/index.html 5.【最后一招】：通过免费搜索引擎搜索到的论文，在开放获取数据库没有找到全文的话，免费获取自己所需的论文全文的一个相当不错的方法： 在小木虫上【文献求助】版块 /bbs/forumdisplay.php?fid=158 求助您所需要的论文，几个小时就可以获取到全文了，不知道大家有没有这个感受，“帮助来得太快了”，这就是小木虫。不过前提是您有些金币，这个就得要您为论坛做出一点贡献了，发些好资源，好经验，与虫友一起分享。,14,（immunodeficient animal) T淋巴细胞缺陷 裸小鼠、裸大鼠 B淋巴细胞缺陷 性连锁免疫缺陷 NK细胞缺陷 Beige小鼠 联合免疫缺陷 T、B缺陷SCID TB、NK联合缺陷鼠 获得性免疫缺陷 小鼠、猴、等AIDS模型,免疫缺陷动物,先天免疫缺陷,第七章 免疫缺陷动物,15,一）裸小鼠(nude mice) BALB/c 裸基因位于11号染色体， 主要特征：无毛（Hairless）、裸体（Naked）和无胸腺（Athymus）。毛发发育异常， 不能让T细胞正常分化，细胞免疫低下， B细胞功能正常 繁殖： 雄鼠精子尾部呈盘卷状，无活动力，由于纯合雌裸鼠受孕率低，会食仔因此繁殖： 纯合雄鼠（nu/nu ) X 杂合雌鼠(+/nu) -正常鼠（繁殖）和裸鼠（实验用）,16,无胸腺导致T细胞发生发育障碍。虽然T细胞和B细胞的前身正常，但因缺乏胸腺，故不能生成正常成熟T细胞，缺乏免疫反应，因此裸鼠是一种免疫缺陷动物。 胸腺位于胸骨柄后方，心脏腹面，呈乳白色脂肪状，分左右两叶。胸腺分泌生物活性的多肽类物质，总称为胸腺素，它可刺激淋巴组织产生淋巴细胞；使来自骨髓、脾脏和其它组织和淋巴原始细胞成熟为具有细胞免疫活性的T淋巴细胞，从而发挥免疫作用。,17,3、裸鼠在生物医学研究中的应用 （1）组织移植（人类肿瘤移植）研究 结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌等移植成功，并可传代。 我国：人体结肠癌、直肠癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、咽癌、骨巨噬细胞癌的移植均获得了成功。,18,（2）肿瘤药物治疗和肿瘤免疫研究 移植发囊，视网膜母细胞瘤等 人的Burkitt淋巴瘤的裸鼠移植后对环磷酰胺有较高的敏感性，也与临床结果相符。其它肿瘤如乳腺癌和结肠癌裸鼠移植，对前者阿霉素和苯丙氨酸氮芥（7mg/kg）均有一定的抑瘤效能，对后者甲基-CCNO和丝裂毒素也明显疗效。 有人用胸腺嘧啶核苷等444888mg/kg给肿瘤裸鼠连续灌注96140小时，发现它能明显抑制人体黑色素瘤及畸胎瘤的生长，并导致肿瘤消退而对宿主无明显毒性，这些新结果已引起了临床重视。,19,（3）免疫和遗传研究 先天性无胸腺裸鼠的遗传因素，免疫动物原缺陷指标以及剖检所见和组织学观察等特征，均与人类免疫缺陷性疾病中的原发性细胞免疫病相似。各品系裸鼠因遗传背景的不同，所表现的细胞免疫反应和实验室检查指标亦各不相同，这些裸鼠种群是研究人类各种免疫缺陷性疾病的发病机理和遗传规律的动物模型。 我国所应用的自发性免疫缺陷小鼠，主要应用的是BALB/c为遗传背景的裸鼠，个别实验室也应用了NIH、ICR等非近交系裸鼠,20,（4）病毒、细菌、寄生虫感染机制的研究 结果说明，乙脑病毒感染后所产生的免疫力，主要属于细胞免疫，如使T细胞缺陷的裸鼠体内产生与免疫功能正常小鼠同等水平的免疫力，必须加大40倍的免疫剂量，才能达到。也说明裸鼠体内还存在着残余的T淋巴细胞。由此推论，在现场人群中产生抗体水平较低者，其T细胞功能是否缺陷，应作为因素之一加以探讨。,21,（5）生物制品和药品的检定 生物制品（疫苗、菌苗）的安全性的免疫原性是制品必不可少的内容之一。 它涉及制品是否有潜在致癌性、感染因子以及它的毒力是否有返祖的可能性。特别是在应用动物组织培养疫苗或人类二倍体细胞株时，对检出这些细胞潜在的致癌性，某些制品引起的异常发应及其发生机理，对药物致癌性或抗癌药物的研究等诸方面，先天性胸腺机能缺陷的裸鼠是很好的动物模型和实验手段。,22,（6） 微生物学上的研究 以往麻风杆菌只在背上有九条纹的犰狳（Armadillo）身上才能生长，而这种产于南美等地的动物难于寻找，也不易饲养和操作。 1975年Colston等将麻风杆菌接种于裸鼠足掌，发现麻风杆菌可大量繁殖，引起瘤型麻风。 又如淋巴细胞性脉络膜脑膜炎（LCM）病毒经脑内接种于无本病毒隐性感染的正常小鼠，可引起脑膜炎，感染细胞被当作靶细胞而受到破坏，在脑、脊髓内发生了明显的细胞免疫反应，但在T细胞缺损的裸鼠所见却完全相反，未导致动物的死亡，仅出现持续病毒血症，体内不出现LCM抗体，也无任何免疫反应。,23,二）裸大鼠(nude rat),一、生物学特点 1953年发现，裸大鼠(nude rat) 无胸腺，缺T细胞，B细胞功能正常（血清更多） 四肢有少量毛,24,三）性连锁免疫缺陷小鼠 (X-linked immuno deficiency mouse XID) B细胞功能缺陷。位于x染色体上，IgM等抗体少，研究Bruton无丙种球蛋白缺乏症。将正常鼠骨髓移到xid鼠中，B细胞可得到恢复。 四）Beige小鼠 纯合小鼠被毛完整，NK细胞活性缺陷 ，可导致溶酶体功能缺陷，对化脓菌敏感。,25,五）严重联合免疫缺陷小鼠（severe-combined immuodeficient mice SCID） 外观正常， 造成T细胞不能分化成功能淋巴细胞，无抗体反应 .胸腺、脾、淋巴结重量不及正常的30%,组织学上淋巴细胞显著缺乏， T、B细胞功能阴性，对外来抗原无细胞免疫和抗体反应，但其巨噬细胞、红细胞、自然杀伤细胞等功能正常。,26,许多人类寄生虫不能感染其它小鼠，而SCID小鼠不但可被人类丝虫病所感染，而且所出现的病变也与人类相似，因此是研究人类寄生虫病的新动物模型 SCID小鼠肿瘤移植存活率高达36.9，一般裸鼠为16.8 少数可恢复免疫功能，称为渗漏现象 繁殖：纯合子兄妹交配,27,裸鼠在肿瘤模型中的应用：,一 组织块法 ：将标本在1小时内接种在腋下，背部皮下,36mm3左右。3-5周后就可达到1-3cm3 如 将人乳腺癌块接种于裸鼠右腋乳垫下 二 悬液移植法 ： 组织块匀浆后，细胞液注射，浓度1107/ml 左右 ，一般注射0.2 ml。缺点：不易定位，如在肾包膜下，会流走 三 培养细胞移植法 ： 腋下移植更好 计算公式：瘤体积V=0.5肿瘤最长径X肿瘤最短径 。45d后，处死裸鼠，进行解剖，取肿瘤组织称重 瘤重抑制率=(1一实验组平均瘤重阴性对照组平均瘤重)100 抑瘤率r=(V对照组一V实验组)V对照组】100。,28,检测方面,1、对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用 2、免疫组化法检测Casepase-7和PTEN蛋白,29,30,二 肿瘤的不同移植途径,1）皮下移植 （2）腹腔注射：0.2ml 细胞悬液注入腹腔,若注入皮下可形成实体瘤 （3）肾包膜下移植（人卵巢癌细胞系双侧移植） （4）原位移植（orthotopic)：如肝癌、肺癌移植到肝、肺中 乳腺癌细胞，用1 ml注射器将肿瘤细胞接种于裸小鼠左侧第二乳头的脂肪垫，接种量每只为只0.2ml含有2X106个细胞；1个月后(肿瘤长、短径大于1mm)开始治疗。,31,举例,结肠癌原位移植：0.1ml 细胞悬液注入肠壁 肺癌原位移植： ）支气管移植：0.03ml 细胞悬液注入支气管 ）瘤块直接植入：mm3 瘤块（块左右）缝入肺 肿瘤保存：细胞悬液保存液氮保存年甚至年,32,33,三 影响移植模型成功的因素,一 激素 如乳腺癌细胞在雌鼠可生长，卵巢切除后不生长，但注射雌激素可生长前列腺癌细胞 可在雄鼠中生长 二 鼠年龄有关 小鼠（周龄）更容易生长 三 肿瘤自身特征 结肠癌和恶性黑色素瘤最高，乳腺癌低，分化低的也高 四 渗漏现象（少数鼠会恢复免疫功能），通过射线照射解决,34,五 移植部位：腋下好，肾包膜下高于皮下，脑内接种最高（IgM 不能通过血脑屏障），皮下很少转移，腹腔易转移 六 健康 高清洁的环境中的裸鼠更易成功,35,36,第八章 基因工程动物,一）转基因动物 通过基因工程对DNA进行体外操作，添加或删除一个特殊的DNA序列，然后导入早期胚胎细胞中，产生遗传结构得以修饰的动物，其改变的性状可以遗传给后代。 二）基因敲除动物 三）克隆动物,37,转基因动物和 基因敲除,转基因动物(transgenic animal) 基因敲除(gene knockout),38,血友病B的治疗,39,基因工程产生的问题：,价格高? 只能生产简单的小分子担保，不能生产有着复杂结构的大分子蛋白? 环境污染？ 数量有限？,40,第一节 转基因动物,一、概述 转基因动物（transgenic animal):用人工方法将外源DNA导入或整合到动物基因组内，并能稳定传代的动物。 1982年 Brinster & Palmiter 大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵,41,supermice,42,各种转基因生物,43,44,45,46,47,48,二、基本原理 外源基因构成 顺式作用元件+结构基因+报告基因（融合基因） 报告基因常为 荧光素酶、-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白（GFP),49,外源基因的引入 显微注射 注射入受精卵 结合克隆生产转基因动物 胚胎干细胞法 逆转录病毒感染法 精子载体法 发育 植入受体动物的子宫或输卵管 转基因动物中外源基因的检测 Southern杂交、Northern杂交、Western印迹,50,三、基本方法 1. 显微注射法 优点: 导入速度快、操作简单对DNA大小无限制 缺点: 实验设备昂贵 简化流程 目的DNA制备基因工程 准备假孕母鼠（养母） 准备供体母鼠提供受精卵 显微注射入雄性原核 植入养母子宫、输卵管 外源基因整合及表达检测 通过互交、回交等育种手段获得纯合子 传代纯合子转基因鼠（若外源基因的整合发生在细胞分裂后则只能得到嵌合体小鼠）,51,注射量仅一微微升,52,2 结合克隆生产转基因动物,53,克隆胚胎发育阶段,54,去核过程 注射过程,55,各种克隆动物,56,57,58,3. 胚胎干细胞法ES细胞 特点： ES具有全能性。 简化流程 获取ES细胞 稳定传代防止分化 转化ES细胞（引入新基因、诱导基因突变、基因组改造等）筛选后克隆 注射入囊胚期的胚胎中 植入养母子宫，筛选嵌合体子代 通过回交、互交等育种手段获得纯合子后代 稳定传代,59,60,61,4. 逆转录病毒感染法 主要适合于家禽类，其受精卵在出生时已发展至桑椹胚期 5. 精子载体法 将外源DNA吸附到精子中 洗涤精子 电穿孔法、脂质体转染法等 优点：便宜 机制未明：怀疑与CD4蛋白有关,62,63,注射过程 去核过程,64,四、转基因动物的可能应用 基因产品的制备生物制药 使用乳球蛋白的启动子可以使外源基因在乳腺中特异表达 异种器官移植转基因猪（实验阶段） 建立人类疾病动物模型等 高脂血症（HLP）、AS、高血压、低血压等心血管疾病的转基因动物模型已成功建立 培育新品种 加速生长 抵抗疾病 扩大生存范围耐寒能力等,65,66,67,68,三、转基因植物安全性探讨 缘起 1998年，苏格兰免疫学家普兹太声称转基因土豆对老鼠有毒，能破坏其免疫系统（实际上是肠道损害），欧洲舆论因之大哗，导致欧盟限制转基因食物进口。 1999年5月，美国康奈尔大学洛希（John Losey）实验室向英国自然杂志报告说，他们用沾有抗虫害转基因玉米花粉的草叶喂养大花蝶的幼虫，导致这些毛毛虫死亡 ,69,热门问题 对人体的毒副作用及引发过敏 外源基因在自然界不受控制的随机转移导致基因污染 抗生素抗性基因 （常用于筛选） 抗除草剂基因 抗虫害基因导致超级害虫以及对生态环境的危害 我国抗虫棉已占棉花种植面积的35 侵犯宗教信仰 把猪的基因转移到牛中等,70,世界上没有绝对的安全,正确的提问 有没有合理的理由和确凿的证据表明市场上的转基因食品要比相应的“天然”食品更有害健康？ 普兹太的实验动物数量太少、缺乏对照、膳食不合理、最后土豆是生的 花粉实验中，花粉浓度远远高于自然界中的情况，而且毛毛虫只有被花粉污染的草叶可吃。 对策 过敏 避开易引起过敏的物种基因（牛奶、干果、蛋类、海产品、小麦、豆类） 基因污染 植物基因在消化道中转移给微生物，仅在结肠全切的情况中偶见。 2001年2月自然杂志发表了一项在英国进行的长达十年的研究结果，发现转基因土豆、甜菜、油菜和玉米并没有将基因污染给周围的野草。,71,72,第三节 基因敲除,原理：通过基因同源重组的过程定向地从及基因组上移除特定基因的过程。 DNA定点同源重组 在同源依赖的重组酶的作用下，配对的同源双链DNA分子可以彼此交换DNA片断的现象。 分类 基因敲除常用于个体水平上的基因功能研究 基因敲入可用于基因治疗,73,74,75,日本科学家最近通过改变老鼠的基因，培育出了一只不怕猫的老鼠,76,一、条件 ES细胞的制备和培养 打靶载体： Neor（抗新霉素）阳性筛选标志 位于同源区内，表征重组成功的筛选标志 新霉素（G418）氨基甙类抗生素 ，具耳毒性 HSV-tk（具自杀性质）阴性筛选标志 来源于单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶 位于同源区外，表征重组区域精确的筛选标志 GCV自杀性底物,77,二、基因敲除简化流程 构建打靶载体 制备待敲除基因两端同源片断 目的基因链接到质粒中并切除其中央大部分区域 将neo基因链接到同源片断中间 导入ES细胞并筛选 注射入胚泡并植入假孕小鼠子宫 嵌合体小鼠杂交育种获得纯系,78,79,80,81,82,普希金,假如生活欺骗了你, 不要悲伤,不要心急! 忧郁的日子里需要镇静: 相信吧！快乐的日子将会来临。 心永远向往着未来； 现在却常是忧郁： 一切都是瞬息，一切都会将过去； 而那过去了的，就会成为亲切的怀念。,83,你知道我在等你