血红蛋白的分离和提取教程PPT课件.ppt

课题3 血红蛋白的提取和分离,1,.,一、基础知识： （一）蛋白质提取和分离原理 （二）蛋白质提取和分离的方法 1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法 （三）缓冲液的作用,2,二、实验操作实验步骤,3,二、实验操作实验步骤,4,蛋白质提取与分离的依据 蛋白质的物理化学性质差异： 1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力,5,1.凝胶色谱法,（1）原理： （2）材料：凝胶,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道.,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法,概念：,6,7,8,2凝胶电泳法：,1）原理：,不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,2）影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,思考：蛋白质为什么带有电荷？,在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷,9,2凝胶电泳法：,1）原理：,不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,2）影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,思考：蛋白质为什么带有电荷？,10,3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,11,影响蛋白质分子运动速度的因素,由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,（4）缓冲溶液洗脱剂 作用： 配制：,调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。,思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？,13,血液组成成分,阅读思考： 血液由_和_两部分组成。 血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_。 该化合物是由 _和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,14,1.洗 涤 红 细 胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？,血液 100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,15,2.释放血红蛋白,阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析： 蒸馏水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,16,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞 混合液,烧杯,有机溶剂 血红蛋白,17,4.透析血红蛋白,透析的目的是什么？,去除血红蛋白中的小分子杂质,18,纯化凝胶色谱操作,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3.样品的加入和洗脱,19,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液 “G”表示什么？75代表什么？,20,注意： 色谱柱内不能有气泡； 装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝 胶使凝胶装填紧密,21,3.样品的加入和洗脱,1.调液面,2.加样 3.再调液面,4.洗脱,5.收集,22,注意事项,1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2.色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断