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7.02 2001年秋季 Ver1.02版 7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Study Guide Key 1 蛋白质生物化学考试题答案 蛋白质生物化学考试题答案 1 1 下面七种氨基酸，在每个氨基酸后面的横线上填上它对应的性质特征的字母。 氨基酸 性质 甘氨酸（Gly） h，b a）pH7 时带电荷 苏氨酸（Thr） g b）非极性/疏水性 脯氨酸（Pro） c，d（b） c）亚氨酸 苯丙氨酸（Phe） b，d，e d）具有环状结构 半胱氨酸（Cys） f， （b，g） e）在 280nm处有吸收 谷氨酸（Glu） a， （g） f）有硫原子 赖氨酸（Lys） a， （g） g）极性/亲水性 h）具有最简单的侧链 括号内的答案是正确但不是必需的。 括号内的答案是正确但不是必需的。 2 2 某天生化学家小 Johnny 用 7.02 节的方法纯化 半乳糖苷酶，他遇到了下面一些问题，请解释为 什么小 Johnny 的实验不能顺利进行，并帮他想想解决的办法。 a） a） 在 DEAE 柱子的穿过峰中有 半乳糖苷酶。 这个问题的正确答案不止一个，包括：上样量太大，缓冲液 pH 值不合适，在蛋白样品或柱床中的 缓冲液中含盐量太高（硫铵沉淀后的样品没有脱盐） 。 这个问题的正确答案不止一个，包括：上样量太大，缓冲液 pH 值不合适，在蛋白样品或柱床中的 缓冲液中含盐量太高（硫铵沉淀后的样品没有脱盐） 。 b） b） 聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样时，样品从孔中扩散到电泳缓冲液中。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓 冲液中。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓 冲液中。 c） c） 在一个新发现的蛋白 Namedoesntmatter-ase 的硫铵沉淀后，小 Johnny 重悬沉淀时，他检测 发现没有活性，实验室的博士后用小 Jhonny 的试剂并用和他完全一样的方法重做硫铵沉淀这一步。 这个博士后却得到了有活性的蛋白质，为什么？ 这是一个怪题，蛋白质可能还留在上清中而没有在下面的沉淀里，所以上清中才有酶的活性，小约 翰并没有检测上清的酶活性，所以他发现没有活性！ 这是一个怪题，蛋白质可能还留在上清中而没有在下面的沉淀里，所以上清中才有酶的活性，小约 翰并没有检测上清的酶活性，所以他发现没有活性！ 3 3 画出多肽 aspvalglugly 的结构并圈出肽键 。 。 （参看附页） （参看附页） 7.02 2001年秋季 Ver1.02版 7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Study Guide Key 2 4 4 判断下面的句子的对错，并用 T 表示正确，F 表示错误。 T T a） a） 当酶的催化速度是最大速度的一半时，KmS 。 F F b b）在凝胶过滤中，小分子物质最先流出来。 F F c) c) 胶原蛋白的重复单元是 alaprohyp。 T T d） d）抗体的重链包括一个可变区和 3 个恒定区。 T T e) e) 镰刀型贫血症是由血红蛋白 链上第 6 位的Glu被Val代替引起。 5 a）5 a）画一个包括两个 链（每个有 个氨基酸（用 R1，R2，R3，R8 表示 这 8 个氨基酸 的侧链） ）的反平行式 折叠片层结构。 （参看附页） （参看附页） b） b）圈出你画的结构图中所有的氢键结构。 （参看附页） （参看附页） c） c）片层的一侧有较强的疏水性，给出具有这种性质的三种氨基酸的全名： 丙氨酸 ， 缬氨酸 ， 亮氨酸 。 d）d） 在你画的结构图中圈出保证片层一侧具有强疏水性的必需的疏水性 R 基团。 （参看附页） （参看附页） 6 6 简要说明 SDS 和 巯基乙醇在蛋白质变性中的作用。 SDS 是兼性分子，由一个长的碳链和一个极性的、带电荷磺酸基团组成，它通过和蛋白质分子中 的氨基酸发生疏水相互作用而使蛋白质变性，它还把蛋白质包裹起来使蛋白质表面带负电荷。 SDS 是兼性分子，由一个长的碳链和一个极性的、带电荷磺酸基团组成，它通过和蛋白质分子中 的氨基酸发生疏水相互作用而使蛋白质变性，它还把蛋白质包裹起来使蛋白质表面带负电荷。 巯基 乙醇是强还原剂，可以断裂的二硫键(分子内和分子间)。 巯基 乙醇是强还原剂，可以断裂的二硫键(分子内和分子间)。 7.02 2001年秋季 Ver1.02版 7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Study Guide Key 3 蛋白质生物化学实验测验试题的参考答案 蛋白质生物化学实验测验试题的参考答案 问题1（共 20 分） 问题1（共 20 分） 说明下列试剂在PBC实验中的用途， （完整的答案需要简明扼要表述清楚什么实验中使用，使用的目 的和方法是什么） （每个 4 分） 。 a） a） 溶菌酶 一种酶（不是洗涤剂也不是化学制品） ， 一种酶（不是洗涤剂也不是化学制品） ， 在 PBC 第一天的实验中中用来裂解细菌细胞， 在 PBC 第一天的实验中中用来裂解细菌细胞， 断裂细胞壁中的交连（细胞膜扣 0.5 分） 。 断裂细胞壁中的交连（细胞膜扣 0.5 分） 。 b） b） APTG 在纯化 半乳糖苷酶的实验中亲和柱层析时使用， 在纯化 半乳糖苷酶的实验中亲和柱层析时使用， 是 半乳糖苷酶的底物类似物；半乳糖苷酶能和它特异性地结合， 是 半乳糖苷酶的底物类似物；半乳糖苷酶能和它特异性地结合， 不被降解。 不被降解。 c） c） 硝酸纤维素膜 在蛋白质印迹（Western blotting）实验中使用， 在蛋白质印迹（Western blotting）实验中使用， 和蛋白质非特异性结合， 和蛋白质非特异性结合， 电流把蛋白质从凝胶中转移到膜上。 电流把蛋白质从凝胶中转移到膜上。 d） d） 碳酸钠（Na2CO3） 终止 半乳糖苷酶催化的反应， 终止 半乳糖苷酶催化的反应， 强碱，提高 pH 值，通过使 半乳糖苷酶去折叠/变性终止反应， 强碱，提高 pH 值，通过使 半乳糖苷酶去折叠/变性终止反应， 并且帮助 ONP 显色。 并且帮助 ONP 显色。 e） e） DTT （弱）还原剂（不是去污剂） ， （弱）还原剂（不是去污剂） ， 用于缓冲液/溶液中（柱层析用的缓冲液） ， 用于缓冲液/溶液中（柱层析用的缓冲液） ， 断裂非天然二硫键，促进蛋白质折叠，模拟细胞内环境（弱还原性） 。 断裂非天然二硫键，促进蛋白质折叠，模拟细胞内环境（弱还原性） 。 问题2 （共 19 分） 问题2 （共 19 分） a）a） （8 分） 画出 pH7.0 时下面这个四肽的结构图： 7.02 2001年秋季 Ver1.02版 （N 端）CysTyrLysGlu（C 端） （参看附页） （参看附页） 侧链（6 分）1.5 分/AA；缺失或增加一个碳源子或 R 基团错误各扣 0.5 分，肽键（2 分） 肽键必须在一个平面上） （侧链交替） 。 侧链（6 分）1.5 分/AA；缺失或增加一个碳源子或 R 基团错误各扣 0.5 分，肽键（2 分） 肽键必须在一个平面上） （侧链交替） 。 b）b） （1 分）这个四肽的四个氨基酸中哪个能形成二硫键？ 半胱氨酸 半胱氨酸 c）c） （6 分） 螺旋的稳定是由于 氢供体 和 氢受体 之间的氢键的作用，在你在 a）中绘制的结构 图中用“D” （D）标明氢原子供体，用“A” （ ）标明氢原子受体。 （参看附页） （参看附页） 侧链氢原子供体 分 侧链氢原子供体 分 主链氢原子供体 分 主链氢原子供体 分 半胱氨酸被标扣 0.5 分 半胱氨酸被标扣 0.5 分 d）d） （4 分）下面是 螺旋横截面图解，氨基酸 的侧链标为 ，在你所知道的 螺旋结构的基础 上，标出氨基酸 的侧链位置， （假想你通过螺旋的纵轴往下看， 末端在靠近你的这一端） 。 顺时针： 1 分 顺时针： 1 分 正确的顺序：3 分 正确的顺序：3 分 假如氨基酸的位置碰巧正确的话，每个 0.5 分 假如氨基酸的位置碰巧正确的话，每个 0.5 分 问题3（共 14 分） 问题3（共 14 分） a）a） （8 分）在下列水平上简单定义蛋白质结构，并从实验或讲义中各选择一个例子： 二级结构 定义（3 分）不考虑侧链的主链的构象， 定义（3 分）不考虑侧链的主链的构象， 例子（1 分） 螺旋（ 片层或转角） 。 例子（1 分） 螺旋（ 片层或转角） 。 7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Study Guide Key 4 7.02 2001年秋季 Ver1.02版 7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Study Guide Key 5 四级结构 定义（3 分）亚基的空间排列（亚基一个多肽链） ， 定义（3 分）亚基的空间排列（亚基一个多肽链） ， 亚基之间以非共价键相互作用的方式相连，有时它们之间存在二硫键。 亚基之间以非共价键相互作用的方式相连，有时它们之间存在二硫键。 例子（1 分）血红蛋白的 个亚基等等。 例子（1 分）血红蛋白的 个亚基等等。 b）b） （6 分）给下列分子中主要的三级结构单元命名： 胶原蛋白分子：超螺旋，无规卷曲（3 个 螺环互相包装在一起） 超螺旋，无规卷曲（3 个 螺环互相包装在一起） 免疫球蛋白（如 IgG） ：扁平的 桶或 扁平的 桶 免疫球蛋白（如 IgG） ：扁平的 桶或 扁平的 桶 绿色荧光蛋白（GFP） 桶 绿色荧光蛋白（GFP） 桶 问题4（共 12 分） 问题4（共 12 分） 在 7.02 结束后，你决定在 Jean Tics 博士的实验室做一个 UROP，Jean Tics 博士想知道你对 7.02 中蛋白质纯化掌握的情况，所以她要你用实验室比较成熟的方法纯化 PHD 异构酶。 从细胞初提液（CL）开始，你采用下面的方法（并对得到的样品进行检测） ： 1 硫铵沉淀（得到： “ASP” ） 2 用 PD10 层析柱脱盐（得到样品“DEAEload” ） 3 DEAE 柱层析（合并 DEAE 分部流出液得到样品“DEAE total” ） 4 PD10 脱盐后直接过亲和层析（得到样品“AF after PD10” ） 然后你检测每个样品的 PHD 异构酶的活性，得到下面的结果： 样品 体积 （ml） 蛋白浓度 （mg/ml） 蛋白总量 （mg） 酶活力单 位（U） 比活 提纯 倍数 CL 25 4 100 200000 2000 1 ASp 4 10 40 120000 3000 1.5 DEAEload 2 17.5 35 105000 3000 1.5 DEAE total 2 11 22 68200 3100 1.55 AF after PD10 1 3 3 60000 20000 10 a) a) (5 分)在上面的表格中填写比活力和纯化倍数（在需要的地方注明单位） 。 比活：单位U/mg (没有单位扣 0.5 分)；每个比活 0.5 分， 比活：单位U/mg (没有单位扣 0.5 分)；每个比活 0.5 分， 提化倍数（没有单位）每个 0.5 分 提化倍数（没有单位）每个 0.5 分 7.02 2001年秋季 Ver1.02版 7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Study Guide Key 6 b) b) （3 分）在这个纯化流程中哪一步纯化效率最高？为什么？ 亲和层析（或第四步）的纯化效率最高（1 分） 。因为这一步有最高的提纯倍数（2 分） 。亲和层析（或第四步）的纯化效率最高（1 分） 。因为这一步有最高的提纯倍数（2 分） 。 c) c) （4 分）如果 Tics 博士要你改进这个纯化工艺，你会去除哪一步？为什么？ 你可以通过去掉 DEAE 柱层析（第 3 步）改进纯化工艺（1 分） 。因为这一步没有提高比活或提纯倍 数，反而损失了大量蛋白（3 分） 。 你可以通过去掉 DEAE 柱层析（第 3 步）改进纯化工艺（1 分） 。因为这一步没有提高比活或提纯倍 数，反而损失了大量蛋白（3 分） 。 考虑到你在蛋白纯化方面掌握的已经很好， Tics 博士又给你了新得难题： 纯化并鉴定酶 “NoPBCase” 的野生型和突变体。准备好细胞初提液（CL）后，你决定先通过硫铵沉淀纯化“NoPBCase” 。 问题#5（共 25 分） 问题#5（共 25 分） 相信你在蛋白质纯化方面是一个行家，Dr.Tics 提出了一个挑战：纯化并辨别 “NOPBCase” 酶的 野生型与突变型。在你得到粗提液后（CL） ，你决定用硫酸铵沉淀“NOPBCase” 。 a）a） （4 分）简单描述硫酸铵怎么沉淀蛋白质。 在溶液中，蛋白质被溶剂包裹（水和蛋白质表面电荷之间存在氢键和离子相互作用力） ，增加溶液 中的盐离子浓度会干扰/破坏这种（水和硫酸铵的作用取代了和蛋白质的作用） （2 分） 。这样蛋白质分 子间就会发生相互作用，逐渐聚集并从溶液中沉淀出来（2 分） 。 在溶液中，蛋白质被溶剂包裹（水和蛋白质表面电荷之间存在氢键和离子相互作用力） ，增加溶液 中的盐离子浓度会干扰/破坏这种（水和硫酸铵的作用取代了和蛋白质的作用） （2 分） 。这样蛋白质分 子间就会发生相互作用，逐渐聚集并从溶液中沉淀出来（2 分） 。 如果写成“盐析” （给 1 分） ，对这个过程描述不完整的酌情给分。 如果写成“盐析” （给 1 分） ，对这个过程描述不完整的酌情给分。 和你一起工作的博士后已经对 NoPBCase 做了一些原始的工作，她发现在 40的硫铵40的硫铵中这个酶会完 全沉淀。不幸的是，在计算应该加入多少 AS 时你因为犯了个错误，配成了 60的硫铵溶液！ 60的硫铵溶液！ b)b) (3 分)你估计这个错误会对硫铵沉淀后得到的样品 ASP 的总活力（T.A.）产生什么影响，升高， 降低，还是不变？为什么？（答案 1 分，推理 2 分） （答案 1 分，推理 2 分） 我的答案是：如果在 40的硫铵中 NoPBCase 完全沉淀，那么我们预计在 60的硫铵溶液中不会有 更多的酶沉淀，既然总活力反映的是目的酶的活力，我们预计 ASP 的总活力（T.A.）不会发生变化。 我的答案是：如果在 40的硫铵中 NoPBCase 完全沉淀，那么我们预计在 60的硫铵溶液中不会有 更多的酶沉淀，既然总活力反映的是目的酶的活力，我们预计 ASP 的总活力（T.A.）不会发生变化。 如果有人认为因为变性蛋白质，TA 会降低（假定高盐会降低酶活力） ，也应得到满分。 如果有人认为因为变性蛋白质，TA 会降低（假定高盐会降低酶活力） ，也应得到满分。 c）c） （3 分）这个错误会怎样影响 ASP 的比活（S.A.）比活（S.A.） （升高，降低，还是不变）？并给出理由。 （答 案 1 分，推理 2 分） （答 案 1 分，推理 2 分） 比活总活力/蛋白总量。总活力应该不会因为硫酸铵增加到 60而变化，但是由于硫酸铵增加到 60，预计会有更多的蛋白质从溶液中沉淀出来。因此蛋白量会增多，比活（ “纯度” ）会降低。 比活总活力/蛋白总量。总活力应该不会因为硫酸铵增加到 60而变化，但是由于硫酸铵增加到 60，预计会有更多的蛋白质从溶液中沉淀出来。因此蛋白量会增多，比活（ “纯度” ）会降低。 如果你认为因为酶的变性，总活性降低，在这里你也必须提到蛋白量的增多才能得到满分。 如果你认为因为酶的变性，总活性降低，在这里你也必须提到蛋白量的增多才能得到满分。 7.02 2001年秋季 Ver1.02版 在下一步，你决定采用离子交换层析，由于你几乎不知道关于 NoPBCase 的任何性质，你决定阴离 子交换层析（DEAESephacel）和阳离子交换层析（CM纤维素）都试一试。每种介质各上一半的 AS P，并收集穿过峰（FT） ，然后增大洗脱液离子浓度，使柱子上的蛋白质全部被洗脱下来，并分步收集 记为 15，最后，检测收集的每个样品的活性（NoPBCase 可催化产生有颜色的物质的反应，该产物可 以通过检测在 420nm 下的吸收进行定量） 。 d）d） （7 分）在下面不同的样品对应的吸收图中，如果NoPBCase在缓冲液条件中带正电荷正电荷，标出 NoPBCase的活性应该出现的最高点。简单说明你的理由。 简单说明你的理由。 （每图 1.5 分，推理 4 分） （每图 1.5 分，推理 4 分） DEAE Sephacel 和其他的阴离子交换介质一样，会结合带负电荷的蛋白质，这样，在 DEAE Sephacel 层析中，带正电荷的 NoPBCase 会出现在穿过峰中;CM纤维素是阳离子交换介质，结合带正电荷的蛋白 质，如 NoPBCase，它很可能会在中等的盐浓度梯度被洗脱下来(至于在什么盐浓度条件下被洗脱下来， 这取决于它表面所带的净电荷)， 因洗脱液中的阳离子能竞争性结合介质上的阴离子而把 NoPBCase 替换 下来时，NoPBCase 就被洗脱下来。 DEAE Sephacel 和其他的阴离子交换介质一样，会结合带负电荷的蛋白质，这样，在 DEAE Sephacel 层析中，带正电荷的 NoPBCase 会出现在穿过峰中;CM纤维素是阳离子交换介质，结合带正电荷的蛋白 质，如 NoPBCase，它很可能会在中等的盐浓度梯度被洗脱下来(至于在什么盐浓度条件下被洗脱下来， 这取决于它表面所带的净电荷)， 因洗脱液中的阳离子能竞争性结合介质上的阴离子而把 NoPBCase 替换 下来时，NoPBCase 就被洗脱下来。 如果你混淆了阴阳离子交换剂，但是你的推理比较正确的话将得到 2 分。 如果你混淆了阴阳离子交换剂，但是你的推理比较正确的话将得到 2 分。 最后你决定鉴定 NoPBCase 的大小和结构，你发现在凝胶过滤中 NoPBCase 的分子量可能在 120KDa （因为其在 120KDa 标准蛋白的流出位置处流出） ，接下来你和你的博士后同伴决定用你纯化的样品做蛋 白质印迹实验（Western blots） 。你们都先跑 SDSPAGE 电泳，然后一起用 NoPBCase 抗体做 Western blots，你们的结果如下： 7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Study Guide Key 7 7.02 2001年秋季 Ver1.02版 e）e） （2 分）你和同伴一起分析你们的结果，为什么不相同？ 当准备电泳样品时，你忘记往样品中加入还原剂（巯基乙醇） ，而你的博士后同伴加了 巯 基乙醇，巯基乙醇还原了多聚蛋白之间和内部的二硫键，这样，她的样品被完全还原成单体形式， 然而你的样品没有（任保持三聚体的形式） 。 （如果解释错误但是提到了单体和三聚体将得到 1 分） 当准备电泳样品时，你忘记往样品中加入还原剂（巯基乙醇） ，而你的博士后同伴加了 巯 基乙醇，巯基乙醇还原了多聚蛋白之间和内部的二硫键，这样，她的样品被完全还原成单体形式， 然而你的样品没有（任保持三聚体的形式） 。 （如果解释错误但是提到了单体和三聚体将得到 1 分） f）f） （6 分）根据凝胶过滤和 SDSPAGE 电泳结果，分析推测 NoPBCase 的结构，并解释你的结论。 凝胶过滤测得这个天然蛋白的分子量是 120KDa，加入还原剂后出现了 40KDa 的单体，同时在免疫 印迹中看到三倍的量。这符合寡聚体蛋白的结构模式，因此可以推断这个蛋白是由三个 40KDa 的单体通 过二硫键连在一起的三聚体蛋白。 凝胶过滤测得这个天然蛋白的分子量是 120KDa，加入还原剂后出现了 40KDa 的单体，同时在免疫 印迹中看到三倍的量。这符合寡聚体蛋白的结构模式，因此可以推断这个蛋白是由三个 40KDa 的单体通 过二硫键连在一起的三聚体蛋白。 问题6（共 10 分） 问题6（共 10 分） 最后你得到了一些纯的NoPBCase，准备做酶促动力学，决定用NoPBCase的天然底物的类似物ONPB （NoPBCase催化下面的反应： ONPB ONP显色的物质） 。 你用不同的ONPB底物浓度开展的酶促动力学 实验 （用7.02lab方法） ，（并检测产物ONP在420nm下的吸收） ， 下面是你在第一次实验中用野生型NoPBCase 得到的数据： a）a） （6 分）计算野生型 NoPBCase 的 Km 和 Vmax，详细写出推翻过程，且不要忘记单位！ （每个正确 的计算 2 分，正确的单位 1 分， ） （每个正确 的计算 2 分，正确的单位 1 分， ） 7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Study Guide Key 8 7.02 2001年秋季 Ver1.02版 7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Study Guide Key 9 在Lineweaver-Burk作图法中，X轴上的截距是1/Km，Y轴上的截距是1/Vmax。因此： 在L