2016上海交通大学遗传学实验PPT实验七细菌转导.ppt

实验顺序：先做后讲，因为中间需要等待2小时 分组方案： 2人制备噬菌体裂解液 2人涂受体菌平板和点加噬菌体,实验七、细菌的局限性转导,五、实验步骤 （一） 噬菌体裂解液的制备（制备dgal）,5ml供体菌,防止污染！,打开盖，UV 15S,1-N：张三 李四 王五 赵六,1. 按右图在EMB平板上做好标记,2. 用受体菌涂出两条菌带（1-2环菌/条）,3. 37倒置培养1.5小时,（二）转导（点滴法）的步骤,实验七、细菌的局限性转导,一、实验目的 （一）了解转导的基本原理 （二） 掌握转导实验的基本方法 （三）验证细菌遗传物质可以通过噬菌体转移,二、实验原理 (一）转导的概念：转导是以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质的重组过程。在这一过程中，细菌的一段染色体被错误地包装在噬菌体的蛋白质外壳内，并通过感染而转移到到另一个受体细菌内,Joshua Lederberg (1925-2008) 1958年获诺贝尔奖,（二）转导的发现 由Lederberg和Zinder于1952年发现,鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium） 的两种营养缺陷型,LA2: phe+trp+tyr+his-,LA22: phe-trp-tyr-his+,基本培养基,基本培养基,单独培养,基本培养基,LA22 + LA2,混合培养,LA2: phe+trp+tyr+his-,LA22: phe-trp-tyr-his+,LA22,LA2,FA?,U形管培养,LA2: phe+trp+tyr+his-,LA22: phe-trp-tyr-his+,吹/吸,LA22菌株上清液,基本培养基,+ RNA酶 + LA2菌株,+ DNA酶 + LA2菌株,基本培养基,噬菌体介导的遗传物质转移,转导,菌落裂解？,P22,发生机理,“We werent looking for transduction-we bumped into it”.,(三）转导的类型,P22噬菌体,噬菌体,1. 普遍性转导可以转导细菌染色体组的任何部分，例如P22噬菌体介导的转导,2. 局限性转导只能转导细菌染色体组的特定部分，例如噬菌体介导的转导,A,B,普遍性转导可以转导细菌染色体组的任何部分 （例如：P22噬菌体）,A基因组的任何部分都可能通过转导噬菌体进入B基因组,细菌染色体, (dgal+), (dbio+),原噬菌体,局限性转导只能转导细菌染色体组的特定部分 （例如:噬菌体只能插到宿主基因组的gal和bio之间，所以只能转移gal或bio基因）,噬菌体 由外壳蛋白和DNA组成 基因组DNA全长48.5kb 至少有61个基因 头部的包装上限为51kb,（四）本实验的原理,5 GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA 5,3,3,cos,cos,cos,环化,噬菌体DNA的环化,A,D,C,B,噬菌体DNA插入大肠杆菌基因组,A,D,C,B,溶源性细菌,原噬菌体,细菌基因组DNA,gal +,插入宿主菌基因组的原噬菌体随宿主菌的分裂而增殖，当受到紫外线照射或温度改变时可以造成阻遏物失活，使裂解相关基因表达，噬菌体DNA环出、复制、转录、翻译、包装，细菌裂解，释放出数百个新噬菌体,环出、复制、转录、翻译、包装,裂解,释放子代噬菌体,在环出、复制、包装过程中偶尔会发生错误而产生转导噬菌体（频率10-6),转导噬菌体能感染宿主菌，但由于DNA缺失，不能独立完成复制、包装等过程，所以是缺陷噬菌体,溶菌控制,晚期控制,DNA合成控制,阻遏,早期控制,重组,删除与整合,尾部合成,头部合成,噬菌体基因组DNA各部分的功能, (dgal+),E. coli K12S gal,E. coli K12S gal,受体菌,受体菌,通过转导噬菌体获得gal+基因的受体菌称为转导子 转导子因能利用半乳糖而产生大量的酸，在EMB培养基上显示为紫色,并带有金属光泽,非转导子因不能利用半乳糖而不产生大量酸，在EMB培养基上显示为白色,E. coli K12() gal+是一种双重溶源菌,(dgal+),裂解液中 (dgal+) (转导噬菌体)占50% (正常噬菌体)占50%,宿主菌染色体,本实验所用的供体菌,三、实验材料 供体菌：E. coli K12()gal+ 受体菌：E. coli K12S gal- 四、实验器具和药品 1. 器具：培养皿，试管，离心管，接种棒，移液器 2. 培养基：LB液体培养基，2LB液体培养基，半乳糖EMB培养基。（配制方法见遗传学实验指导） 3、试剂：磷酸缓冲液（PB）、氯仿,五、实验步骤 （一） 噬菌体裂解液的制备（制备dgal）,37过夜,取1ml,100 ml LB,5ml供体菌,37 3 hr,E. coli K12()gal+,防止污染！,打开盖，UV 15S,（诱发SOS反应）,1-N：张三 李四 王五 赵六,1. 按右图在EMB平板上做好标记,2. 用受体菌涂出两条菌带（1-2环菌/条）,3. 37倒置培养1.5小时,4. 在两个圆圈中各接种一环噬菌体,5. 在四个方格中各接种一环噬菌体 (防止污染）,6. 37倒置培养48-72小时后观察结果,（二）转导（点滴法）的步骤,实验材料 供体菌（gal，用于制裂解液，分发，1管/组） 半乳糖EMB平板（超净台内，2块/组） 灭菌空培养皿（超净台内，1个/组） 灭菌离心管（超净台内，2支/组） 受体菌（gal，用于涂EMB平板，超净台内，公用） PB（磷酸缓冲液，超净台内，公用） 2LB （超净台内，公用） 氯仿（超净台内，公用） 仪器设备 离心机（201室右侧，公用） 培养箱（206