课件：微生物实验用菌株及其保藏.ppt

Food Lab Helen Zeng,微生物实验用菌株及其保藏,2019,-,1,微生物在生物界中的地位和分类 微生物特性概述 实验室常用菌株及其使用 菌种保藏方法及操作,纲 要,2019,-,2,Part 1 微生物在生物界中的地位和分类,一、生物的分类单位 界、门、纲、目、科、属、种 种是最基本的分类单位。 种(Species)：种是具有一定的自然分布区和一定的形态特征和生理特性的生物类群。在同一种中的各个个体具有相同的遗传性状，彼此交配(传粉受精)可以产生能育的后代。 种是生物进化和自然选择的产物。,2019,-,3,二、现行的生物界分类系统,2019,-,4,各界各司其职,种群占比,Q：那什么是微生物？,2019,-,5,三、微生物定义、分类及特点,微生物,细胞型微生物,非细胞型微生物,原核微生物,真核微生物,细菌,古生细菌,病毒,类病毒,寄生！,真菌,微生物概念：一群肉眼看不见的微小生物。 包括：细菌、螺旋体、立克次体、衣原体、支原体、放线菌（原核）、病毒（非细胞）、真菌（真核）。 原核与真核细胞的区别：细胞核！,2019,-,6,微生物 特点,结构简单、繁殖快、分布广、个体最小的生物。 结构简单：微生物多数是单细胞； 生长旺，繁殖快（大肠杆菌在它的适宜37-44之间，20-30分钟繁殖一代） 分布广.种类多（10万多种） ：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等。 个体小：小于0.1mm。肉眼不可见。 适应性强，易变异 代谢强，转化快,2019,-,7,2019,-,8,Part 2 微生物概述,一、细菌 细菌是单细胞原核微生物，个体微小，形态简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。 1.细菌的形态 三种基本形态:球状、杆状和螺旋状,2019,-,9,球菌(coccus）,菌体呈球形或近似球形,以典型的二分裂殖方式繁殖,分裂后产生的新细胞常保持一定的空间排列方式. 根据细胞分裂的方向及分裂后的各子细胞的空间排列状态不同,可将球菌分为以下几种:,单球菌,双球菌,链球菌,四联球菌,2019,-,10,球菌(coccus）,八叠球菌 按三个互相垂直的平面进行分裂后，每八个球菌在一起成立方体形. 如藤黄八叠球菌（Sarcina ureae),葡萄球菌 分裂面不规则，多个球菌聚在一起，像一串串葡萄。 如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus),2019,-,11,杆菌(bacillus ）,杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。一般情况下,同一种杆菌的宽度比较稳定,但它的长度经常随培养时间、培养条件的不同而有较大的变化。 杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等；按杆菌细胞的排列方式则有链状、栅状、“八”字状以及有鞘衣的丝状等。,短杆菌,长杆菌,梭状芽孢杆菌,2019,-,12,螺旋菌（spirillum）,螺旋状的细菌称为螺旋菌。 根据其弯曲情况分为： 弧菌：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌 螺旋菌：螺旋满26环，螺旋状。 螺旋体：旋转周数在6环以上，菌体柔软。,弧 菌,螺旋菌,螺旋体,2019,-,13,细菌的特殊形态,影响细菌形态的因素： 培养时间、培养温度、培养基成分、浓度、pH值等环境条件对细菌形态都有明显的影响。,2019,-,14,2.革兰氏染色法 细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。 临床意义：1.鉴别细菌 2.选择药物 3.与致病性有关：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素，两者致病作用不同。 原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，革兰氏阳性菌仍呈紫色。 而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经番红花复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。,2019,-,15,操作步骤：初染-媒染-脱色-复染 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。自来水冲洗。 3）加碘液覆盖涂面染约1分钟。水洗，用吸水纸吸去水分。 4）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 5）蕃红梁色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。 6）干燥，100倍油镜镜检。,2019,-,16,3.几种重要的细菌种属,3.1金黄色葡萄球菌 （Staphyloccocus aureus） 分布：空气、饮水、地面、物体表面、人和动物的体表、粘膜等处广泛存在。 特性：革兰氏阳性球菌，能在12-45生长繁殖，最适生长温度为37。 危害：A.常引起人和动物化脓性疾病，又称化脓性球菌。 B.可产生肠毒素且毒素非常耐热，食品中若生长有此菌，人食后能引起食品中毒。 预防：手指处有伤口、化脓口的人，不要直接接触产品；彻底对手指进行洗净消毒，要戴手套；要戴帽子、戴口罩。 杀灭：热8030分钟才能杀死，煮沸可迅速使它死亡。,2019,-,17,3.2.大肠菌群（coliform） 卫生细菌领域的用语，指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。 定义：需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 特性：革兰氏阴性杆菌，能大肠菌群在自然界中分布广泛，在1546均可生长，最适生长温度为37. 分布危害：A.大肠菌群为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。B.在水和土壤中大量存在，对自然环境有较强的抵抗力。主要污染的食品是肉类、水产品、蔬菜等。 杀灭：85热水1-3分钟内杀灭本菌。,-,3.3沙门氏菌（salmonella） 是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科的一个大属，也是肠杆菌科中最重要的病原菌。 分布危害：在水中不易繁殖，但可生存2-3周，冰箱中可生存3-4个月，在-25可存活10个月，在自然环境的粪便中可存活1-2个月。常在动物中广泛传播，人的沙门氏菌感染也非常普遍。世界上沙门氏菌的食物中毒占首位。 特性：革兰氏阴性杆菌，最适繁殖温度为37，在20以上即能大量繁殖。已发现的近一千种(或菌株)。 杀灭：对热及外界环境的抵抗力属于中等，602030分钟、755分钟即被杀死，100条件下该菌立即被杀死。,-,3.4 痢疾杆菌/志贺氏菌（Shigella） 特性：革兰氏阴性，为两侧平行、末端钝圆的短杆菌，需氧或兼性厌氧。 分布：本属细菌在染菌的衣物中，室温暗处可存活546日在泥土中，于室温暗处可存活912日，自然污染的粪便，如使之保持碱性并湿润，可在其中存活很多天，但如有大肠杆菌或其它产酸菌活动时，数小时便可死亡，在水里可存活数月，在2的冰块中可存活53日。 危害：为侵入性细菌，只需千个、百个、甚至几个就可能引起疾病发生，菌体进入体内后侵入空肠粘膜上皮细胞繁殖，产生外毒素，菌体破坏后产生内毒素作用于肠壁、肠壁粘膜和肠壁植物性神经。能致人腹痛、呕吐及频繁的腹泻，并伴有水样便，便中混有血液，发热，或致人痉挛。 杀灭：经55加热1小时、或0.5石炭酸作用6小时或1石炭酸作用1530分钟即可杀死。,-,人体中的微生物,部位 常见菌种 皮肤 表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、绿脓杆菌、耻垢杆菌等 口腔 链球菌（甲型或乙型）、乳酸杆菌、螺旋体、梭形杆菌、 白色念球菌、（真菌）表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏 球菌、类白喉杆菌等 胃 正常一般无菌 肠道 类杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、厌氧性链球菌、粪链球菌 葡萄球菌、白色念球菌、乳酸杆菌、变形杆菌、破伤风杆菌、 产气荚膜杆菌等 鼻咽腔 甲型链球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感杆菌、 乙型链球菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌 眼结膜 表皮葡萄球菌、结膜干燥杆菌、类白喉杆菌等,2019,-,21,二、真菌 霉菌和酵母同属于真菌。 1.霉菌：为丝状真菌的统称。 霉菌的菌体由分枝或不分枝的菌丝构成。 许多分枝菌丝相互交织在一起构成菌丝体。 菌丝是中空管状结构，直径约2-10m。,根 霉,酵 母,2019,-,22,2.2.按分化程度分: 营养菌丝（基内菌丝）:伸入到培养基内部，以吸收养分为主的菌丝。 气生菌丝:向空中生长的菌丝. 气生菌丝发育到一定阶段可分化成繁殖菌丝.,2.霉菌菌丝类型： 2.1.按形态分：,2019,-,23,3.真菌的繁殖方式和分类,繁殖方式,菌丝片段,无性孢子,有性孢子,卵孢子 接合孢子 子囊孢子 担孢子,孢子,孢囊孢子 分生孢子 节孢子 厚垣孢子,无性生殖,有性生殖,有性繁殖：经过两个性细胞结合而产生新个体的过程。 按有性生殖方式将真菌分属为鞭毛菌亚门、接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。,2019,-,24,4.霉菌代表属,4.1.根霉属（Rhizopus)： 属于接合菌亚门(Zygomycota)，接合菌纲(Zygomycetes)，毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，根霉属(Rhizopus) 。 分布:分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。 形态特征： 菌丝也为白色、无隔多核的单细胞真菌，多呈絮状。 根霉有假根和匍匐枝，与假根相对处向上生出孢囊梗。孢子囊梗与囊轴相连处有囊托，无囊领。,2019,-,25,4.霉菌代表属,4.2.曲霉属(Aspergillus) 多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。 分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。 形态特征： 菌丝发达多分枝，有隔多核的多细胞真菌。分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌丝细胞（足细胞）上垂直生出；分生孢子头状如“菊花”。,-,4.霉菌代表属,4.3.青霉（Penicillum): 多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。 分布：广泛分布于土壤、空气、粮食和水果上，可引起病害或霉腐变质。 形态特征：与曲霉类似，菌丝也是由有隔多核的多细胞构成。但青霉无足细胞，分生孢子梗从基内菌丝或气生菌丝上生出，有横隔，顶端生有扫帚状的分生孢子头。分生孢子多呈蓝绿色。扫帚枝有单轮、双轮和多轮，对称或不对称。,-,常见真菌（一）,黑曲霉,桔青霉,2019,-,28,致病真菌（二）,白色念珠菌,须癣毛癣菌,2019,-,29,三、微生物和人类,1.微生物对人类有利有弊 A.微生物对人类的益处：酿酒、制醋等； B.微生物对人类的害处：食物中毒、各种鼠疫、天花等传染病危害人类； 2.微生物的控制 消毒：是指应用物理或化学方法杀死物体表面和内部的病原微生物，而对非病原微生物及其芽孢、孢子并不严格要求全部杀死。用于消毒的化学物质，称为消毒剂。 灭菌：是指杀死一切病原菌和非病原菌及其芽孢和孢子，使物体上无任何存活的微生物。,2019,-,30,消毒剂的使用,1、消毒剂的浓度：消毒剂的消毒效果，一般与其浓度成正比，75-80%的酒精杀菌效力最好； 2、微生物的种类：微生物的种类如细菌、病毒、真菌等对消毒剂的敏感性不同。 3、有机物的存在：有机物中的蛋白质易和许多消毒剂结合，严重降低消毒的效果。对物体进行消毒必须先洗净油污。 4、温度：温度升高，杀菌力加强。温度升高10杀菌力增加2-5倍。 5、接触时间：细菌与消毒剂接触时间愈久，消毒效果好。 6.次氯酸钠作为杀菌剂使用时，必须含有有效次氯酸钠100-200ppm。器具必须充分洗净。另外，如和其它药剂混合使用，就会产生有毒气体（氯气）。 要特别注意不要与其它杀菌剂混杂使用！,2019,-,31,Part 3 实验室常用菌株及其使用,一、实验室常用菌株（细菌） 金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus ATCC6538P 金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus ATCC6538 耐药金葡MRSA（methicillin-resistant Staphylococcus aureus） 大肠杆菌 Escherichia coli ATCC25922 大肠杆菌 Escherichia coli ATCC8739（CGMCC1.2463） 大肠杆菌 Escherichia coli 8099（CGMCC1.3373） 出血性大肠埃希氏杆菌 Entero hemorrhagic E.coli,EHEC CICC21530 绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC15442 绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC9027（CGMCC1.2464） 鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella typhimurium CMCC50115 甲型副伤寒沙门氏菌 Paratyphoid salmonella CMCC（B）50093-6 肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella pneumoniae ATCC4352 福氏志贺氏菌 Shigella flexneri CMCC51572-7 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis ATCC6633 蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus CMCC63303 副溶血性弧菌 Vibrio parahaemolyticus ATCC17802（CGMCC1.1997） 单核增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes CMCC54001 产气荚膜梭菌 Clostridium perfringens NCTC64609,2019,-,32,Part 3 实验室常用菌株及其使用,一、实验室常用菌株（真菌） 白色念珠菌 Canidia albicans ATCC10231（CGMCC2.2086） 黑曲霉 Aspergullus niger ATCC16404（CGMCC3.5487） 黑曲霉 Aspergullus niger ATCC6275 黑曲霉 Aspergullus niger ATCC9642 出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans ATCC15233 出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans CICC40329（AS3.3984） 绳状青霉 Penicillium funiculosum CICC40279（AS3.3875） 赭绿青霉 Penicllium ochrochloron CICC40378（AS3.4302） 嗜松青霉 Penicillium pinophilum ATCC11797 桔青霉 Penicillium citrnum AS3.2913 宛氏拟青霉 Paecilomyces varioti CICC40379（AS3.4253） 绿色木霉 Trichoderma viride ATCC9645 绿色木霉 Trichoderma viride CICC40380（AS3.2984） 米根霉 Rhizopus oryzae AS3.777 球毛壳霉 Chaetomium globosum ATCC6205 土曲霉 Aspergillus terreus CICC40377（AS3.3935） 光孢短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulis AS3.3985 疣孢漆斑菌 Myrothecium verrucaria AS3.781 枝状枝孢菌 Cladosporium cladosporioides AS1.4021 须癣毛癣菌 Trichophyton mentagrophytes ATCC9533,-,几个概念,种：亲缘关系较近的微生物有机体的集合，它们在进化发育阶段上有一定的共同形态和生理特征。现代分类学上规定种内菌株的DNA同源性70%。 变种：从自然界分离到的微生物纯种，如果与典型种之间存在某些特征的差别，而这些特征又是稳定遗传的，则可将这一纯种称为典型种的变种。如枯草芽孢杆菌的黑色变种。 小种（亚种）：实验室中获得的微生物变异型称为小种或亚种。 型：自然界存在的差异较小的同种微生物的不同类型，称为型。如结核分支杆菌依其寄主的不同可分为人型、牛型和禽型。 菌株（品系）：来源不同的同种微生物的纯培养，均可称为菌株。 群：有些微生物的特征介于两种微生物之间，我们把这两种微生物及其中间类型统称为一个群,2019,-,34,1.1菌种库介绍（国外） A.美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection）ATCC 该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。 另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。 主页：/ B.日本技术评价研究所生物资源中心(NITE Biological Resource Center)NBRC NBRC（IFO）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。 该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。该中心保藏的菌种可出售。 主页：http:/www.nbrc.nite.go.jp/,2019,-,35,国外其他菌种保藏中心还有： 英国国家菌种保藏中心(The United Kingdom National Culture Collection )UKNCC 德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen )DSMZ 荷兰微生物菌种保藏中心(Centraalbureauvoor Schimmelcultures)CBS 台湾生物资源保存及研究中心（食品工业发展研究所）(Bioresources Collection and Research Center)BCRC,2019,-,36,1.1菌种库介绍（国内） C.中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection）CICC 专业从事工业微生物菌种保藏管理的国家级公益性资源机构，负责全国工业领域生产与研究应用微生物菌种的收集、鉴定、评价、保藏、供应与国际交流、微生物菌种保藏技术与应用技术的研究与培训等。CICC目前保藏国内外各类工业微生物菌种10153株，30余万备份，其中细菌4445株，酵母菌3222株，霉菌2220株，大型真菌266株。共计212个属，839个种。 主页：/ D.广东省微生物菌种保藏中心 主页：/index.asp 中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC) 中国农业微生物菌种保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China）ACCC,-,菌株传代及培养,酒精灯！,接种环！,转种时须不离火焰！,操作完后善后！,2019,-,38,Part 4 菌种保藏方法及操作,1.菌种保藏意义 由于微生物具有繁殖快、易变异的特性，为了避免保存期间和传代过程中的死亡、变异、衰退及微弱，保持菌种原有的各种生物学特性。 原理：利用微生物的孢子、芽孢及营养体，根据其生理、生化性，采用干燥、低温、冷冻或减少氧气供给等方法以中止其繁殖，降低其