课件：第五章啤酒发酵.ppt

第一节 啤酒酵母,第五章 啤酒发酵,人类酿酒的历史比人类文明还早，但对酿酒本质的认识却很晚。 1680年荷兰列文-虎克制作原始显微镜；小圆物 1818捷克斯洛伐克科学家爱文斯本活的生物 1837法国拉图勒、德国施旺以出芽的方式繁殖，并将其命名为“糖真菌”，后来，梅因在分类时命名，法国路易-巴斯德确立发酵生物学，德国汉逊进行单细胞分离和纯种培养。,酵母：能使含糖液体自然发酵，生成二氧化碳和酒精，液面上生成“膜”，器底形成沉淀的生物，统称为“酵母”。 广义上说，凡是单细胞、繁殖时间较长的低等真核生物，统称为“酵母”。,一、酵母的分类 酵母在分类学上属于真菌门-子囊菌纲-原子囊亚纲-内孢霉目-酵母科-出芽酵母亚科-酵母属-种：用于酿造的有两个种：上面酵母上面啤酒、下面酵母下面啤酒。 啤酒专业刊物：S.cerevisiae 上面酵母 S.carlsbergensis 下面酵母 一般M书刊将S.cerevisiae 称为啤酒酵母（上面酵母）.,啤酒酵母（上面酵母）. 麦汁中培养三天，按长宽比分三组 1）长宽比1-2，圆形或卵形，用于生产酒精和白酒 2）长宽比1：2，用于啤酒、果酒和面包发酵 3）大于2，耐高渗透压，用于糖蜜酒精和朗姆酒生产。 没有蜜二糖酶，只能发酵1/3棉子糖，不能发酵乳糖。能发酵葡萄糖，麦芽糖，蔗糖。,葡萄汁酵母 能发酵全部棉子糖。沿用卡尔酵母老名称。 发酵结束时，酵母很快凝结成块并沉积到发酵容器底部，又称下面发酵酵母 圆形，卵形，椭圆形或长圆形 各大型啤酒厂有自己独特的菌株，长期驯养、选育获得。差别在于繁殖速率，增值倍数，凝聚性，耐性，抗性等生产特性上。 独特的菌株形成酿造技术和啤酒风味的多样化。,上面酵母与下面酵母主要区别,对棉子糖的发酵能力不同-鉴别两种酵母的主要特征。,对棉子糖的发酵能力不同，是鉴别两种酵母的 主要特征。 棉子糖的构成：-半乳糖-葡萄糖-果糖 -半乳糖与-葡萄糖是以-1.6糖苷键连接，-葡萄糖与-果糖是以1-2 糖苷键连接。要打开-1.6糖苷键，需要有密二糖酶；要打开1-2 糖苷键，需要有转化酶（蔗糖酶）。上面酵母细胞内因没有密二糖酶，所以只能发酵1/3棉子糖；下面酵母细胞内即有密二糖酶、也有转化酶，所以能全部发酵棉子糖。,二、结构 为真核生物，有细胞壁和细胞膜，细胞之内有细胞器。 三、生活史 双倍体细胞，17对染色体。形成子囊孢子时减数分裂。子囊孢子脱离母体出芽形成单倍体 有两种类型生活史。同宗结合没有单倍期，异宗结合有。,四、啤酒酵母的凝絮性 上面啤酒酵母：发酵时随CO2漂浮在液面上，发酵终了形成酵母泡盖，长时间放置很少沉淀。发酵1/3 下面酵母：发酵过程中酵母分散，发酵终了酵母凝结成块，沉于容器底部。可发酵全部棉子糖 鉴别特征 ： 棉子糖 果糖 葡萄糖 半乳糖 蔗糖 蜜二糖 转化酶 蜜二糖酶 下面酵母按凝聚性分：粉末、凝聚性、絮凝性,啤酒酵母的凝絮特性是重要的生产特性，会影响酵母回收再利用于发酵的可能，影响发酵速率和发酵度，影响啤酒过滤方法的选择，乃至啤酒风味。 1.啤酒酵母絮凝性分类 1）酵母飘浮在发酵液表面，很难下沉，细胞之间比较分散的酵母叫粉末酵母。特点是：发酵度比较高，但发酵液不易澄清。 2）发酵初期酵母分散，达到某发酵度，细胞在啤酒发密度降低。发酵将近结束时，酵母凝聚细胞互相凝集形成菌团而沉淀在容器的底部。容易发生凝聚的酵母叫凝聚酵母。 特点是：发酵度比较低，发酵液澄清快。 凝聚点：发酵液中酵母细胞密度突然降低，形成凝块时的发酵度。 3）絮凝性酵母：发酵减弱后，酵母形成絮状沉淀，技术上器底形成沉底，振荡后很快分散，静置一段时间重新沉降。用于快速发酵制造清爽型啤酒。,2.凝聚理论：不甚清楚，一般认为与酵母的遗传基因有关，至于是一个基因控制还是多个基因控制，观点不一。 一般资料认为凝聚性受基因FLO1和FLO5控制。,五、卡尔酵母的一般特性； 细胞卵圆形、圆形、椭；3.58.0 5.011m 菌落乳白色，边缘波浪性不整齐，突起，易挑起； 可发酵葡、果、蔗、麦、麦芽三糖、半乳糖、棉子糖、密二糖。 不能发酵异麦芽糖、异麦三糖、麦芽四糖、糊精、淀粉。,六、优良酵母的评估和筛选方法： 啤酒工厂使用的啤酒酵母需经反复使用和考验，具有正常生理状态和特性，适合啤酒生产要求的培养酵母。 对啤酒酵母的基本要求是：发酵力高，凝聚力强、沉降缓慢而彻底，繁殖能力适当，生理性能稳定，酿制出的啤酒风味好。,1、评估： 形态学上 细胞形态：酵母细胞短轴：长轴=1 ：11.5，均匀的形状和大小，平滑而薄的细胞膜，细胞质透明均一。 细胞大小：中小型 啤酒酵母在麦芽汁固体培养基上菌落呈乳白色至微黄褐色，表面光滑但无光泽，边缘整齐或呈波状。,2.生理特性要求,(1)凝聚性 (2)发酵度 (3)酵母死灭温度 （4）产孢能力 （5） 双乙酰峰值和还原速度 （6） 酵母对压力的耐受性 （7） 酵母的风味和泡沫性稳定性,2.主要的生理特性要求,生理上选代数低，繁殖速度快，增殖级数大，发酵液中细胞浓度高的菌株。参考指标见P180 (1)凝聚性 凝聚性不同，酵母的沉降速度不同，发酵度也有差异。啤酒生产一般选择凝聚性比较强的酵母。常选用凝聚点45%的酵母。 (2)发酵度 反应酵母对麦芽汁中各种糖的利用情况，正常的啤酒酵母能发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖等。一般啤酒酵母的真正发酵度应为5068左右。最终发酵度（发酵度极限） 也叫最大外观发酵度。测定方法是向协定麦汁中加1%的强壮酵母，在2530保温箱中使之发酵至不发生气泡，发酵液澄清为止，然后测其浓度带入公式计算出的发酵度即为发酵度极限。,（4） 双乙酰峰值和还原速度 优良啤酒：双乙酰峰值低，出现早，主酵后期还原快，含量下降迅速。且双乙酰的前驱物质在啤酒中残留较少，成品啤酒中双乙酰的含量少。世界各国优秀浅色啤酒的双乙酰含量均在0.030.06g/L。 （5） 酵母对压力的耐受性 大罐发酵采用的酵母应有较强的耐压性。 （6） 酵母的风味和泡沫性稳定性 优良酵母要求连续发酵10代以上，发酵度、发酵速度、双乙酰的含量、酒的风格没变化。产生的泡沫洁白细腻如奶油状。,(7)酵母死灭温度 是指一定时间内使酵母死灭的最低温度，可作为鉴别菌株的内容之一。一般啤酒酵母的死灭温度在5253，若死灭温度增高，则说明酵母变异或污染野生酵母。 （8）产孢能力 一般啤酒酵母生产菌种都不能产生孢子或产孢能力极弱，而某些野生酵母能很好产孢。根据此特性，可判别啤酒酵母是否混入野生酵母。,筛选 在正常的情况下，筛选工作每年应进行12次，特别是在停产大修开工前应进行一次。如果在生产中发生问题了。应及时做这项工作。 1、材料：保存的斜面、高泡酒、沉淀酵母泥 2、处理：材料89 P麦汁活化23次25，2d，用0.05%EDTA-Na稀释至 10-610-7，浇双重皿各三个。 27C培养23天，取正常菌落。剔出形态变异的菌种，选择细胞大小、形态正常的菌落反复2-3次分离。 分离单细胞-多级分离培养-发酵性能评定-投入生产。,a、单细胞分离：从平板分离获得的菌落在进行单细胞分离，由一个细胞菌株培养后选若干菌株接入到试管中继续培养。 b、进行形态和生理特性检验，通过检验获得符合生产菌株。 c、进行生产规模的实验，中试或大试确定生产菌株12支,七、啤酒酵母扩大培养 1、出发菌株：保藏菌株、外购 2、简易扩培过程： 斜面- 4只810%203d- 4只810%无花183d 1L 810%无花1546d 20L卡氏罐1012%有花麦汁10L/只10121015d200L种子罐1012%100120L/只10121012d-1.01.2m3繁殖槽. 培养成熟后，放走上层嫩酒，留部分酵母泥，加麦汁保持1213，通风20min/12h，发酵度3035%，60106个/mL降温至23低温贮存，以后重复进行。,斜面试管富氏瓶培养 巴氏瓶培养汉森罐培养 酵母繁殖槽 主发酵池 a、从保存的菌种中分离。 b、从生产中的酵母泥或主发酵液中分离。,试管到汉森罐这一步在实验室进行，工厂把汉森罐作为保存菌种的手段。 汉森罐内始终保存一部分酵母菌，一般200L，每个月把上面的酵母液放走180L，保存20L酵母泥，补充180L灭菌的麦汁，保持7-12繁殖。在汉生罐留下的约15左右的酵母培养液中，加入灭菌冷却后的麦汁，待起发后，准备下次扩大培养用。保存种酵母的室温一般控制在23，罐内保持正压（0.020.03MPa），以防空气进入污染。,实验室扩大培养的技术要求,应按无菌操作的要求对培养用具和培养基进行灭菌； 每次扩大稀释的倍数约为1020倍； 每次移植接种后，要镜检酵母细胞的发育情况； 随着每阶段的扩大培养，培养温度要逐步降低，以使酵母逐步适应低温发酵； 每个扩大培养阶段，均应做平行培养：试管45个，巴氏瓶23个，卡氏罐2个，然后选优进行扩大培养。,生产现场扩大培养的原则是：,（1）注意控制温度顺序降低，扩培稀释倍数不宜太大，以45倍为宜，如果必要，可以追加麦汁。每次扩大培养的倍数约为510倍。 （2）注意移植的时间，应在酵母的增殖率开始回降以前移植，这个时候酵母出芽率在90%以上，死亡率最小，移植后可迅速增殖。 （3）注意通风供氧，每次移植追加麦汁后，都要进行适量的通风，保证发酵麦汁中具有810mg/L的溶解氧。 （4）每一步扩大后的残留液都应进行有无污染、变异的检查。 （5）每扩大一次，温度都应有所降低，但降温幅度不宜太大。,斜面试管(原菌种) 酵母活化液体试管培养（10mL，28，2-3天）小三角瓶培养（1(1020)，25）大三角瓶培养（1(1020)，23）卡氏罐培养（510L，20，3-5天）汉森罐培养（100L，1315，2天）一级酵母繁殖罐，12-13二级酵母繁殖罐，1112发酵，10,逐级递降温度培养法,在汉森罐以前各级，由于采用较高培养温度(25-27)，酵母倍增时间短，无菌操作条件好，可采用11020的扩培比例 汉森罐以后各级采用低温培养(13)，酵母倍增时间长，杂菌污染机会多，扩大比宜小，一般为145。,扩大比应遵循的原则是：,名词： 发酵度：发酵过程中浸出物浓度下降的百分率。 外观发酵度：生产现场用糖度表测量发酵液的浓度计算得到的发酵度。 真发酵度：将酒中乙醇蒸发之后，在用水补充至原体积，然后测其发酵度。 真发酵度=外观发酵度 0.819 发酵度极限最大外观：全部可发酵性糖都被发酵完毕测出的外观发酵度。 成品酒的发酵度应接近发酵度极限。,影响啤酒质量的主要因素： 1、麦汁组成分 2、啤酒酵母的品种和菌株特性 3、投入发酵的酵母数量和质量 4、发酵容器的几何形状：影响发酵流态，酵母分布，CO2排出。 5、发酵工艺条件：PH值、温度、溶氧水平、发酵时间等。,第二节 啤酒发酵机理,麦汁中糖的组成：麦汁的浸出物中，糖占90% ；其中，单糖10%，蔗糖5%；麦芽糖占45-50%；麦芽三糖占10-15%界限糊精（DP48）占20-25%等。 可发酵糖及顺序： 葡萄糖 果糖蔗糖 麦芽糖麦芽三糖,一、糖类发酵,葡萄糖、果糖能直接透过酵母细胞壁并受到酵母细胞壁中磷酸化酶的作用而磷酸化； 蔗糖必须先受到酵母细胞壁分泌的转化酶水解成葡萄糖、果糖后才能渗透进入细胞； 麦芽糖、麦芽三糖要与细胞壁分泌的麦芽糖渗透酶结合后才能输送到酵母体内，被水解酶水解后进入代谢途径。,当麦汁中含有高于0.2%0.5%葡萄糖浓度时，会抑制酵母分泌麦芽糖渗透酶，抑制麦芽糖的发酵，当低于0.2%时，抑制解除，麦芽糖开始发酵。这称“葡萄糖阻遏效应”。,蔗糖转化酶与麦芽糖渗透酶之间也存在竞争性抑制（在发酵旺盛阶段暂时减慢）。麦芽三糖渗透酶也受到麦芽糖的阻遏，当麦汁还有1%麦芽糖，麦芽三糖就很难发酵。,啤酒酵母对糖的发酵都是通过EMP途径生成丙酮酸后，进入有氧TCA循环或无氧分解途径。酵母在有氧下经过TCA循环可以获得更多的生物能，此时无氧发酵被抑制，称为巴斯德效应。,巴士德效应,反巴士德效应”(或称“克拉勃脱效应”) ：,在发酵基质(麦芽汁)中含有较高的葡萄糖(包括果糖)浓度(0.41.0%以上)时,分子氧存在不能抑制发酵,有氧呼吸反而受到一定抑制，这称“反巴士德效应”(或称“克拉勃脱效应”)。因此，在麦芽汁接种酵母后主要是无氧酵解途径，也存在有少量有氧呼吸代谢。,EMP C2H5OH+CO2+能量+4ATP无O2糖发酵 糖丙酮酸 CO2+H2O+能量+38ATP有O2TCA循环 C12H22O11+H2O+4ADP+4Pi-4 C2H5OH+4CO2+4ATP+Q 糖代谢反应式：100g麦芽糖理论上可产酒精53.8g 可发酵糖只有9596%糖转化为酒精和CO2，是代谢的主产物； 1.52.5%转化为其他发酵副产物高级醇有机酸、脂类等，2.02.5%作为碳骨架合成新酵母细胞。,二、含氮物的变化下降 麦汁接种后，酵母必需吸收麦汁中的含氮物，用于合成酵母蛋白、核酸和其它含氮化合物，形成新酵母细胞。接种1520106个/ml高泡6070106个/mL,酵母对氨基酸的利用发酵初期： A组：只有8种氨基酸迅速吸收，麦汁中其它氨基酸只是缓慢地吸收或不吸收。 天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺。 B组：缓慢吸收。只有当前面8种氨基酸浓度下降50%以后,酵母才分泌其它氨基酸的输送酶,输送其它氨基酸进入细胞体内。 缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸。 C组：后期吸收。A组氨基酸被利用后才被吸收。 Gly、Phe、Tyr、Ttp、NH3、Ala D组：极微或不同化或不吸收。Pro、Hpro,啤酒酵母吸收氨基酸不是靠浓度差扩散作用，而是依赖于细胞壁分泌一系列的氨基酸输送酶调节吸收。,AA的前驱体a-酮酸受细胞合成的反馈抑制，合成旺盛时， a-酮酸不积累；但中后期，缺乏AA麦汁，酵母合成速度减慢，对a-酮酸的反馈抑制建立不起来，会有较多酮酸进而转化为高级醇。,酵母的自溶：20 以上，酵母的蛋白酶就能缓慢降解自身细胞的蛋白质；接近0 也能缓慢进行。若自溶过分，啤酒会出现酵母味，并出现酵母混浊。,在正常的发酵过程中，麦汁中含氮物约下降1/3，主要是约50%的氨基酸和低分子肽为酵母所同化。 酵母还能分泌出含氮物。酵母分泌出的含氮物的量较少，约为酵母同化氮的1/3。 此外是pH值下降，引起复合蛋白质沉淀，再就是酵母细胞表面吸附了少量蛋白质微粒。,啤酒中残存含氮物质对啤酒的风味有重要影响。 含氮物质高（450 mgL）的啤酒显得浓醇， 含氮量为300400 mgL的啤酒显得爽口， 含氮物质量300 mgL的啤酒则显得寡淡。,三、啤酒中的风味物质含量少，影响大,高级醇类 酯类 乙醛 成熟啤酒的乙醛含量一般10mg/L 酸 连二酮 双乙酰的味阈值为0.10.15 mg/L；馊饭味 硫化物 风味物质强度应控制住0.5以下,1、高级醇 80%是在主发酵期间酵母繁殖过程中形成的。也就是醇母在合成细胞蛋白质时形成。 A形成机理： 1907年德国化学家伊里希： 有十几种AA在酵母转氨酶作用下将其氨基转移到a-酮戊二酸上，形成谷氨酸和a-酮酸，a-酮酸经脱羧还原形成比原AA少一个碳原子的高级醇。 1953年提出：利用碳水化合物为碳源，生物合成氨基酸的最后阶段形成-酮酸中间体，由此脱羧和还原，就可形成相应的高级醇。,B高级醇与啤酒风味 高级醇（俗称杂醇油）是啤酒发酵代谢产物的主要成分，对啤酒风味有重大影响，主要指异丁醇、异戊醇及活性异戊醇，是各种酒的香味和风味物质之一。 适量可促进酒类香味,口味丰满，并促进协调性。超过一定含量时有明显的杂醇味，产生异杂味，容易上头。 正丙醇、异丁醇、戊醇等含量过高会使啤酒产生不良风味，饮后易“上头” 异戊醇有甜味、香蕉芳香味和醇味。 -苯乙醇，是一个芳香族高级醇，给人有一种郁闷的玫瑰花香 对于一般的啤酒，多量的高级醇是不受欢迎的。啤酒中适宜含量5090mg/L。 啤酒中的绝大多数高级醇是在主发酵期间酵母繁殖过程中形成的。,C影响高级醇形成的因素,酵母菌种 酵母增殖的影响 麦汁浓度和麦汁成分的影响 麦汁充氧量的影响 发酵条件,一般粉末状酵母高级醇的生成量在6090mg/L，而絮状酵母高级醇的生成量在50120mg/L。,酵母的增殖倍数以控制在34倍较好, 接种浓度（1.21.8）107个左右,11120Bx麦汁-N的含量一般控制在160180mg/L,810mg/L,主酵发酵温度、发酵度（68%）,D降低啤酒中高级醇含量方法：酵母增殖的产物。 1提供合适的麦汁中a-氨基氮; 例:1112P麦汁a-氨基氮控制160180mg/L. 2选择产生高级醇少的酵母菌株; 3适当提高酵母的接种浓度15X106个/ml; 4降低主酵前期发酵温度,控制酵母增殖级数3 5控制麦汁的含氧水平,防止倒罐时吸入空气; 6大罐发酵,及时排出酵母,防止酵母自溶; 7适当控制啤酒发酵度.,2、挥发酯： 酯化反应； 酵母生物合成。,来源,含量很少，但影响大，是在主发酵时形成的 1、酯的形成：可由醇类和羧酸通过单纯酯化反应生成。P201 RCH2OH+RCOOH RCH2COOR+H2O 该反应很慢，酯的形成要依赖于酵母的生物合成：酵母先形成酯酰辅酶A，在酵母酯酶催化下和醇化合形成酯。 酯酰辅酶A的来源：麦汁中脂肪酸的活化； -酮酸的脱羟氧化； 脂肪酸合成的中间代谢产物。,2、影响啤酒中酯含量的因素： （1）酯酶：酵母产生，存在于细胞壁膜两侧。在pH4.5-6.5有利于酯合成。镁离子有激化作用。 （2）酰基辅酶A （3）和酵母菌株有关（与酵母的活性有关）健康酵母代谢作用可导致形成更多的乙酰辅酶A。上面酵母比下面酵母形成量多。 （4）发酵温度：最适温度20-25。高，有利于酯类的形成。 （5）麦汁浓度和麦汁含氮量：高，酯类形成量多。 （6）通风量 （7）发酵方法：连续发酵比分批式发酵形成更多酯 （8）贮酒：酒龄半年以上，发生酯化反应，量升高。,3、对产品质量的影响：适量的醋酸乙酯，醋酸异戊酯，醋酸苯乙酯可增加酯味和酒香，过量也会影响啤酒风味。,3.醛：乙醛 已检出的达20余种，乙醛由丙酮酸脱羧形成，是啤酒发酵中的主要醛类，但啤酒中含量一般很低。 （1）乙醛对啤酒口味影响较大，特别是成熟啤酒，当超过25mg/L以后，有强烈的刺激性辛辣感，郁闷性口感。 大于10mg/L粗糙的苦味感，有一种辛辣腐败的青草味。乙醛，双乙酰，硫化氢，构成嫩啤酒的生青味，所以发酵后期要大量排除乙醛。乙醛可检测范围一般在15mg/L以下。 （2）在主发酵前期大量形成，而后很快下降。发酵度越高，乙醛残留量越少。发酵温度高，乙醛生成量降低。 后酵双乙酰还原后期采用CO2洗涤可促进挥发。贮酒期间被固定。,4、酸类： （1）总酸定义：用1molNaOH滴定100mL啤酒，滴至pH9.0为终点，用消耗NaOH的毫升数表示总酸度。滴定总酸度可通过公式换算成某酸浓度。 （2）总酸来源： 麦芽和麦汁：麦芽总酸包括原始总酸和酶解总酸。P206 常因为麦芽总酸不足或酿造水碱度太大，麦汁煮沸时需外加酸。主要酸性物质是磷酸盐组成的缓冲液。 发酵的酸：酒精发酵中伴随形成有机酸。挥发酸主要是脂肪酸，以乙酸为主。过高的挥发酸含量是啤酒酸败的标志。非挥发酸有丙酮酸、a-酮戊二酸、乳酸、苹果酸和琥珀酸 检出发酵酒的挥发酸含量，是检验酒类发酵是否正常标志之一。 啤酒挥发酸控制标准为80mg/L,（3）总酸对风味影响：是主要呈味物质。适量可使口味活泼,爽口；缺乏,口味呆滞,粘稠,不爽口；过量，口感粗糙,不柔和,不协调,也意谓着污染了产酸细菌. 国标12P浅色啤酒总酸2.6ml1molNaOH/100mL （4）总酸控制：控制麦汁总酸。产酸量和发酵温度有关，高温发酵产酸多。一般pH4.04.5 醋酸菌、野生酵母和乳酸菌导致啤酒酸败。,5、连二酮类VDK （1）连二酮和啤酒风味：2.3-戊二酮和丁二酮双乙酰总称，在酒中口味相似 双乙酰是具挥发性、强烈刺激性的化合物，是多种香味物质的前驱物。口味阀值：双0.10.2mg/L;戊1.0mg/L,故生产中以双乙酰作为啤酒是否成熟的限制性指标. 啤酒中含量0.5mg/l以上时，具有明显的馊饭味。优质淡爽型成熟啤酒，双乙酰含量以控制在0.1mg/L以下为宜；高档成熟啤酒最好控制在0.05mg/L以下。 正常啤酒2.3-戊二酮和丁二酮（双乙酰）量比为1:36，,（2）形成途径：211页 异丁醇 缬氨酸 a-酮异戊酸 糖丙酮酸 活性乙醛 a-乙酰乳酸 a-乙酰乳酸 a-ALDC a-乙酰-a-羟基丁酸 乙偶姻 双乙酰 双乙酰 异亮氨酸 丁二醇 活cell 无活cell 2,3-戊二酮 丁二醇 残存啤酒,双乙酰： 酵母形成双乙酰的生物合成途径有两方面: 由乙酰辅酶A和活性乙醛缩合而成 丙酮酸+TPP 活性乙醛(CH3CHO-TPP)+CO2 辅羧酶（焦磷酸硫胺素） 活性乙醛+乙酰辅酶A 双乙酰+辅酶A a-乙酰乳酸（缬氨酸生物合成的中间产物）非酶分解成双乙酰 丙酮酸+活性乙醛 a-乙酰乳酸 双乙酰 2.3戊二酮 是酵母合成异亮氨酸的中间产物，它的前驱物质是a-乙酰，a-乙羟基丁酸（a-酮基羟基丁酸+活性乙醛）B-甲基戊酸,啤酒中的双乙酰含量取决于双乙酰的生成量和排出量之间的平衡，a-乙酰乳酸是酵母合成缬氨酸的中间产物，麦汁中缺乏缬 氨酸，a-乙酰乳酸形成的多。这种反应是非酶化学反应，生成速度非常缓慢。双乙酰被酵母还原成2.3-丁二醇比其生成速度快100倍，只要有酵母存在，双乙酰的含量不会很高，当双乙酰达到0.10.2ppm时酒便成熟。,（3）影响和消除的方法 减少a-乙酰乳酸的生成： 使用优良的菌株：不同的酵母菌种产生双乙酰的能力不同，对双乙酰的还原能力也不同 提高麦汁中a-氨基氮，缬氨酸高可抑制双乙酰合成。因缬氨酸含量高，抑制了丙酮酸合成缬氨酸，代谢作用降低。 加速a-乙酰乳酸非酶氧化： a乙酰乳酸双乙酰氧化还原，慢2，3-丁二醇（酶促反应，快）。 提高含氧量，适当通风有利分解。 酵母在发酵前期有强发酵力和产酸能力；迅速降低pH值, 控制和降低酵母的增殖浓度： -乙酰乳酸是在酵母繁殖期间形成的，减少酵母的繁殖量才能减少-乙酰乳酸的形成量，从而减少啤酒中双乙酰的生成量。故适当增加酵母接种量，降低酵母在发酵液中的繁殖温度；控制-AAN水平，有利于减少双乙酰的产生。 较低接种温度8-9C，提高酵母接种量15-20X106个/mL。（增殖级数3） ,加速双乙酰还原： 酵母菌株的影响-促进双乙酰渗透进入酵母细胞体； 菌株透过能力不同；加大罐压 双乙酰还原阶段酵母细胞浓度的影响-高利于还原； 双乙酰还原阶段温度的影响-高利于还原；,6、含硫化合物: 硫对酵母生长和发酵起着重要作用，酵母对无机硫的代谢也使啤酒中硫化物的含量升高，其中某些硫化物若含量过高，会给啤酒质量带来不良影响。 1、挥发性硫化物和非挥发性硫化物。 （1）（94%）非挥发性硫化物： （硫酸根离子、含硫氨基酸、含硫蛋白质等）他对啤酒风味影响较小，是酒中挥发性硫化物的来源。 （2）（6%）挥发性硫化物，对酒的风味影响很大，主要是： SO2、硫化氢，二甲基硫CH3SCH3 ，甲基硫醇CH3SH ，乙基硫醇CH3CH3SH 。它们的含量虽少10-610-9，但影响很大，尤其是过量，会影响风味,是近代关心的焦点.,硫化物的来源,（1）来自于原料：麦汁中含有的硫化物主要来自于麦芽、辅料酒花和酿造水，制麦汁过程中形成一部分挥发性的硫化物，有蛋氨酸，磺基丙氨酸，生物素，硫胺素以及含硫的蛋白质和肽等其含量50mg/L。在麦汁煮沸过程中，绝大部分蒸发了。 （2）发酵过程中形成的：酵母首先代谢有机硫化物，只有有机硫化物不存在的情况下，才利用硫酸根离子。 啤酒中硫化物的来源：大部分是在发酵时形成的。,啤酒中主要挥发性硫化物,（1）硫化氢 形成：来自酵母对半胱氨酸的同化作用，半胱氨酸在酶的分解作用下，产生H2S；另外酵母在合成蛋氨酸过程中受到抑制时的中间产物。 生成量受发酵温度，酵母菌株和含S氨基酸的影响。酵母自溶、酵母蛋白质水解，形成酵母臭。硫化氢的含量超过10g/L就能感到明显的生酒味。 用CO2洗涤可降低其含量。 （2） SO2是由酵母从硫酸盐还原形成的，最高含量5-20mg/L，对啤酒口味影响不大，主要用来抑菌。规定小于50mg/L。,（3）二甲基硫、二甲基硫醇：对啤酒风味影响很大，原麦汁中的二甲基硫，有腐烂的卷心菜味，是啤酒的生酒味之一。阈值为30-50ug/L。大多数在煮沸中挥发掉了，啤酒中的二甲基硫在焙焦和麦汁煮沸时形成，有麦芽香。 低含量的硫醇510g/L对啤酒的香气提供有利的影响，但过量则产生不良的影响。,第三节 啤酒发酵技术 啤酒发酵方法分成 分批式发酵传统发酵、大罐式发酵 连续式发酵 固定菌体式发酵分批式、连续式 啤酒发酵工艺技术控制没有深入到发酵代谢机制的控制，而是对其发酵过程中影响因素的控制。 一、啤酒发酵技术工艺控制 1、酵母菌株选择： 发酵速度、发酵限度、凝聚性、回收性和稳定性选择。 降糖快，双还原快，口味风味稳定的菌株。,2、麦汁组成：颜色、口味、组成直接影响酒质量。麦汁组成适宜，能满足酵母生长、繁殖和发酵的需要。 原麦汁浓度：指发酵前麦汁中含有可溶性浸出物的质量分数。1015%正常发酵； 溶氧水平：影响增殖、发酵，在39mg/L内增殖浓度相差50%； 不饱和脂肪酸：0.510.0mg/L会促进酵母增殖。 3、接种量： 一般泥状酵母占麦汁体积0.41.0kg/hl，接种后细胞数：153X108个/mL。,4、发酵工艺条件控制： A发酵温度变温发酵，指主发酵阶段的最高温度。一般低温发酵。原因是：低温发酵可以防止或减少细菌的污染，代谢副产物少，酿制出的啤酒风味好。 上面：1822，下面：715。 低温发酵: 6.07.579 依发酵温度分 中温发酵: 891012, 高温发酵: 9101315 低温发酵酵母增殖慢，最高酵母细胞浓度低，发酵过程中形成的双乙酰、高级醇等代谢副产物少，同化氨基酸少，pH值下降缓慢，酒花香气和苦味物质损失少，酿制出的啤酒风味好，此外酵母自溶少，使用代数多。 淡爽型啤酒多采用较高温度发酵。,B罐压、CO2对发酵影响： 在一定的罐压下酵母增殖量较少，代谢副产物形成量少，主要原因是由于CO2浓度的增高抑制了酵母的增殖。酒中CO2对发酵速率略有影响，能明显抑制乙酸乙酯、异戊醇生成，有利于酒的风味，加压发酵的理论根据。,第四节 传统啤酒发酵,传统式分批发酵，每批定型麦汁，经过添加酵母、前发酵（酵母增殖）、主发酵、后发酵和贮酒等阶段。 相应设备：酵母添加器、密闭或敞口式前发酵池和主发酵池，密闭式后发酵罐和贮酒罐。 前酵室（7-8度）、主酵室（6-7度）、后酵和贮酒室（2-0度）等相应部分。,一、酵母的添加和前发酵,1、酵母接种量 传统式分批发酵常常采用低温、缓慢发酵，因此，接种量比较小，接种后细胞浓度常控制在（5-12）*106个/mL. 压榨酵母每g有30-40亿个细胞，凝聚性酵母、自然沉降酵母泥中每g有18-25亿个细胞。 接种量计算,2.酵母添加方法 干道和湿道添加 干道添加：加酵母泥后加二倍量冷却麦汁，用无菌压缩空气混合，压到前酵池麦汁中，再用无菌压缩空气搅拌均匀。 湿道添加：酵母泥预先用5倍量麦汁（13-15）保温培养10-12h，酵母出芽繁殖，再混入发酵麦汁，直接进入主发酵池。此法麻烦，传统发酵几乎不采用。 传统式发酵酵母均采用干道添加,倍量添加法 在二批（锅）麦汁装一个发酵池时，第一锅麦汁中，用干道添加法加入全部满池使用的酵母泥，经无菌压缩空气搅拌充分后，发酵6-8h，再加入第二锅麦汁，用无菌压缩空气搅拌，发酵10-15h，转入主发酵。 分割法 当接种酵母泥不够生产使用时，采用分割法，可分割1-3次。多次分割会影响发酵啤酒风味。前酵池干道法接种后，发酵24-30h，压缩空气搅拌，一池分成二池，再补满同温度的冷却麦汁，然后发酵18-24h，可再分割或转入主发酵。 递加法 首次培养酵母不够一池的接种量，可采用逐步递加麦汁，每次递加间隔时间6-10h。 分割法和递加法的要点是在前酵池有足够细胞浓度，使麦汁有足够酵母优势，防止杂菌的繁殖。操作时间应在酵母繁殖达到一定浓度后进行。,3.前发酵 接种酵母泥处于休眠阶段，酵母和麦汁接触后，较长生长滞缓期，才能进入出芽繁殖，当酵母克服生长滞缓期，出芽繁殖细胞浓度达到2千万个/mL，发酵麦汁表面开始起沫。 前发酵时间随接种温度、接种量变化。低温16-20h,中温12-14h。 前发酵糖降不明显，外观浓度降0.5-1P，温度自然升高0.7-1.0 前酵室在主酵室上方，自然位差下酒。 前发酵属酵母启动阶段，室温控制比接种略高，无菌要求严格。,二、传统啤酒的主发酵,主发酵前期，酵母增值阶段：糖降缓慢，a-氨基氮下降迅速，pH下降。 酵母达到最高浓度时，糖降最快，可达1.5-2度。大量释放热，需冷却以保持最高发酵温度 发酵度达到凝聚点时，酵母凝聚，细胞减少，糖降降低，需逐步降温。 主发酵后期日降糖小于0.3 P 时，泡沫的回缩，形成了一种褐色的泡盖，由CO2 带至发酵液表面的多酚、酒花树脂、高分子蛋白质接触空气氧化后聚合而形成的，浮着在发酵液表面上的物质。泡盖里有析出物和一些杂质，要及时取出,主发酵下酒的条件控制：将嫩啤酒输送到贮酒罐的操作称下酒。 可发酵性糖：足够又不过剩的糖，一般保留后发酵中增加10%发酵度的糖 温度： 酵母细胞浓度：下酒酵母浓度控制在10106个细胞/mL。衰老采用加高泡酒后发酵,三、主发酵沉淀酵母处理： 为了使大部分酵母沉降（淀）。主发酵的最后一天要急剧降温，发酵液中还应保留适当的酵母浓度，以进行后发酵，回收沉淀的酵母，留作下次使用。,酵母沉淀在槽底后自然地形成三层，质量不同 上层：主要是轻质酵母，析出物及其它杂质，这一层分离后，只能作饲料 中层：是发酵力强的，新的酵母细胞，占75%，单独取出，留作下批使用。 下层：酵母为弱质细胞、死细胞及陈渣杂质，取出可作饲料或扔之。 这三层，人工分别取出，劳动强度大，但中、小厂仍采用人工。,处理：将酵母泥放贮存罐后，迅速添加0.5-2度无菌水降温稀释，加水量2-3倍，然后用80-100目铜网筛或不绣钢的、除去杂质，操作时注意不能污染，过筛后静止，使其沉淀，去掉上清液，除去死酵母和杂质（处理后保存）,四、主发酵池和主发酵室 （一）发酵池 1、容量：一般是糖化锅有效体积的120%。其中包括20%容纳泡沫的空间，发酵池的数量要根据糖化能力，发酵期相平衡，发酵池深度不超过2米，过深影响酵母沉淀、 CO2的逸出，清洗也不方便。,2、种类： （1）水泥池、钢筋混凝土结构交织而成，里外面抹成粗面，槽内涂沥青或其它涂料。 （2）铝板或不锈钢板制成，不用加涂料。 3、结构、开放式的正方形或长方形，在槽底的一边的中部设自发酵液排出口，为了控制温度，槽内有冷却管，吹风管，以分散酵母。,涂料,1、作用（1）防止腐蚀，因为啤酒偏酸性，对铁或水泥有腐蚀作用，所以发酵容器表面涂有涂料 （2）保护酒质，如果水泥、钢板表面腐蚀，都能产生怪味，铁腥味。 2、涂料理想条件： （1）无菌、无味，不影响酒质，与酒无反应。 （2）适应发酵条件下的温度变化，不龟裂，便于涂布，干的快，熔点50度左右。,3、常用涂料： （1）国内多用沥青，松香，白蜡等混合配料，若搞得好能用几年。 （2）环氧树脂涂料：国产6101号，634号，环氧树脂本身不硬化，经丙酮稀释后，再加胺类等硬化补料，可粘合金属，还可修补水泥裂缝。,主发酵室 1、位置：建筑在麦汁冷却室之下，储酒室之上，便于麦汁的流送 2、技术要求：室温要求长年保持5-7，应绝热良好，注意减少冷损失，绝热材料一般是用软木或塑料泡沫，绝热层厚度与墙厚度有关，墙40cm，绝热层12cm，墙75cm，绝热层8cm。,3、冷却方式： （1）直接冷却（排管冷却）：发酵室内有冷却排管利用它调节室内温度，制冷剂主要是氨。排管的安装注意：排管上的冷凝水不能滴到酒液中，所以排管一般安装在人行道两侧。 （2）间接冷却：（冷风式冷却）：应单独设空气冷却室，用风道连接发酵室，用风送机将冷风送入发酵室循环，循环方式有两种：一是下层风道进冷风，上层风道回热风。此方式发室外得另设CO2排出口；二是上层风道进冷风，下层风道进热风，把 CO2一起带走，不再设CO2排出口。,啤酒后发酵 作用,1 糖类继续发酵：在后发酵中发酵糖类主要是残余麦芽糖和主发酵中大多未发酵的麦芽三糖。 2 增加CO2的溶解：CO2是啤酒的重要组成部分，它能赋予啤酒起泡性和爽口性，增加啤酒的防腐性和抗氧化，CO2在啤酒中溢出能拖带啤酒芳香味散发 3 促进啤酒的成熟：啤酒风味成熟是复杂过程，包括还原、氧化、酯化、聚合等过程 4.促进啤酒的澄清。,啤酒的成熟,酵母代谢过程产生的，双乙酰乙醛和硫化氢。它们在后发酵中，含量逐渐降低。 1、乙醛：贮酒中乙醛含量降低较快，直到贮酒完了，基本达到要求。 2、H2S：含量过多有害，贮酒期，由于后酵的作用，饱和CO2时排出H2S成熟的啤酒H2S含量降到5ppm以下。 3、双乙酰：未成熟的啤酒双乙酰含量较多，成熟后含量0.15ppm以下。后酵期间降低双乙酰含量的措施： （1）下酒时保持适量的酵母浓度，利用酵母的还原酶，将双乙酰还原。 （2）适当的延长后酵的前期，能促进双乙酰的还原。 （3）后酵中避免啤酒与氧接触，避免-乙酰乳酸和其它有害物质的形成。,啤酒的澄清,1.澄清作用：在贮酒期间将啤酒中的悬浮物质沉淀下来，使啤酒达到澄清的目的，以便过滤啤酒时顺利的进行，产量才能多，啤酒的透明度才能高，稳定性才能好。 2.酒中主要悬浮物： （1）酵母细胞（2）冷凝固性蛋白质（3）酒花树脂（4）Pr和多酚物质的复合物,影响啤酒澄清因素,（1）悬浮物质，酵母根据凝聚性不同，有 不同的沉降效果.蛋白质，酒花树脂的析 出物，开始时很微小，颗粒互相接触，吸 附凝聚，形成大的颗粒，最后沉淀。速度 除和颗粒大小有关外，还与啤酒PH值，温度，粘度及酒液的对流等因素有关，冷混浊物，永久性混浊物在短时间内很难下沉,但这些物质可在早期析出，对成品酒有利。 （2）贮酒温度：低温贮酒，促进澄清。,（3）pH值：啤酒的pH值一般为4.2-4.4，有利于啤酒的澄清（下面发酵pH4.0-4.5澄清快；上面发