手足口病中医证型与血清炎性细胞因子、T细胞亚群、NK细胞相关性分析.doc

手足口病中医证型与血清炎性细胞因子、T细胞亚群、NK细胞相关性分析 摘要：目的研究手足口病（HFMD）肺脾湿热证、湿热郁蒸证、毒热动风证与白细胞介素-6（IL-6）、降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）及CD3+、CD4+、CD8+T细胞、NK细胞之间的相关性。方法随机选取90例HFMD患者，肺脾湿热证、湿热郁蒸证、毒热动风证各30例，检测血清炎性细胞因子（IL-6、PCT、CRP）、T细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+）、NK细胞等指标，分析上述指标在各证型间的分布情况。结果毒热动风证IL-6、PCT、CRP水平明显高于肺脾湿热证、湿热郁蒸证，差异均有统计学意义（P0.01）；CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞绝对值毒热动风证与肺脾湿热证组、湿热郁蒸证组间比较差异均有统计学意义（P0.01）；CD3+细胞百分比毒热动风证组与肺脾湿热证组间比较差异均有统计学意义（P0.01），与湿热郁蒸证组间差异有统计学意义（P0.05）；CD4+细胞百分比毒热动风证组与肺脾湿热证组间比较差异有统计学意义（P0.05），与湿热郁蒸证组间比较差异有统计学意义（P0.01）；CD8+、NK细胞百分比毒热动风证组与肺脾湿热证组、湿热郁蒸证组间比较差异均有统计学意义（P0.01）。结论HFMD肺脾湿热证、湿热郁蒸证、毒热动风证在相关炎性细胞因子、促炎标志物及T细胞亚群等方面不仅与发病有关，并且与病情轻重及预后密切相关，能够较为有效地评估病情及判断预后。关键词：手足口病；白细胞介素-6；降钙素原；C反应蛋白；T细胞亚群DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.xx.07.005：R259.125：A：1005-5304（xx）07-0017-05AnalysisonCorrelationBetweenTCMSyndromesofHand，FootandMouthDiseaseandSerumProinflammatoryCytokines，TCellSubgroupandNKCellsHUANGWei，LIQin（FuzhouInfectiousDiseaseHospital，Fuzhou350000，China）Abstract：ObjectiveTostudythecorrelationbetweenhand，footandmouthdisease（HFMD）inlung-spleendamp-heatsyndrome，syndromeofstagnationandsteamingduetodamp-heat，andsyndromeofstirringwindduetotoxic-heatwithIL-6，PCT，CRP，CD3+，CD4+，CD8+andNKcells.MethodsNiypatientswithHFMDwererandomlyselected，dividingintolung-spleendamp-heatsyndrome，syndromeofstagnationandsteamingduetodamp-heat，andsyndromeofstirringwindduetotoxic-heat，30casesforeachsyndrome.IL-6，PCT，CRP，CD3+，CD4+，CD8+andNKcellsweredetected，andthedistributionofaboveindicatorsinthethreesyndromeswereanalyzed.ResultsLevelsofIL-6，PCTandCRPinsyndromeofstirringwindduetotoxic-heatweresignificantlyhigherthanthoseinlung-spleendamp-heatsyndromeandsyndromeofstagnationandsteamingduetodamp-heat，withstatisticalsignificance（P0.01）；TherewasstatisticalsignificanceinabsolutevaluecountingofCD3+，CD4+，CD8+andNKcellsamongthethreesyndromes（P0.01）；TherewasstatisticalsignificanceinthepercentageofCD3+cellsinsyndromeofstirringwindduetotoxic-heatandlung-spleendamp-heatsyndrome（P0.01）andsyndromeofstagnationandsteamingduetodamp-heat（P0.05）；TherewasstatisticalsignificanceinthepercentageofCD4+cells基金项目：国家科技重大专项-艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治（xxZX10004301-005）；福州市卫生系统科技计划项目（xx-S-wt8）通讯作者：李芹，E-mail：liqing0591xx163.syndromeofstirringwindduetotoxic-heatandlung-spleendamp-heatsyndrome（P0.05）andsyndromeofstagnationandsteamingduetodamp-heat（P0.01）；TherewasstatisticalsignificanceinthepercentagesofCD8+andNKcellsinthethreesyndromes（P0.05），具有可比性，见表1。1.2纳入标准年龄最小6个月，最大6岁；病程在48h内；符合手足口病诊疗指南（xx年版）4中肺脾湿热证、湿热郁蒸证、毒热动风证中医临床诊断标准。肺脾湿热证主症：发热，手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹，口腔黏膜出现散在疱疹，咽红、流涎，神情倦怠，舌淡红或红，苔腻，脉数，指纹红紫。湿热郁蒸证主症：高热，疹色不泽，口腔溃疡，精神萎顿，舌红或绛、少津，苔黄腻，脉细数，指纹紫黯。毒热动风证主症：高热不退，易惊，呕吐，肌肉瞤动，或见肢体痿软，甚则昏矇，舌黯红或红绛，苔黄腻或黄燥，脉弦细数，指纹紫滞；患儿监护人签署知情同意书。1.3排除标准HFMD核酸检测未检出相关病毒者；合并其他严重器质性疾病、发育不健全者；合并其他病毒感染如巨细胞、EB病毒感染及HIV、水痘、麻疹者。1.4观察指标与方法1.4.1血清细胞因子、T细胞亚群、NK细胞患者均于就诊当日抽取静脉血3mL，3000r/min离心10min（美国BeckmanGS-15R离心机），留取血清，无菌分装后置于-80冰箱备用（T细胞亚群检测均于抽血后常温保存并在4h内检测）。IL-6、PCT检测均应用罗氏电化学发光法诊断试剂，采用罗氏E601全自动免疫分析仪检测；CRP检测使用BodiTechi-CHROMA试剂盒及配套艾可美分析仪。CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞采用美国BectonDickinson流式细胞仪及配套试剂检测。均按照相关说明书严格操作。1.4.2肠道病毒核酸分型患者均于就诊当日采集肛拭子标本，用中山大学达安公司生产的诊断试剂盒，美国生命科学公司Steponeplus-RealTimePCR仪定量分析。取约2g粪便于离心管中，加入10mL磷酸盐缓冲液、2g玻璃珠、1mL氯仿，振荡混匀，3500r/min离心20min，取上清液140?L，提取RNA。反应体系为25?L：荧光RT-PCR反应液20?L，DNA聚合酶1?L，反转录酶0.35?L，模板RNA5?L，充分混匀，6000r/min离心10s。实时荧光RT-PCR扩增程序：50反转录30min；95预变性3min；95变性15s，50退火30s，72延伸30min，共5个循环；95变性10s，55退火40s，采集荧光，共40个循环。1.5统计学方法采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料用xs表示，组间比较采用2检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1中医证型与血清促炎因子的相关性毒热动风证IL-6明显高于另两证（P=0.003）；毒热动风证PCT明显高于另两证（P=0.000）；毒热动风证CRP也明显高于另两证（P肺脾湿热证=0.002，P湿热郁蒸证=0.037）。肺脾湿热证与湿热郁蒸证IL-6、PCT、CRP比较差异无统计学意义。结果见表2。2.2中医证型与T细胞亚群计数的相关性毒热动风证CD3+计数与肺脾湿热证、湿热郁蒸证间比较差异均有统计学意义（P=0.005，P=0.006）；毒热动风证CD4+计数与另两证比较差异均有统计学意义（P=0.000）；毒热动风证CD8+计数与另两证比较差异均有统计学意义（P=0.005，P=0.000）；毒热动风证NK细胞计数与另两证比较差异有统计学意义（P=0.000）。肺脾湿热证与湿热郁蒸证CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞计数比较差异无统计学意义。结果见表3。2.3中医证型与T细胞亚群百分比的相关性毒热动风证CD3+百分比与另两证比较差异有统计学意义（P肺脾湿热证=0.012，P湿热郁蒸证=0.041）；毒热动风证CD4+百分比与另两证比较差异有统计学意义（P肺脾湿热证=0.033，P湿热郁蒸证=0.001）；毒热动风证CD8+百分比与另两证比较差异有统计学意义（P肺脾湿热证=0.008，P湿热郁蒸证=0.000）；毒热动风证NK细胞百分比与另两证比较差异有统计学意义（P肺脾湿热证=0.000，P湿热郁蒸证=0.000）。肺脾湿热证与湿热郁蒸证CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞百分比比较差异无统计学意义。结果见表4。2.4中医证型与核酸病毒分型的相关性分析经核酸病毒分型检测，肺脾湿热证中CoxA16型19例、EV71型8例、其他通用型3例；湿热郁蒸证中CoxA16型21例、EV71型4例、其他通用型5例；毒热动风证中CoxA16型21例、EV71型4例、其他通用型5例。可见，毒热动风证中EV71型病毒感染明显高于另两证，肺脾湿热证、湿热郁蒸证均以感染CoxA16为主，而毒热动风证以感染EV71型病毒为主，组间比较差异有统计学意义（2=52.74，P=0.002），结果见表5。3讨论中医无HFMD相关病名，现代中医家多将其归为“温病”范畴。该病多由学龄期小儿感染，该时期小儿脏气未充，正气不足，病邪易于乘虚而入，损伤正气，主要证素为湿和热，感染疫毒疠气之邪后导致气机逆乱和气虚，表现为发热、精神差等，热毒夹湿从皮肤口鼻而入，湿热郁于肌表，则见手足丘疱疹；内传心脾，心脾积热，湿热郁蒸，阻滞气机，表现为咳嗽、呕吐、纳差、腹痛。火热之邪易伤津动风耗气，扰动肝风，出现肢体抖动、烦躁、惊跳等神经系统症状5。素问评热病论篇有“邪之所凑，其气必虚”，加之为小儿稚阴稚阳之体，素体内热偏胜，脾胃积热，脾常不足，且多嗜食肥腻甘甜之品，易脾胃积热，脾失健运，湿热内蕴，外加感受邪毒，内应于脾而发病，湿热相搏6，正气抗邪外出，毒随气泄，外透肌肤，则见疱疹，甚者湿热内浸，波及气营，则出现气营两燔证，表现为高热不退、疱疹密集等症。临床根据HFMD辨证分型为肺脾湿热证、湿热郁蒸证2个普通证型及毒热动风证1个重症证型，3种证型在IL-6、PCT、CRP、CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞等方面均存在差异。IL-6是机体内的促炎因子，在HFMD发病过程中与机体免疫防疫、炎性损伤等病理生理过程有关7，HFMD由肠道病毒感染引起，导致一系列免疫调节损伤及炎症反应，而促炎细胞因子在该过程中发挥着重要作用8。本研究中，肺脾湿热证、湿热郁蒸证的IL-6水平明显低于毒热动风证，且差异有统计学意义，表明毒热动风证较另2个较轻证型IL-6水平表达异常，提示IL-6可能与HFMD病情密切相关。PCT是降钙素的前体，正常情况时主要在甲状腺滤泡旁细胞内合成，一般在严重感染及创伤等情况下明显升高，同样也参与炎症反应，在临床中多用于监测感染轻重程度9。PCT具有早期、特异、敏感的特性，优于传统的炎性标志物，且对病情的早期评估、预后评价、疗效观察等具有一定意义10。3组患儿中，肺脾湿热证、湿热郁蒸证的PCT水平明显低于毒热动风证，且差异有统计学意义，表明毒热动风证较其他2个较轻证型的PCT水平表达异常，提示PCT的表达可能与HFMD病情密切相关，在一定程度上能反映疾病的严重程度。CRP是一种急性时相反应蛋白，主要由IL-6刺激肝脏和上皮细胞合成和分泌，也是炎症反应的非特异性指标，在HFMD早期诊断中有一定价值11。本研究中，肺脾湿热证、湿热郁蒸证的CRP水平明显低于毒热动风证，且差异有统计学意义，说明CRP的高低对疾病的严重程度评估有一定意义。T淋巴细胞是机体免疫反应细胞，也是免疫调节细胞，能起到调节机体正常免疫功能的作用，正常情况下CD3+、CD4+、CD8+计数及百分比均维持动态平衡，以维持机体免疫功能稳定12。在本研究中，毒热动风证CD3+、CD4+、CD8+计数及百分比均低于肺脾湿热证、湿热郁蒸证，HFMD时感染肠道病毒，导致机体免疫机制失调，T淋巴细胞亚群分布异常13，B淋巴细胞表达和分泌的血清免疫球蛋白受T淋巴细胞调节，当CD4+细胞减少或功能低下时，其产生淋巴因子协助B淋巴细胞产生抗体的能力也相对减弱14。机体免疫力下降既是HFMD感染的前提，也是病情加重、影响预后的重要因素。毒热动风证属重证HFMD，相较于其他2个普通证型，细胞免疫功能明显低下，在疾病发展过程中检测T细胞亚群水平，既能综合评估病情，又能评估预后及转归。NK细胞是人体内固有免疫中的一种重要的效应细胞，它可以绕过T细胞受体（TCR）/CD3识别途径，以主要组织相容性复合物（MHC）非限制方式迅速识别和杀灭入侵的病原菌，同时分泌大量干扰素-等细胞因子，上调吞噬细胞的吞噬功能，在抗感染、抗肿瘤等方面发挥突出的作用，NK细胞的升高能在HFMD转归及预后方面有积极作用1