课件：肿瘤基因治疗aa.ppt

基因治疗肿瘤的策略,生工0902班 aa,肿瘤,肿瘤（tumor）是一种当调节正常细胞生长的控制系统失灵的时候所发生的疾病。,引起肿瘤的原因很多：,物理因素 化学因素 病毒感染,任何原因引起的细胞癌变都是直接或 间接引起宿主细胞基因功能的改变所 致，因此，肿瘤是一种基因病。,与肿瘤有关的两类基因：,癌基因（Ontogeny, onc） 抑癌基因（Tumor suppressor gene）,癌基因（oncogene, onc）是指细胞内控制细胞正常生长的基因(原癌基因)，在异常表达时，这些基因不受体内各种调节因素的影响，可持续表达，或高活性表达，其产物可使细胞持续增殖。 原癌基因:（Proto-onc ）是一种正常的细胞基因，在正常细胞中编码关键性调控蛋白，在细胞增殖和分化中起重要调控作用，当其突变或调控失灵时可引起细胞癌变,肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗最引人瞩目的研究领域，是继手术、放疗、化疗、免疫治疗之后的第五种模式,是肿瘤治疗的有益补充。 基因治疗就是用正常或野生型基因校正或置换致病基因的一种治疗方法。,基因治疗的程序,选择治疗基因,选择运输治疗基因的载体,将治疗基因导入体内或靶细胞,治疗基因在体内表达,基因治疗的基本程序： 1.目的基因准备； 2.受体细胞（靶细胞）培养； 3.载体的选择与克隆； 4.将目的基因导入靶细胞； 5.转导细胞的选择和鉴定； 6.基因治疗的安全性鉴别及疗效评价。,基因治疗的主要措施有： 1.基因置换（gene replacement）将致病基因整个的换以 正常基因，使致病基因永久的得到更正； 2.基因修正（gene correction）将基因的突变碱基序列 纠正，而正常部分给予保留； 3.基因修饰（gene augmentation）将目的基因导入病变 细胞或其它细胞，目的基因的表达产物修饰改 变缺陷细胞的功能，或使原有的功能得到增强； 4.基因失活（gene inactivation）应用反义核苷酸或核酶特异 的封闭某些致病基因的表达；,区别几个概念： 将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做转移（transfer） 针对宿主细胞叫做转导（transduction） 而这一过程叫做转染（transfection） 目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫做转化（transformation）,第一节 增强宿主抗肿瘤免疫肿瘤疫苗的作用 抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方案。为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要包括 一、通过APC增强对肿瘤抗原的识别与呈递。 二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。 三、增强肿瘤细胞表达的共刺激分子。,第二节 恢复和增强抑癌基因的功能引入抑癌基因 抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性的作用。,第三节 阻断癌基因功能-反义核酸RNA干扰技术 细胞中原癌基因的表达受到严格控制。ras、myc、src这一类癌基因由于突变而使其功能处于异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长。因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位rev等方法，阻止癌基因功能。,反义核酸技术的基本原理是根据核酸碱基互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合的DNA或RNA，以影响其靶基因的表达，抑制其功能。 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为双链RNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程,是一项新兴的基因阻断技术。 RNAi是一种转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)现象。,与传统的基因研究方法基因敲除、定点突变、反义核酸及核酶技术等相比 ，RNAi具有以下五大特点： 基因序列特异性； dsRNA的稳定性； 沉默信号传递性； Knock-down高效性； RNAi效用浓度依赖性。,第四节 核酶用于基因治疗 1983年美国Cech和Altmann发现并鉴定了一类具有酶催化作用的核苷酸片断，称为核酶(Ribozyme)。这一发现使酶的概念从蛋白领域扩展到核酸领域。 核酶具有核苷酸内切酶的活性，它能在无蛋白质的条件下切割靶RNA分子。,核酶用于基因治疗的条件是 找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质； 这种蛋白的氨基酸序列（和编码基因序 列）必须是已知的，以便设计核酶的切 割位点； 所设计的核酶必须能够切割靶RNA； 肿瘤细胞必须能摄取这种核酶， 并能在细胞内切割靶RNA。,2019/9/1,19,可编辑,反义治疗并不像刚开始人们所想像的那么简单，目前还有许多关键性问题有待去解决，如生物学稳定性，药物的释放系统，以及由序列特异性和非特异性所引起的作用包括毒副作用等。应用反义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基因有Ha-ras、c-myc、c-fos、c-jum、c-erbB2等癌基因以及编码端粒酶基因，或端粒酶的RNA部分。,第五节 抗肿瘤血管生成的基因治疗 肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相关,由于肿瘤的血管生成受到血管生长因子、血管生长抑制因子以及其它的因子的共同调控,因此通过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑制因子的表达均可达到治疗的目的。,一、阻断血管生长因子的作用 主要是采用反义DNA、中和性抗体、受体酪氨酸激酶的抑制剂以及核酶等。 用腺病毒载体介导的VEGF 的拮抗物输入鼠卵巢癌抑制VEGF 的活性； 利用含有VEGF cDNA 的腺病毒载体转染乳腺癌细胞,用以拮抗VEGF 的促血管生成作用； 用抗VEGF 的核酶抑制VEGF 的表达,使卵巢癌生长及血管生成减少的报告。 针对其它的血管生成因子的治疗, 如bFGF , 缺氧诱导因子( HIF) , EGF , PDGF ,PDECGF ,IGF ,Ets-1 ,HGF 等的因子的治疗。,二、上调血管生长抑制因子 用重组血管抑素cDNA 输入消化道肿瘤可取得较好的治疗效果, 用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制内皮细胞迁移和VEGF 介导的血管生成, 病毒载体介导的重组编码PF4 的反义基因显示出抗鳞癌血管生长的作用。,三、抑制细胞外基质和基膜降解以及抑制内皮细胞特异性粘附分子的作用 用腺病毒载体介导的T1MP-1 基因转染肿瘤细胞,瘤细胞产生的T1MP-1 抑制了MMP-2 ,MMP-9 的活性,使内皮细胞的迁移受到抑制。Gondi 等采用双顺反子逆转录病毒载体介导的反义uPAR 和uPA 治疗胶质瘤,明显抑制了肿瘤的血管生成。,第五节 、加大肿瘤细胞与正常细胞的天然差别 自杀基因治疗 自杀基因（suicide gene）治疗思路就是人为地改变肿瘤细胞的状态，将一些“自杀基因”(TK基因、CD基因和较新的细胞色素p450-2B1基因)转导入肿瘤细胞中，这些基因所表达的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的物质转变为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞的作用。,自杀基因治疗对免疫功能的激发作用 诱导炎症细胞浸润（T细胞、单核细胞、中性粒细胞）； 诱导细胞因子的分泌（IL-1、TNF-、IL-1、IL-6、mRNA在治疗后第2天开始表达,而IFN-、GM-CSF在治疗后第2天开始表达，到治疗后第4天仍有表达，其中以TNF-表达升高最明显）。,第六节 提高化疗效应耐药基因治疗 肿瘤化疗中最难处理的问题之一 就是出现瘤细胞对许多常用化疗药物产生抗药性和交叉抗药性，有些肿瘤开始敏感，但经过一段时间后出现耐药性,这种耐药性常表现为肿瘤细胞对多种结构不同、作用靶位不同、作用方式不同的抗肿瘤药物具有抵抗性,称为多药耐药(multidruge resistance,MDR)。,在肿瘤治疗中多数抗癌药物是促进细胞凋亡的，而癌细胞的耐药是化疗中最棘手的问题。在报道中将BCl-2转入癌细胞则癌细胞变为耐药，目前从凋亡角度来研究肿瘤的耐药性，可能找到新的解决方法。,第七节 肿瘤基因治疗研究面临的主要问题 基因治疗是21世纪治疗恶性肿瘤的重要手段。 一、基因导入的载体系统 目前所采用的载体主要分为转染性和转导性载体。 转染性载体是利用化学或物理方法增加细胞膜的通透性而将DNA 转染入细胞内,包括脂质体和基因枪等。 转导性载体则是利用病毒对细胞的天然亲和力把遗传物质引入宿主细胞。 转染的方法相对简易,抗原性弱但效率较低,而且基因表达的持久性不够。因此它在肿瘤基因治疗中的使用受到限制。转导法则效率高,作用持久,但抗原性较强,目前大多数基因治疗程序仍以病毒介导。逆转录病毒是目前最为成熟、运用最广的进行基因转移的载体系统。,二、基因治疗的靶向性策略 带有目的基因的载体如何到达“靶细胞”是肿瘤基因治疗的关键。只有提高基因转导的靶向性,才能实现治疗的针对性和安全性。 目前解决基因的靶向转移及表达有3 种策略 用基因工程手段改造基因载体,如改造逆转录病毒包装细胞中的原病毒env 序列,使所包装的重组病毒特异地识别位于靶细胞表面的抗原或受体决定簇; 在体内基因传递系统中共价连接抗瘤抗体和肿瘤细胞特异受体的配基,使基因在类似“生物导弹”作用下被送到肿瘤细胞表面; 应用肿瘤细胞特异蛋白“管家基因”的基因表面调控元件,在转录水平调控目的基因在靶细胞中特异表达。国外已开始针对VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 设计反义基因或调控VEGF 的基因作为目的基因,这种思路很有发展前途。,三、外源基因在体内表达的可控性 外源基因导入后,在体内的表达若能人为调控,将对恶性肿瘤及诸多疾病的基因治疗有所突破。目前已经发现了一个可诱导的调控系统TAXI/UAS 系统。该系统应用一个酵母GAL4 的顺式元件作为外源基因的上游,另组建一个激素受体(孕酮) 及一段GAL4 的反调控基因子的嵌体,将两个载体共转染靶细胞后,只有当诱导物(孕酮) 或其拮抗物(米非司酮) 存在时,目的基因才能表达。,四、其他原因 某些体内原代细胞转基因及基因表达水平往往不及体外建株细胞； 靶基因在体内表达持续时间较短； 在处理多系统基因紊乱过程中基因治疗的作用远未清楚； 基因治疗刚开始用于人体实验，其长期疗效和不良作用尚不清楚，有待于大量的实验研究,问题与展望 肿瘤基因治疗的研究进展很快，临床上在部分肿瘤中使用基因治疗已经显示出较好的抗癌、抑癌作用与较轻微的副作用，但还需要进一步增加该疗法的特异性与基因转导靶癌细胞的有效性研究。 目前使用最多的是病毒载体，如：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒。非病毒的基因治疗方法包括：脂质体、无载体的DNA（裸DN