链霉素.ppt

第十一章 抗生素类药物的分析 （Analysis of Antibiotics Drugs）,第一节 概 述 第二节 -内酰胺类抗生素 第三节 氨基糖苷类抗生素 第四节 四环素类抗生素 第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查,第一节 概 述,一、抗生素药物的特点： 抗生素（antibiotics）是指“在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异性抑制作用的化学物质的总称”。 1低化学纯度同系物多、异构体多、降解物多； 2活性组分易发生变异;活性组分的变异性生产过程中条件的变化； 3稳定性差不稳定性结构。,二、抗生素类药物的质量分析 Quality Analysis/Quality Control-QA/QC,鉴别试验Identification,1 显色反应特殊基团的反应（-内酰胺类的羟肟酸铁反应、麦牙酚反应、坂口反应） 2 光谱法特征吸收（IR、UV） 3 色谱法保留行为（标准对照法） 4 生物学方法抗菌能力（抗生素灭活前后的抑制菌能力）,检查（Investigation）,1、影响产品稳定性的指标 结晶性、水份、酸碱度等 2、有机和无机杂质检查澄清度与颜色、有关物质、重金属等 3、与临床安全性密切相关的指标 异常毒性、热原、降压物质等 4、其他检查“悬浮时间与抽针试验”、其他共存组分,含量测定或效价测定(Potency) Determination,Potency:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少，以u或g表示。以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的一种方法。 如：1mg的青霉素钠为1670单位；1mg的庆大霉素定为590单位。（以上仅为理论效价，实验样品低于该理论效价）,1、微生物检定法 稀释法配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得最低抑菌浓度(MIC)。 比浊法标准曲线法。 管碟琼脂扩散法抑菌圈。标准曲线法或者标准对照法，以抑菌圈直径为横坐标，含药浓度为纵坐标。,方法种类,灵敏度高、需用量少 适用范围广纯品、不纯品、已知的和新的 可一次测定同类型抗生素的总效价无需分离纯化，与临床的应用要求一致 操作繁琐、费时费力 误差较大 培养时间长,是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法,特点,缺点,2、物理化学法 High-performance liquid chromatography（HPLC） Liquid chromatography-Mass spectrometry（LC-MS） UV 容量法,准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少,1、对结构已知或提纯的抗生素 2、需要标准品对照,仪器分析方法,1、不一定代表生物效价 2、易受杂质干扰,缺点,适用范围,优点,内酰胺类抗生素青霉素、头孢菌素类 氨基糖苷类抗生素链霉素、庆大霉素、卡那霉素等四环素类抗生素四环素、金霉素、土霉素等 大环内酯类抗生素红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素等 多烯大环类抗生素制菌霉素、两性霉素B 多肽类抗生素放线菌素、多黏菌素 苯烃胺类抗生素氯霉素 蒽环类阿霉素、紫红霉素等,三、抗生素类药物的分类(Classification）,四、抗生素的生产与杂质来源 （一）抗生素的生产主要采用两种方法： （1）生物合成（发酵）：生物包括微生物（真菌、放线菌、细菌等）、植物、动物。 （主要生产方法） （2）化学合成或半合成方法制取（少数生产方法） （二）抗生素杂质的主要来源： （1）生产过程中带入 （2）贮藏过程中产生,第二节 -内酰胺类抗生素 （-Lactam Antibiotics）,* 1. 青霉素类（PC） * 2. 头孢菌素类（CEP） 3. 头霉素 4. -内酰胺酶抑制剂 5. 其他,一、化学结构的特点： 1、分子结构的母核由A环（-内酰胺环）与B环（氢化噻唑环式氢化噻嗪环）骈合而成： 青霉素族（PC）的母核：6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic acid，简称6-APA）； 头孢菌素（CEP）族的母核：7-氨基头孢菌烷酸（7-aminocephalosporanic acid，简称7-ACA）。,青霉素族（PC）,头孢菌素族（CEP）,-内酰胺类抗生素结构,6-APA,7-ACA,-内酰胺类抗生素结构示例：,青霉素类 头孢菌素类 碳青霉烯类,头霉素类 单环-内酰胺类,理化性质 （1）酸性与溶解度； （2）旋光性； （3）紫外吸收光谱； （4）-内酰胺环的不稳定性,酸性,结构特点与性质,与碱金属(Na+、K+)成盐,（一）羧基,易溶于水,Na,（二）手性C,头孢菌素类 C6 C7,青霉素类 C3 C5 C6,旋光性,（三）共轭体系,头孢菌素类 母核有共轭体系,青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基,UV,（四）内酰胺环,水溶液 不稳定,干燥纯净 稳定,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,放置环境,青霉素的降解途径,与含水量和纯度密切相关,青霉素的降解产物,青霉噻唑酸青霉素酶 青霉酸强酸性环境 青霉烯酸弱酸性环境 青霉醛强酸性-加热 青霉胺强酸性-加热/青霉素酶-重金属,降解产物,二、鉴别反应,1、TLC法,2、HPLC法,比较Rf和斑点颜色,供试品,对照品,相同条件,R,t,比较,供试品,对照品,相同条件,（一）色谱法,（二）光谱法 1红外光谱（IR）吸收,3180cm-1 N-H,内酰胺 C=O,1780cm-1,3470cm-1 O-H,1690cm-1 仲酰胺C=O,1250cm-1 C-O,以阿莫西林IR图谱为例,2、UV法,样品、分解产物,利用最大吸收波长鉴定法； 水解产物的最大吸收波长鉴定法。,（三）呈色反应,1、 羟肟酸铁反应,-内酰胺类,H2NOHHCl,NaOH，C2H5OH,2. 类似肽键的反应茚三酮反应,-氨基,蓝紫色,3. 双缩脲反应,似肽键,4. 与重氮苯磺酸反应,头孢哌酮,酚羟基,橙黄色,重氮苯磺酸,-,-,5,6,OH,H,C,（偶合）,5. 与变色酸-硫酸反应,活泼“-CH2-”,青霉素 阿莫西林 氨苄西林,变色酸,显色,（分解）,1. K+、Na+的火焰反应,（四）各种盐的反应,焰色鲜黄色 + 醋酸氧铀锌黄,Na+,三、特殊杂质的检查,本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物、有关物质、异构体等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。,药物 检查项目 检查方法 头孢他啶 聚合物 HPLC法 头孢曲松钠 头孢哌酮钠 头孢噻肟钠 头孢呋辛酯 有关物质和异构体 HPLC法 头孢氨苄 有关物质 反相TLC法 青霉素钾（钠） 吸收度 紫外分光光度法,（一）聚合物 示例：以头孢他啶中头孢他啶聚合物的测定。 固定相：葡聚糖凝胶G-10（ 40-120m ） 流动相A：3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液 流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠 对照品溶液：头孢他啶对照品 100g/ml 1）系统适用性试验：N不低于900，拖尾因子0.75-1.5，峰面积的RSD应小于5.0%。 2）测定方法 ：以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%,（二）有关物质和异构体 示例1：头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：ODS 流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38） 1）头孢呋辛酯2-异构体的制备：头孢呋辛酯对照品+流动相 头孢呋辛酯2-异构体。 2）系统适用性试验：各异构体之间的R1.5，以头孢呋辛酯A异构体计算n1500。,3）异构体： 相对保留时间 1-被测物 2-标准物 异构体 相对保留时间 判断 B异构体 0.85 供试液谱图中A异构体的峰面积 A异构体 1.0 与A、B异构体峰面积和之比应为0.480.55。,异构体A,异构体B,头孢呋辛,示例2：头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法 固定相：活化后的硅胶G板置5%（V/V）正十四烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干 展开剂:0.1M枸橼酸-0.2M磷酸氢二钠-丙酮（120：80：3） 供试液：本品 50mg/ml 对照液（1）:本品 0.5 mg/ml 对照液（2）:-苯甘氨酸 0.5 mg/ml 对照液（3）:7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸 0.5 mg/ml 结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（2）（3）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑 点，与对照液（1）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。,（三）吸收度： ChP中常用来控制本类抗生素的杂质含量。 示例：青霉素钠（钾）的吸收度检查： 供 试 液：1.80mg/ml， 结果判断：A280不得大于0.10（控制杂质量）； A264应在0.80-0.88（检查药物量）。,本类药物多采用理化测定方法进行含量测定，Ch.P收载的主要方法有： HPLC法、电位配位滴定法、可见 紫外分光光度法、碘量法等。 2005年版Ch.P中收载的抗生素品种共有284个，其中使用了HPLC法的品种有205个，约占70%。用于检测的项目有：鉴别、有关物质检查、组分测定、含量均匀度和含量测定。,四、含量测定-仪器分析法,（一）高效液相色谱法 原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。 优化色谱分析条件 （1）Column -CN ODS C18 C8 -Ben （2）mobile phase/flow rate （3）column temperature （4）detection wavelength （5）workstation sample preparation,实验注意事项 （1）色谱峰要达到较好的分离基线分离(base separation) （2）需要标准品对照，用外标法定量 （3）可同时测定多个组分的含量 （4）需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰,Selectivity Linearity-Calibration curve Precision and accuracy Recovery Stability,快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）,特点,HPLC法的定量方法和特点,示例1 ：头孢克洛HPLC测定法 固定相：十八烷基硅烷键合硅胶； 流动相：以KH2PO4溶液（取KH2PO4 6.8g，加水溶解并稀释成1000ml，用磷酸调节pH值至3.4）-乙腈（92：8）为流动相； 流速：1ml/min； 检测波长：254nm。 系统适用性试验：头孢克洛峰与头孢克洛-3-异构体的分离度应大于1.5。理论塔板数按头孢克洛峰计算应不低于1500。计算按外标法以峰面积计算。,示例2： 阿莫西林克拉维酸钾片 固定相：十八烷基硅烷键合硅胶； 流动相：磷酸盐缓冲液（取NaH2PO4 7.8g，加水溶解并稀释成900ml，用磷酸或10mol/L氢氧化钠调节pH值至4.40.1，加水稀释至1000ml）-甲醇（95：5）为流动相； 流速：0.7ml/min； 检测波长：220nm。 系统适用性试验：阿莫西林峰和克拉维酸峰的分离度应大于3.5。按外标法以峰面积分别计算供试品中阿莫西林和克拉维酸的含量。,（二）生物样本中-内酰胺类抗生素的分析,血浆 尿样 唾液 胆汁,生物样本,色谱柱：Hypersil ODS C18 (200 mm4.6 mm, I.D. 5m) 样品制备：取血浆200L，加入内标5L，再加入HCLO4，涡旋提取,Internal standard IS,生物样品中-内酰胺类抗生素的分析有色谱法、微生物法、放射免疫法等，其中HPLC法因其专属、灵敏、检测手段多。 色谱条件：色谱柱YWG C18； 流动相：0.033mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）-甲醇（85：15） 流速：1.0ml/min 紫外检测波长：229nm，进样量20l。 血浆样品处理：取血浆置离心管中，加入内标（替硝唑溶液），再加入0.63mol/LHClO4溶液，混旋40s，离心，取上清液进样。,色谱分离结果 在上述色谱条件下测得的人血浆中阿莫西林色谱图见下图（A、B），血浆中阿莫西林浓度在0.2g/ml-20.0g/ml范围内，被测物浓度与响应值之间呈良好的线性关系。 近年液-质联用技术的发展，已有应用高效液相色谱-质谱（LC-MS）方法测定动物组织、血浆中阿莫西林等含量的报道。 血浆中阿莫西林的HPLC图谱与血药浓度-时间曲线见下页。,IS,Blank Plasma,（二）碘量法 1、原理：利用青霉素或头孢菌素不消耗碘，而其降解产物消耗碘的性质，采用剩余碘量法测定，并以标准对照法计算含量。反应分为两步进行：,青霉素,青霉噻唑二钠,2、讨论 （1）CEP族药物与PC族一样，也按两步进行。 （2）反应第一步的水解反应按化学计算量完全反应的。 （3）反应第二步易受温度、pH值、反应时间等因素影响。 （4）为了消除因条件控制差异而导致的实验误差，通常采用相应的标准品作平行对照实验。 （5）PC族的降解产物等杂质也会消耗碘而影响测定结果，可以用未经水解的供试品溶液作空白实验，从而校正其影响。,3测定方法： 精密称取本品适量加水溶解后，置碘瓶加NaOH溶液，放置，再加1mol/L盐酸溶液1ml与醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，摇匀，20-25暗处放置20min，用Na2S2O3滴定液（0.01mol/L）滴定，近终点加淀粉指示剂，继续滴定，至蓝色消失。,式中S0、R0分别、为滴定供试品空白液和对照品空白液消耗的硫代硫酸钠（0.01mol/L）D的体积（ml）； S、R分别为滴定供试品和对照品消耗的硫代硫酸钠溶液（0.01mol/L）的体积（ml）； C为对照品浓度（g/ml）； U、U0分别为对照品的效价（IU/mg）和样品的标示量： W、D分别为供试品取样量（g）和稀释倍数。,（三）电位配位滴定法 青霉素分子不与汞盐反应，而其碱性水解产物如青霉噻唑酸在一定条件下能与二价过渡金属离子如铜离子、汞离子形成稳定配位化合物，其可能结构为：,（1）,（2）,（3）,适用范围：普鲁卡因青霉素、苯唑西林钠、青霉素钠、青霉素钾、青霉素V钾等的含量测定。 讨论： 1水解必须完全。 2本法空白实验也要称取供试品，但不经氢氧化钠水解，空白实验的目的也是为了消除供试品中可能存在的降解产物的干扰； 3与碘量法比较，汞量法测定青霉素的主要优点是不需要青霉素标准品作对照，汞盐滴定液用EDTA标定即可。,第三节 氨基糖苷类抗生素 （aminoglycosides antibiotics）,【药理作用】 氨基糖苷类抗生素可起到杀菌作用，属静止期杀菌药。 其杀菌作用具有如下特点： 1.杀菌作用呈浓度依赖性。 2.仅对需氧菌有效，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌作用强。 3.具有明显的抗生素后效应。 4.具有初次接触效应。 5.在碱性环境中抗菌活性增强。,一、共性,1.抗菌谱相似 主要抗G-杆菌，某些对铜绿假单胞菌、结核杆菌有效 2.抗菌机制相似 杀菌药 多环节阻碍细菌蛋白质合成 始动复合物形成 肽链延伸 肽链终止 通过离子吸附作用， 增加膜通透性,氨基苷类,氨基苷类,氨基苷类,四环素类,大环内酯类,氯霉素类,林可霉素类,抑制细菌蛋白质合成,3. 理化性质相似 呈碱性（极性大），其盐易溶于水（脂溶性差），性质稳定。 4. 体内过程相似 口服难吸收，可作胃肠消毒; 肌肉或静脉注射用于全身感染； 蛋白结合率低，主要分布于细胞外液（胸、腹腔液及心包液浓度较高） 原形经肾排泄（但肾功损害者,多次口服仍可中毒）,化学结构都是以碱性环已多元醇为苷元，与氨基缩合而成的苷，故称为氨基糖苷类抗生素（aminoglycosides antibiotics）。 这类抗生素主要有：链霉素、庆大霉素、新霉素及巴龙霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等，它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。,一、化学结构与性质,天然类 链霉素(streptomycin) 庆大霉素(gentamicin) 卡那霉素(kanamycin) 妥布霉素(tobramycin) 西索米星(sisomicin) 新霉素(neomycin) 小诺米星(micronomicin) 大观霉素(spectinomycin) 半合成类 阿米卡星 (amikacin) 奈替米星(netilmicin),1.链霉素（strepotomycin即链霉素A）的结构为一分子链霉胍和一分子链霉双糖结合而成的碱性苷。结构如下：,（一）化学结构,临床应用 鼠疫、兔热病 布氏杆菌病 感染性心内膜炎 抗结核 不良反应 第八对脑神经损害 过敏性休克 神经肌肉阻滞 口周、面部、四肢麻木,D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖,巴龙胺,巴龙二糖胺,2.庆大霉素（gentamycin）是由绛红糖胺、脱氧链霉胺和加洛糖胺缩合而成的苷。它是庆大霉素C复合物，尚有少量次要成分（如庆大霉素A1、A2、A3、A4、B、B1、X）。主要成分C1、C2、C1a及C2a的结构如下：,庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,抗菌作用 G+：金葡菌、白喉杆菌、炭疽杆菌 G- ： 球菌、杆菌、铜绿假单胞菌,临床应用 可与羧苄西林合用 严重G- 杆菌感染 铜绿假单胞菌感染如心内膜炎 原因未明的G-菌混合感染 口服用于肠道感染或术前准备,不良反应 肾毒性 前庭功能损害,多与硫酸成盐,碱性,（一）,（二）性质,链霉素 pH57.5 庆大霉素 pH212,二、,鉴别,羟基胺结构,N-甲基葡萄糖胺反应,（三）,（Elson-Morgan反应）,链霉糖特有反应,麦芽酚反应,（四）,H+,分子重排,链霉糖,链霉素,-,OH,麦芽酚,紫红色,+,3,Fe,8-羟基喹啉,- 萘酚,链霉胍特有反应,坂口反应,（五）,（六）硫酸盐反应 （七）色谱法 1薄层色谱法：ChP、USP（25）、BP（2000）采用该法对硫酸庆大霉素、硫酸奈替米星、硫酸巴龙霉素、链霉素等进行鉴别。多以硅胶为薄层板，氯仿-甲醇-浓氨水为展开剂，茚三酮或碘蒸气为显色剂。,（八） UV法,庆大霉素无UV吸收,（八） HPLC法 BP（2000）采用HPLC法鉴别庆大霉素，根据组分检查项下色谱图，比较供试液和标准品溶液的色谱图，庆大霉素C1、C2、C1a、C2a四组分的保留时间应一致。,三、特殊杂质检查及组分分析,（一）链霉素中链霉素B的检查 薄层板：硅胶G薄层。 展开剂：甲苯-冰醋酸-甲醇（50：25：25） 方法：以D-甘露醇为对照品进行标准对照法比较斑点的颜色。 （二）奈替米星中有关物质检查 各国药典已对该类部分抗生素采用色谱法（HPLC或TLC法）进行有关物质的检查。如硫酸奈替米星中有关物质检查采用标准品对照法，比较斑点颜色的深浅。,（三）庆大霉素C组分测定 中、英、美、日等国药典均规定控制庆大霉素中C1、C2、C1a、C2a各组分的相对百分含量。均采用HPLC法测定庆大霉素C各组分的含量。 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-冰醋酸-甲醇（25：5：70）配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相；检测波长为330nm；理论塔板数按C2组分计算应不低于2000。C2a和C2峰的分离度应符合要求。重复进样，其相对标准差（RSD）应小于2.0%。以内标-峰面积归一化法计算各组分的相对含量 。图谱,讨论： （1）柱效：以C2峰计算，理论塔板数不得低于2000。（2）流动相：流动相极性应适当控制（适当调节甲醇比例）：极性过强，出峰快，分离不佳；流动相极性过弱，出峰太慢。 （3）衍生化试剂与衍生物的稳定性； （4）离子对试剂浓度影响； (四)硫酸盐测定 本类抗生素临床应用的主要为硫酸盐，各国药典规定EDTA络合滴定法测定硫酸盐，作为组分分析。,四、含量测定 本类抗生素的效价测定目前各国药典主要采用微生物检定法。近年来国内外又有各种免疫法、色谱法等定量分析方法。 由于本类抗生素多数无紫外吸收，不能直接用紫外或荧光检测器，需进行柱前或柱后衍生化，采用的衍生化试剂有邻苯二醛、1、2-萘醌-4-磺酸、2、4、6-三硝基磺酸、1-氟-2、4-二硝基苯、9-芴甲基氯甲酸酯、茚三酮等。,示例 猪组织中庆大霉素和新霉素的HPLC法 色谱条件：Hypersil BDS C18分析柱；乙腈-水（85：15）为流动相；流速1.0ml/min；荧光检测器，ex=260nm，em=315nm。 样品处理：取样品（肝、肾、肌肉）适量，加磷酸盐缓冲液（Ph=7.4），室温孵育1h，然后加 三氯乙酸，匀浆30s，于4下离心（3500r/min）15min，将上清液移置另一试管中，加离子对试剂（已烷磺酸钠溶液）。再经固相柱提取纯化，用乙腈-0.02mol/L已烷磺酸钠（55：45）洗脱。洗脱液与9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）混合，进行衍生化反应，15min后加甘氨酸中止反应，取适量进样测定。图谱,结果与讨论： 用FMOC-Cl衍生化可获得强荧光的衍生物，在pH8.0的条件下反应，衍生物可稳定在12h。见图11-7。 测得庆大霉素各组分和新霉素的提取回收率在75%-86%之间；日内、日间RSD小于10%；检测限分别为0.05g/g和0.1g/g（S/N=5）；定量限为检测限2倍。在0.1g/g-1.0g/g范围内，被测组分浓度与响应值之间呈良好的线性关系，r0.999。,第四节 四环素类抗生素 （tetracyclines antibiotics ）,这类抗生素有四个环构成，故统称为四环素类抗生素。 一、化学结构与性质 结构中各取代基R、R、R及R的不同构成各种四环素类抗生素。常见结构如下：,2性质 （1）酸碱性与溶解度：显弱碱性和显弱酸性，是两性化合物。 （2）旋光性：具有不对称碳原子，因此有旋光性； （3）紫外吸收和荧光性质： （4）与金属离子形成配位化合物： （5）稳定性：四环素类抗生素对各种氧化剂（包括空气中氧在内）、酸、碱都是不稳定的。,本类抗生素具有氢化骈四苯的共同基本母核，均是化学两性物质，可与酸、碱成盐，但在碱性水溶液易降解，在酸性水溶液稳定，一般以盐酸盐应用于临床。,A差向异构化性质：四环素类抗生素在弱酸性（pH2.0-6.0）溶液中会发生差向异构化。,差向四环素,四环素,B降解性质： 酸性降解，在酸性条件下（pH2）生成脱水四环素（anhydrotetracycline，ATC）。反应式如下：,四环素,脱水四环素,碱性降解：在碱性溶液中生成无活性的异构体。反应如下：,异四环素类抗生素,四环素类抗生素,二、鉴别试验,1浓硫酸反应； 2三氯化铁反应； 3薄层色谱法： 应用示例 盐酸土霉素的鉴别 薄层板的制备：硅藻土EDTA-2Na溶液-甘油（95：5）为粘合剂；展开剂：取4%EDTA-2Na溶液（pH7.0）5ml，加至醋酸乙酯-氯仿-丙酮（2：2：1）200ml中为展开剂，展开后，氨薰后，置紫外光灯下（365nm）下检视。,4HPLC法：ChP和USP（25）采用HPLC法鉴别盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸多西霉素、盐酸金霉素等。在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。,三、特殊杂质检查,1有关物质：四环素类中的有关物质主要是异构体杂质、降解杂质（ETC、ATC、EATC）等。 2杂质吸收度：如ChP规定的盐酸四环素的杂质吸收度测定方法如下： 取本品加0.8%氢氧化钠溶液制成每1ml中含10mg的溶液，照分光光度法，置4cm的吸收池中，在530nm的波长下测定，自加0.8%氢氧化钠溶液起5min，其吸收度不得过0.12（供注射用）。,四、含量测定 四环素类抗生素的含量测定，目前各国药典多采用HPLC法