GB-T5413.25—1997婴幼儿配方食品和乳粉肌醇的测定.pdf

GB/T 5413.251997 前前 言言 本标准等同采用美国公职分析化学师协会（AOAC）方法，测定的是具有生物效价的肌醇含量。 本标准等同采用美国公职分析化学师协会（AOAC）方法，测定的是具有生物效价的肌醇含量。 本系列标准从实施之日起，代替 GB 54131985。 本系列标准从实施之日起，代替 GB 54131985。 本标准由中国轻工总会提出。 本标准由中国轻工总会提出。 本标准由全国乳品标准化中心归口。 本标准由全国乳品标准化中心归口。 本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。 本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。 本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢（中国）投资服务有限公司。 本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢（中国）投资服务有限公司。 本标准主要起草人：张玉杰、王芸、房玉国、王克新。 本标准主要起草人：张玉杰、王芸、房玉国、王克新。 中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准 婴幼儿配方食品和乳粉婴幼儿配方食品和乳粉 肌醇的测定肌醇的测定 Milk powder and formula foods for infant and young children Milk powder and formula foods for infant and young children -Determination of inostitol -Determination of inostitol GB/T 5413.251997GB/T 5413.251997 1 范围 本标准规定了肌醇的测定方法。 本标准方法一适用于婴幼儿配方食品和乳粉中肌醇的测定， 方法二适于乳粉中肌醇的测定。 方法一 微生物法 2 方法原理 通过 Saccharomyces uvarum 的生长情况来评价肌醇的含量。 3 试剂、菌种和培养基 所有试剂， 如未注明规格， 均指分析纯； 所有实验用水， 如未注明其他要求，均指三级水。 31 盐酸：体积比为 1：1 将体积分数为 37%的浓盐酸 50mL 用水稀释至 100mL。 32 氢氧化钠：c(NaOH)为 1mol/L 将 40g 氢氧化钠溶解于水中，稀释至 1000mL。 33 肌醇标样：无水晶体。 34 菌种 1 范围 本标准规定了肌醇的测定方法。 本标准方法一适用于婴幼儿配方食品和乳粉中肌醇的测定， 方法二适于乳粉中肌醇的测定。 方法一 微生物法 2 方法原理 通过 Saccharomyces uvarum 的生长情况来评价肌醇的含量。 3 试剂、菌种和培养基 所有试剂， 如未注明规格， 均指分析纯； 所有实验用水， 如未注明其他要求，均指三级水。 31 盐酸：体积比为 1：1 将体积分数为 37%的浓盐酸 50mL 用水稀释至 100mL。 32 氢氧化钠：c(NaOH)为 1mol/L 将 40g 氢氧化钠溶解于水中，稀释至 1000mL。 33 肌醇标样：无水晶体。 34 菌种 国家技术监督局 19970528 批准 19980901 实施 国家技术监督局 19970528 批准 19980901 实施 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB/T 5413.251997 Saccharomyces uvarum。 Saccharomyces uvarum。 35 培养基 35 培养基 351 链孢霉菌琼脂培养基：3 号蛋白胨 5g，酵母浸膏 5g，麦芽糖 40g，琼脂 15g。 351 链孢霉菌琼脂培养基：3 号蛋白胨 5g，酵母浸膏 5g，麦芽糖 40g，琼脂 15g。 352 肌醇测定用培养基：葡萄糖 100g，柠檬酸钾 10g，柠檬酸 2g，磷酸二氢钾 1.1g，氯化钾 0.85g，硫酸镁 0.25g，氯化钙 0.25g，硫酸猛 50mg，氯化亚铁 50mg，DL-色氨酸 800mg，L-胱氨酸 0.1g，L-异亮氨酸 0.5g，L-赖氨酸 0.5g，L-蛋氨酸 0.2g，DL-苯基丙氨酸 0.2g，L-酪氨酸 0.2g，L-天门冬酰胺 0.8g，DL-天门冬氨酸 0.2g，DL-丝氨酸 0.1g，甘氨酸 0.2g，DL-苏氨酸 0.4g，L-缬氨酸0.5g，L-组氨酸 0.124g，L-脯氨酸 0.2g，DL-丙氨酸 0.4g，L-谷氨酸 0.6g，L-精氨酸 0.48g， 盐酸硫胺素 500g， 生物素 16g， 泛酸钙 5mg， 盐酸吡哆醇 1mg，加蒸馏水至 1000mL，pH5.20.2（25） 。 352 肌醇测定用培养基：葡萄糖 100g，柠檬酸钾 10g，柠檬酸 2g，磷酸二氢钾 1.1g，氯化钾 0.85g，硫酸镁 0.25g，氯化钙 0.25g，硫酸猛 50mg，氯化亚铁 50mg，DL-色氨酸 800mg，L-胱氨酸 0.1g，L-异亮氨酸 0.5g，L-赖氨酸 0.5g，L-蛋氨酸 0.2g，DL-苯基丙氨酸 0.2g，L-酪氨酸 0.2g，L-天门冬酰胺 0.8g，DL-天门冬氨酸 0.2g，DL-丝氨酸 0.1g，甘氨酸 0.2g，DL-苏氨酸 0.4g，L-缬氨酸0.5g，L-组氨酸 0.124g，L-脯氨酸 0.2g，DL-丙氨酸 0.4g，L-谷氨酸 0.6g，L-精氨酸 0.48g， 盐酸硫胺素 500g， 生物素 16g， 泛酸钙 5mg， 盐酸吡哆醇 1mg，加蒸馏水至 1000mL，pH5.20.2（25） 。 4 仪器 4 仪器 常用实验室仪器及： 常用实验室仪器及： 41 pH 计。 41 pH 计。 42 250mL 圆底烧瓶，与冷凝器连接的锥形玻璃接头。 42 250mL 圆底烧瓶，与冷凝器连接的锥形玻璃接头。 43 比色仪。 43 比色仪。 5 样品制备 5 样品制备 51 贮备菌种的制备 51 贮备菌种的制备 511 从纯菌种 S.uvarum 中转接 2 个以上已制备好的麦芽浸出汁琼脂斜面。30培养 1624h。贮于冰箱中，保存期不要超过 2 周，然后再转接到新的琼脂斜面上。 511 从纯菌种 S.uvarum 中转接 2 个以上已制备好的麦芽浸出汁琼脂斜面。30培养 1624h。贮于冰箱中，保存期不要超过 2 周，然后再转接到新的琼脂斜面上。 512 接种的准备 512 接种的准备 最好在使用的当天从贮备菌种中转接到新配制的麦芽浸出汁琼脂斜面上， 30培养 1624h。用接种环无菌地转接该菌种到一个灭菌生理盐水中，直到得到一定浓度菌体细胞的悬浮液。为了测定，制备一个酵母菌悬浮水溶液，这个悬浮液中酵母菌的浓度在 0.1mg/mL。分光光度计事先用水调到 100%透光率，然后测定这个“标准”酵母菌的透光率。将新接种斜面中的菌体细胞移入到无菌生理盐水中，其浓度直到达到与上述标准溶液具有相同的透光率为止。 最好在使用的当天从贮备菌种中转接到新配制的麦芽浸出汁琼脂斜面上， 30培养 1624h。用接种环无菌地转接该菌种到一个灭菌生理盐水中，直到得到一定浓度菌体细胞的悬浮液。为了测定，制备一个酵母菌悬浮水溶液，这个悬浮液中酵母菌的浓度在 0.1mg/mL。分光光度计事先用水调到 100%透光率，然后测定这个“标准”酵母菌的透光率。将新接种斜面中的菌体细胞移入到无菌生理盐水中，其浓度直到达到与上述标准溶液具有相同的透光率为止。 52 标准溶液 52 标准溶液 521 标准贮备液，肌醇的浓度为 0.2mg/mL。 521 标准贮备液，肌醇的浓度为 0.2mg/mL。 称取 100mg 肌醇（该肌醇标样已放在干燥器中干燥 24h） ，于容量瓶中用水稀释至 500mL。贮于冰箱。 称取 100mg 肌醇（该肌醇标样已放在干燥器中干燥 24h） ，于容量瓶中用水稀释至 500mL。贮于冰箱。 522 标准工作液，肌醇的浓度为 2522 标准工作液，肌醇的浓度为 2g/mL。 吸取 5mL（5.2.1）溶液，用水稀至 500mL，定容。当天制备。 6 操作步骤 61 样品的处理 611 干粉样品 精确称取一定量样品， 这些样品中约含肌醇 0.5mg， 移入 250mL 圆底烧瓶中，加 100mL 盐酸（1：1） （3.1） ，继续 6.1.3 步骤。 612 液体样品。 吸一定量样品， 这些样品中约含肌醇 0.5mg， 加 100mL 盐酸 （3.1） ， 继续 6.1.3步骤。 613 将装样品的圆底烧杯与冷凝器联结，经过 6h，通过蒸馏将盐酸除去。 g/mL。 吸取 5mL（5.2.1）溶液，用水稀至 500mL，定容。当天制备。 6 操作步骤 61 样品的处理 611 干粉样品 精确称取一定量样品， 这些样品中约含肌醇 0.5mg， 移入 250mL 圆底烧瓶中，加 100mL 盐酸（1：1） （3.1） ，继续 6.1.3 步骤。 612 液体样品。 吸一定量样品， 这些样品中约含肌醇 0.5mg， 加 100mL 盐酸 （3.1） ， 继续 6.1.3步骤。 613 将装样品的圆底烧杯与冷凝器联结，经过 6h，通过蒸馏将盐酸除去。 国家技术监督局 19970528 批准 19980901 实施 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB/T 5413.251997 将剩余物用蒸馏水冲到烧杯中，用 1mol/L 氢氧化钠将溶液的 pH 值调至 5.10.1。 稀释至 250mL， 过滤， 弃去前部几毫升。 这个溶液肌醇的浓度均为 2g/mL。 将剩余物用蒸馏水冲到烧杯中，用 1mol/L 氢氧化钠将溶液的 pH 值调至 5.10.1。 稀释至 250mL， 过滤， 弃去前部几毫升。 这个溶液肌醇的浓度均为 2g/mL。 62 标准曲线 62 标准曲线 按表 1 顺序加入蒸馏水、标准溶液于培养管中，一式三份。 按表 1 顺序加入蒸馏水、标准溶液于培养管中，一式三份。 表 1 表 1 试管号 No. 试管号 No. 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 蒸馏水，mL 蒸馏水，mL 5 5 5 5 4 4 3 3 2 2 4 4 0 0 标准溶液，mL 标准溶液，mL 0 0 0 0 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 63 测定液 63 测定液 按表 2 顺序加入蒸馏水、样品溶液于培养管中，一式三份。 按表 2 顺序加入蒸馏水、样品溶液于培养管中，一式三份。 表 2 表 2 试管号 No. 试管号 No. 1 1 2 2 3 3 4 4 蒸馏水，mL 蒸馏水，mL 4 4 3 3 2 2 1 1 标准溶液，mL 标准溶液，mL 1 1 2 2 3 3 4 4 64 热处理 64 热处理 用棉塞或不锈钢帽盖住所有试管，100蒸汽蒸 10min。 用棉塞或不锈钢帽盖住所有试管，100蒸汽蒸 10min。 65 接种 65 接种 冷却试管至 30以下。无菌添加接种物于基础贮备培养基中，以每 100mL添加 2mL 的比例添加，充分混合，将上述已接种的培养基无菌加入到 6.2 和 6.3的每个测定管中，每管加 5mL（其中标准曲线中 No.1 号试管只加 5mL 接种的培 冷却试管至 30以下。无菌添加接种物于基础贮备培养基中，以每 100mL添加 2mL 的比例添加，充分混合，将上述已接种的培养基无菌加入到 6.2 和 6.3的每个测定管中，每管加 5mL（其中标准曲线中 No.1 号试管只加 5mL 接种的培 养基） 。 养基） 。 66 培养 66 培养 将试管固定在机械振荡器上， 以每分钟振荡 100200 次的往复运动中， 2830之间选择一个恒定温度（0.5）培养 2224h。 将试管固定在机械振荡器上， 以每分钟振荡 100200 次的往复运动中， 2830之间选择一个恒定温度（0.5）培养 2224h。 67 测定 67 测定 从振荡器上取下试管，于 100蒸 5min 或每管加 1 滴杀菌剂（Thoral） ，以使其停止生长。 从振荡器上取下试管，于 100蒸 5min 或每管加 1 滴杀菌剂（Thoral） ，以使其停止生长。 试管被任何外来微生物污染则测定无效。 通过对每个试管的视觉检查进行反应的预测，未接种管是清的，标准溶液和样品中应无其他微生物生长。 试管被任何外来微生物污染则测定无效。 通过对每个试管的视觉检查进行反应的预测，未接种管是清的，标准溶液和样品中应无其他微生物生长。 充分混合每一个试管（也可以加一滴消泡剂） ，将反应液加到比色皿内，搅拌内容物，将比色皿放入到分光光度计的比色池内，波长为 540660nm，读出透光率或吸光度，稳定 30s，每个试管稳定时间要相同。 充分混合每一个试管（也可以加一滴消泡剂） ，将反应液加到比色皿内，搅拌内容物，将比色皿放入到分光光度计的比色池内，波长为 540660nm，读出透光率或吸光度，稳定 30s，每个试管稳定时间要相同。 对于未接种管，将其透光率调到 100%（或吸光度为 0） ，读出其他接种空白管的读数。 对于未接种管，将其透光率调到 100%（或吸光度为 0） ，读出其他接种空白管的读数。 将接种空白管的透光率调到 100%（或吸光度为 0） ，依次读出其他每个管。 将接种空白管的透光率调到 100%（或吸光度为 0） ，依次读出其他每个管。 对每个水平的测试溶液， 计算每毫升中维生素的含量， 计算所得值的平均数，每个管测得值不得超过该平均值的15%。如果所得到的管数，少于所测定的四种水平的稀释液的管数的 2/3，用于计算样品浓度的数据是不充分的。如果剩余管数是原来管数的 2/3 或更多，则可根据平均值计算其样品的含量。 对每个水平的测试溶液， 计算每毫升中维生素的含量， 计算所得值的平均数，每个管测得值不得超过该平均值的15%。如果所得到的管数，少于所测定的四种水平的稀释液的管数的 2/3，用于计算样品浓度的数据是不充分的。如果剩余管数是原来管数的 2/3 或更多，则可根据平均值计算其样品的含量。 注：不可使用金属帽（除了不锈钢盖） ，这是由于试管在培养振荡过程中有金属污染的可能性。 注：不可使用金属帽（除了不锈钢盖） ，这是由于试管在培养振荡过程中有金属污染的可能性。 7 分析结果的表述 7 分析结果的表述 样品中肌醇的含量（mg/100g 或 mg/100mL）=样品中肌醇的含量（mg/100g 或 mg/100mL）=1001000250mX（1） （1） 国家技术监督局 19970528 批准 19980901 实施 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB/T 5413.251997 式中：X测定管中每毫升测试溶液中肌醇含量的平均值， 式中：X测定管中每毫升测试溶液中肌醇含量的平均值，g； m样品的质量或体积，g 或 mL 8 允许差 方法二 气相色谱法 9 方法提要 样品中的肌醇与衍生剂反应后，经气相色谱时行分离定量。 10 试剂 101 N-三甲基硅基咪唑。 102 三甲基氯硅烷。 11 仪器 111 气相色谱仪：FID 检测器。 11 2 色谱柱： 50%Phenylmethylcloxane， Cb-17 （J&w） 。 0.32mm idg； m样品的质量或体积，g 或 mL 8 允许差 方法二 气相色谱法 9 方法提要 样品中的肌醇与衍生剂反应后，经气相色谱时行分离定量。 10 试剂 101 N-三甲基硅基咪唑。 102 三甲基氯硅烷。 11 仪器 111 气相色谱仪：FID 检测器。 11 2 色谱柱： 50%Phenylmethylcloxane， Cb-17 （J&w） 。 0.32mm id30m 0.2530m 0.25m。 12 操作步骤 121 准确称取 1g 样品于烧杯中，用温水溶解，转至 100mL 容量瓶中，定容。取 5.0mL 该溶液放入小试管中作为测定液。 122 准确称取 50mg 肌醇标样于烧杯中，用水溶解，转至 100mL 容量瓶中，定容。用吸量管取该溶液 5mL 于一 100mL 容量瓶中，用水定容。取此溶液 2mL 于小试管中。 123 将上述分别含有样品和标准溶液的试管冷冻干燥。 于每个试管中加 1mL 内标溶液（每毫升吡啶中含 0.05mg 的蒽） ，盖紧塞子，放置 15min。 于每个试管中加 0.5mL 的 N-三甲基硅基咪唑和 0.2mol/L 的，混合，静置15min 后进样。 124 气相色谱条件： a） 柱温：140260（5/min） ； b） 检测器：FID； c） 检测器温度：280； d） 进样器：split（1：40） ； e） 进样体积：1L； f） 流速：1.4mL/min。 13 分析结果的表述 样品中肌醇含量 （mg/100g） =m。