急性镉中毒的肝脏损伤机制及金属硫蛋白的保护作用

1 / 13 急性镉中毒的肝脏损伤机制及金属硫蛋白的保护作用 Mechanism of Liver Injury in Cadmium Toxication and Protection of Metallothionein 金慧英 胡惠民 周雍 李法卿 谭维国 李素芹 陈华标 Jin Huiying,Hu Huimin,Zhou Young,et al 摘要 目的 研究脂质过氧化和自由基在急性镉中毒性肝脏损伤中的作用及金属硫蛋白（ MT）的保护作用。方法 测定镉染毒后不同时间大鼠肝脏的 MT 和脂质过氧化产物 丙二醛（ MDA）的含量及抗氧化酶的活力，观察肝细胞超微结构的损伤，进行自由基 (H2O2)的定位。结果 大鼠急性染镉后 MDA高于对照组 (P 0.05);抗氧化酶活力在 3小时显著受抑 (P 0.05), 6小时明显恢复； MT 在 3 小时即有增加， 6小时达正常组的 6.7倍 ;肝细胞膜上 H2O2的阳性沉积物 3小时最严重， 24 小时已消失，但此时细胞损伤最严重， 48 小时肝细胞再生、修复。结论 镉可引起肝脏脂质过氧化及自由基的大量产生，抑制抗氧化酶的活力，造成细胞的严重损伤。MT对肝脏抗氧化酶活力的恢复、脂质过氧化的减轻、自由基的清除及损伤的肝细胞的保护可能有重要作用。 关键词 急性镉中毒 脂质过氧化 金属硫蛋白 大鼠肝脏 Mechanism of liver injury in cadmium toxication and 2 / 13 protection of metallothionein Jin Huiying*,Hu Huimin,Zhou Young,et al.*Institute of Military Medicine of Nanjing Command,Nanjin 210002 Abstract To study the mechanism of liver injury by lipid peroxidation and free radical and the protection of metallothionein(MT) in acute cadmium toxication,the contents of MT and malonyl dialdehyde (MDA),metabolic product of lipid peroxidation,and activities of antioxidases in cadmium-exposed rat liver at different time were determined.Meanwhile,the injury of hepatocytes and free radical (H2O2) localization were also studied by electron microscopy.The results showed that MDA content was increased(P 0.05) after acute cadmium-exposure,the activities of 3 / 13 antioxidases significantly decreased(P 0.05) at 3 h and progressively recovered at 6 h.MT was increased at 3 h,reaching 6.7 times as much as that of control at 6 h.H2O2 positive precipitation on outer plasma membrane of hepatocytes was obviously increased at 3 h,and disappeared at 24 h but hepatocyte injury was very severe at this time,at 48 h hepatocyte recovered through regeneration.It is concluded that acute cadmium toxication would cause lipid peroxidation and excessive free radical production,and inhibit the activities of antioxidases leading to severe injury of hepatocytes.MT may have important role in the recovery of antioxidase activities 4 / 13 alleviation of lipid peroxidation and elimination of free radicals, and protection from injury of hepatocytes. Key words Acute cadmium toxication Lipid peroxidation Metallothionein Rat liver 金属硫蛋白 (Metallothionein,MT)是富含巯基的小分子蛋白质，对金属具有高亲合力。 MT与急性镉中毒引起的脂质过氧化作用的一系列变化的关系尚未明确定论。为此，我们着重 探讨脂质过氧化及自由基损伤、抗氧化防御系统和MT在急性镉中毒时的变化规律及其相互关系，为镉中毒的防治以及抗氧化剂 MT的临床应用奠定基础。 材料与方法 一、材料 1.动物：健康雄性 SD 大鼠，体重 240 300 g，第二军医大学实验动物中心提供。 2.试剂和仪器：胆酸钠 (E.M.K 公司，德国 )，二硫二硝基苯甲酸 (DTNB)及还原型谷胱甘肽 (GSH)(Fluka 公司，德国 )，丙二醛 (MDA)(Aldrich 公司，美国 )，其余试剂均为国产分析纯。 Hitachi 800 透射电镜、 Hitachi S8300 原子吸收光谱仪、 Hitachi himic CR21 低温高速离心机 (日立公司 )， Biorad 3550 酶标仪（美国）， 721分光光度仪 (上海第5 / 13 三分析仪器厂 )。 二、方法 1.大鼠镉中毒模型的建立和分组：健康 SD大鼠 56只随机分为 7 组，每组 8 只： 1 组为正常对照组， 6 组为实验组。实验组按每公斤体重 2.5 mg镉计尾静脉注射 CdCl2，对照组注射生理盐水。于注射后 0.5、 1、 3、 6、 24、 48 小时取肝组织 , 加 0.25%蔗糖溶液 ,匀浆， 4 、 15 000 g 离心 30分钟，取上清测定超氧化物岐化 酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、过氧化氢酶 (CAT)活力，取匀浆测定 MDA 含量。取 1 g肝组织测定 MT含量。 2.各项指标的测定方法： (1)镉浓度：原子吸收光谱法。 (2)MDA： TBA 法 1。 (3)SOD 活力：邻苯三酚自氧化反应终止法 2。 (4)GSH-Px活力：催化 GSH氧化法 3。 (5)CAT活力：比色法 4。 (6)MT含量： ELISA法 5。 (7)蛋白含量：染料法。 (8)细胞损伤及 H2O2的电镜细胞化学定位 (CeCl3法 ):大鼠肝门静脉灌注 1 mmol/L 的 CeCl3 平衡液，继而灌注戊二醛固定液，灌流压力保持在 75 mmHg。取肝组织切成1 mm3 小块，常规固定、脱水包埋、切片、铅 -铀染色，电镜观察。 3.统计学方法：结果采用 t 检验比较组间的差异。 结 果 6 / 13 1.CdCl2 急性染毒后大鼠肝脏各项指标的变化见表 1。 2.电镜肝细胞损伤及 H2O2 的细胞化学定位（图 1 8）依Trump(1981)的观点，将正常细胞从损伤到坏死的演变分为形态正常（第 1 阶段）、可逆性改变（ 2 4 阶段）和不可逆改变（ 5 7阶段）期。计数每个网孔内各期细胞数并观察H2O2- CeCl3阳性沉淀 ,结果见表 2。 表 1 急性镉染毒后不同时间大鼠肝脏各项指标的变化(s,n=8) Table 1 Changes of the levels of Cd,MDA,SOD,GSH-Px,CAT and MT in liver of rat at different time after acute Cd administration(s,n=8) (g/mg prot.) MDA (nmol/mg prot.) SOD (U/mg prot.) GSH-Px (U/g prot.) CAT (K/mg prot.) MT (g/g liver) 染镉组 Cd exposed group 0.5 h 6.7121.387* 31.164.05* 164.1726.05* 38.3111.92* 127.4220.73* 17.562.30 1.0 h 6.7022.869* 38.7010.47* 168.7122.23* 42.1819.87* 192.3238.06* 21.333.06 3.0 h 5.2601 .641* 28.002.34* 152.4429.07* 7 / 13 43.5411.96* 108.3024.82* 44.995.68* 6.0 h 6.4921.103* 24.137.04* 216.9343.47 90.6327.86 166.0532.00* 131.9515.15* 24.0 h 6.1621.682* 22.1010.80* 213.1723.99 108.5321.25* 166.5624.54* 138.107.28* 48.0 h 6.1971.243* 21.355.72* 248.4253.55 104.5010.14* 169.4216.32* 141.051.15* 对照组 Control 0.1870.077 12.693.97 229.7038.37 144.1030.50 297.7321.99 19.697.37 与对照组比较， *P 0.05， *P 0.01 *P 0.05,*P 0.01 vs control 表 2 急性镉中毒大鼠肝细胞损伤及 H2O2-CeCl3 沉淀的电镜观察 Table 2 Hepatocytes injury and H2O2-CeCl3 precipication by electron microscopy in rats after acute Cd toxication 染镉后时间 Time after expo- sure to Cd(h) 形态正常细胞数 8 / 13 Normal (No.) 可逆改变细胞数 Reversible change (No.) 不可逆改变细胞数 Irreversible change (No.) 细胞总数 Total (No.) H2O2-CeCl3 沉淀 H2O2-CeCl3 precipitation 0.5 23 23 - 1.0 18 15 33 + 3.0 5 12 15 32 + 6.0 8 16 24 + 24.0 4 24 28 - 48.0 25 3 28 - 图 1 正常肝细胞：糖原颗粒聚集 ,粗面内质网 (ER)丰富，线粒体嵴清晰 10 500; 图 2 染镉后 30 分钟 :肝细胞结构正常，未见 Ce 的沉积 9 / 13 10 500; 图 3 染镉后 1 小时： ER扩张，核糖体已大部脱落，线粒体轻度肿胀；可见少量 Ce 呈点状沉积在肝实质细胞 (PC)、内皮细胞 (EC)膜上 12 000; 图 4 染镉后 3 小时： ER极度扩张，线粒体膨胀，内外膜模糊不清；见大量 Ce沉 积在 PC、 EC和 Kupffer s细胞 (K)膜上 15 000; 图 5 染镉后 6小时 :处于不可逆改变状态的肝细胞胞浆清亮，少有细胞器；仍 可见少量 Ce沉积在 PC和 EC膜上 5 500; 图 6 染镉后 24 小时 :可见破碎的肝细胞，胞内膜结构大多已不清晰；未见 Ce 的沉积 7 000 Fig 1 Normal hepatocyte:glycogen particles aggregated,mitochondrial cristae clear,endoplasmic reticulum(ER) abundant 10 500; Fig 2 30 min after Cd-injection:no change of hepatocyte structure and no Ce-H2O2 precipitation 10 500; Fig 3 1 h after Cd-injection:ER dilatant,ribosomes 10 / 13 mostly dislodged, mitochondria slightly swollen,small amount of Ce-H2O2 precipitation on the membrane of liver parenchymal cell(PC) and endothelial cell(EC) 12 000; Fig 4 3 h after Cd-injection:ER extremely dilatant,mitochondria swollen, a lot of Ce-H2O2 precipitation on the membrane of PC,EC and Kupffer s cell(KC) 15 000; Fig 5 6 h after Cd-injection:in irreversible state,hepato-cytoplasm clear, few organelle,a few Ce-H2O2 precipitation on the membrane of PC and EC 5 500; Fig 6 24 h after Cd-injection:hepatocyte plasmotorrhexis,membrane of nucleus and mitochondrion not clear,no Ce-H2O2 precipitation 7 000 图 7 染镉后 48 小时：核已固缩的 PC和增生的成纤维细胞(F) ，无 Ce 的沉积 5 500 Fig 7 48 h after Cd-injection:no Ce-H2O2 precipitation,pyknotic PC 11 / 13 and hyperplastic fibroblast(F) 5 500 图 8 染镉后 48小时：正常形态的肝细胞无 Ce的沉积 4 200 Fig 8 48 h after Cd-injection:no Ce-H2O2 precipitation in normal hepatocytes 4 200 讨 论 以上结果表明 :大鼠尾静脉注射镉后，镉很快聚集在肝脏，肝脏是镉急性中毒损伤的主要靶器官。镉作为过渡金属可通过 Fenton反应将 H2O2转变为羟自由基，作用于质膜，造成膜的脂质过氧化。同时，镉直接与抗氧化酶中的金属相互作用，抑制酶的活力，使自由 基的清除受到影响。自由基作用于不饱和脂肪酸，加重了膜的脂质过氧化，因而在镉中毒后 MDA 的含量均显著高于正常。脂质过氧化和自由基可造成细胞的结构和功能的改变，使细胞损伤进行性加重，是镉中毒损伤的主要因素 6。 金属硫蛋白是小分子可诱导蛋白，含有 20 个半胱氨酸残基，可被镉、汞、锌等二价金属诱导。由于镉的诱导，在染镉后 3 小时，已有 MT 的合成， MT 与镉的亲和力升高，逐步增加细胞内结合镉的浓度，减少游离镉的浓度，使镉不能作用于其靶分子，从而减轻镉对抗氧化酶的抑制，加快自由基的清除，抑制脂质过氧化；同时 MT 富含 巯基的特殊结构使其具有多种生物学功能，包括自由基特别是羟自由基的12 / 13 清除以及抑制膜的脂质过氧化 7。所以，随着 MT 的合成增加， MDA 含量的下降非常显著，肝细胞膜上的自由基 2O2阳性沉积物也逐步减少，最终减轻了镉对肝细胞的损伤。肝细胞在染毒后 24小时大量破碎 ,而 48小时肝内 正常细胞又占多数，肝血窦重新被内皮细胞包围，即 MT对中毒剂量的镉引起的肝脏损伤有保护作用。 总之，镉急性中毒后，自由基和脂质过氧化的产生和减少，肝细胞损伤的出现和修复，抗氧化酶 (SOD、 GSH-Px、CAT)的活力下降和恢复及 MT的诱导产生等 ,彼此之间有着密切的消长时相关系。因此 ,可以认为自由基和脂质过氧化是镉损伤的主要因素。同时在镉中毒后抗氧化酶和 MT 以协同作用的方式互相补充发挥了抗氧化的功能，减轻了