分子病理学技术在临床中应用.ppt

分子病理学在临床医学中的应用,分子病理学的诞生,近十几年来，医学获得了分子生物学理论和实验的充实，建立起许多完全崭新的临床检验方法，甚至部分替换某些旧的传统检测方法。 从广度上-扩大了临床观察视野 从深度上-达到基因分析境界 分子病理学在此基础上诞生并发展起来。分子病理学作为病理学的一个现代分支，为国内外所公认。,分子病理学的发展,分子病理学的发展由始即以拥有大量实验、技术逐日进步为特征，并彼此相辅相成。分子生物学家不熟悉疾病，临床学家忙于临床防治疾病，使分子生物学当代理论和实验及时的引进、提炼并为临床诊断、认识疾病服务，这一历史任务，落在病理学工作者的肩上。,病理诊断技术,经典的HE切片观察 辅助技术 1、特殊染色技术 2、免疫组织化学技术 3、分子生物学技术,病理学历史：器官细胞分子（分子病理）,超微结构病理学 (Ultrastructural pathology )：E/M观察,器官（解剖）病理学 (Organ pathology,1761)：肉眼观察,细胞（组织）病理学 (Cellular pathology,1854)：L/M观察,免疫病理学 (Immunopathology)：免疫组化,分子病理学（Molecular pathology） 遗传病理学（Genetic pathology） 定量病理学（Quantitative pathology）,一项覆盖了9个国家和地区，1217例病人的泛亚洲科研显示：没有相关的靶标却接受了靶向治疗，死亡风险将增加185%。 新英格兰医学杂志.2009.9.v361(10).,“我知道每个患者不一样，而且需要个体化治疗，但我更需要知道他们有何不一样，如何根据这些不一样来实施个体化治疗。” 一位中国临床肿瘤医生, 2009,分子靶向治疗的概念,分子靶向治疗是指“针对参与肿瘤发生发展过程中的细胞信号转导和其他生物学途径的各种阻抑手段”，其治疗靶点可以是细胞表面的生长因子受体或者细胞内信号转导通路中的重要酶或蛋白。 广义的分子靶点则包括参与肿瘤细胞分化、分裂、凋亡、迁移、浸润、淋巴结及全身转移过程，从DNA 到蛋白水平的任何亚细胞分子。,靶向治疗与个性化治疗,医学分子生物学领域的革命不断影响着肿瘤的诊断和治疗。 在规范化治疗的基础上逐步发展为个性（体）化治疗。 个性（体）化治疗的核心是靶向治疗。 分子病理诊断是靶向治疗的基础。,基因诊断的定义,基因诊断是通过直接探查基因的存 在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。基 因诊断的探测目的物是DNA或RNA。 DNA-反映了基因的存在状态 RNA-反映了基因的表达状态,探查基因的分类,内源基因-机体自身的基因 用于诊断基因有无病变 外源基因-如病毒，细菌等 用于诊断有无病原体感染,分子病理学诊断,分子病理学理论与技术的应用，拓宽了病理诊断的视角，发展了新的研究领域。分子病理学诊断在指导肿瘤治疗中拥有特殊优势，即在组织学的基础上对肿瘤基因状态进行精细的分类和检测： 1 增加诊断的准确性、改善预后的评估，并指导临床处理。,2 区别不同基因类型的病人，设计合理的临床治疗方案。 3 增加药物的特异性和安全性，最大限度地优化治疗。 4 识别癌症易受攻击部位的信号途径，选择药物的靶点。 5 检测治疗中基因表达的变化，随时调整治疗方案。,相对于其他疾病，肿瘤临床治疗的有效率目前仍然偏低。随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展，人们对肿瘤多成因、异质性的特点有了更加全面的认识。个体化治疗已经成为肿瘤临床治疗的发展方向和最有效的手段。,但是，如何识别具有相同肿瘤发生部位、相同病理类型及病期的不同患者之间存在的差异成为实施个体化治疗的主要障碍。大量的临床研究和试验结果表明：特异肿瘤分子标志物（靶标）是识别患者个体差异的重要依据，实现对这些靶标的检测是实施肿瘤个体化治疗的前提和基础。,用于识别肿瘤患者个体差异的靶标大致可归纳为三类： 1）肿瘤治疗性药物的作用靶标: 如HER2基因拷贝数和EGFR基因突变； 2）肿瘤药物代谢相关的靶标: 如UGT1A1和CYP2D6等基因多态性； 3）肿瘤药物作用路径的相关靶标: 如KRAS基因突变和ERCC1基因mRNA表 达水平。,随着抗肿瘤药物的不断增加以及研究的深入，与作用路径有关的靶标越来越多。检测也从以前的单一靶标发展为多靶标联合进行。通过针对不同癌种的系统靶标检测，筛选适合患者个体的药物，提高治疗的针对性和有效率。,分子病理学用于基因诊断的常用手段,原位杂交： CISH(显色原为杂交)； FISH（包括单色和多色）； SISH（双标，银染色）。 DNA序列分析：DNA-SEQUENCING; PCR-RFLP; PCR-SSCP; D-HPLC; 其他: 包括基因芯片、实时定量PCR、 Southern、Western等,常用的靶向药物,美罗华（利妥昔，Rituximab） 赫赛丁（曲妥珠单抗，Trastuzumab） 帕妥珠单抗（Pertuzumab,Omnitarg） 格列卫（伊马替尼，Imatinib） 西妥昔（Cetuxamab） 特罗凯（厄洛替尼，Erlotinib） 易瑞沙（吉非替尼，gefitinib） 贝伐单抗（Bevacizumab）,靶向治疗应用较为广泛的肿瘤,淋巴瘤（CD20阳性） 乳腺癌（HER2阳性） 胃肠间质瘤（CD117/CD34阳性） 肺癌 胃肠癌 隆突性皮肤纤维肉瘤,结直肠癌,爱必妥是抗EGFR（表皮生长因子受体）单克隆抗体（单抗），用于治疗结直肠癌的生物靶向治疗药物。 结直肠癌（CRC）属危害严重的消化道恶性肿瘤，其发病率约占所有恶性肿瘤的1015%，是西方国家导致癌症相关死亡的第二大疾病。目前，中国CRC发病也逐年上升速，每年新增病例高达40万人。 结直肠癌的治疗与其它实体肿瘤一样，治疗方法包括手术治疗、化疗、放疗。以化疗为例，化疗药物从最初单一的药物，到联合的细胞毒药物，再到靶向药物，经历了一代代革新，对疾病的治疗效果也出现突破性的进展。,什么是KRAS基因？KRAS基因跟治疗有什么关系？北京肿瘤医院消化内科主任琳教授解释：“它是一个信号传导重要的路径，肿瘤信号必然要通过这个途径进行传导，传导完成后，肿瘤细胞才能增值、分化、生存，如果传导被阻断，肿瘤细胞就没有繁殖能力，就要死掉。”,军事医学科学院307医院消化肿瘤内科主任徐建明教授：“K-RAS基因检测则是了解结直肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法。只有KRAS基因未发生突变的患者才适合使用EGFR靶向药物治疗。因此，K-RAS基因检测可以筛选出EGFR受体靶向药物治疗有效的CRC癌患者，实现患者的个体化治疗，从而获得良好的预后，延长患者的生命。 更为重要的是，检测能够帮助早期症状不明显的结直肠癌患者尽早得知病情，实现癌症的早发现、早治疗，避免错过最佳治疗时机。”,易瑞沙治疗肺癌的机理,靶向药物吉非替尼能够与EGFR细胞内的ATP结合位点上的三磷酸腺苷竞争,阻断其酪氨酸激酶活性,进而阻断EGFR的信号传导通路,阻碍肿瘤的生长、转移和血管生成,并可诱导肿瘤细胞的凋亡,血管内皮细胞生长因子VEGF作用机理,内皮抑制素 1 核仁素（nucleolin） 2 整合素（integrin） Endostatin 抑制VEGR诱导的NO合成和内皮细胞迁移，促进凋亡；与pro-MMP2结合，抑制MMP2等。 VEGF-R 通过Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK及PI3K-AKT通路,VEGF抑制剂,血管内皮生长因子(VEGF)与VEGF受体，VEGFR-1(FIt-1)和VEGFR-2结合。VEGFR-2的激活是VEGF诱导有丝分裂、血管生成和血管渗透性所必须的。VEGFRs是跨膜受体，在胞浆结构域内具有保守的PTK活性，与配基结合引起VEGFR双聚体，依次激活激酶的活性和细胞内特异性VEGFR酪氨酸残基的自动磷酸化。酪氨酸残基的自动磷酸化进一步增加TK的催化活性，并为胞浆信号传递分子提供结合位点。这些细胞内信号蛋白的相互作用，诱导细胞对VEGF反应。,临床医师的机遇与挑战,传统的病例诊断没有过时，但要与时俱进！ 目前，是从规范化治疗到个性化治疗的过渡时期。 当前我们面临严峻的挑战和难逢机遇，临床医师不会错过、发展的大好机会！,29,FISH技术在临床中的应用,30,FISH检测在临床中的应用,血液病检测 产前诊断 实体瘤组织检测,FISH在实体肿瘤应用的目的,个体化治疗方案确定 肿瘤诊断 预后判断,32,肿瘤的形成,细胞内肿瘤相关基因发生异常（癌细胞） 细胞功能发生改变 细胞形态发生改变 癌细胞不断异常增殖 肿瘤形成,肿瘤发生过程,34,从分子水平对疾病的重新认识 不断提高的诊断技术和不断积累的临床实践 将来的肿瘤治疗模式： 以分子病理学诊断为基础的综合性靶向治疗,分子病理学引起肿瘤治疗模式的变化,肿瘤部位（实体）,肿瘤组织,分子病理学,肿瘤的基因类型,在乳腺癌检测中的应用,我国女性的乳腺癌发病率为20.1/10万,GLOBOCAN 2002，IARC。,乳腺癌的流行病学调查,欧美为高发地区，发病率在6080/10万左右，位列女性恶性肿瘤发生的第一位，且逐年上升。 而乳癌的死亡率大约占女性恶性肿瘤死亡的15左右，仅次于肺癌（25）。 我国的乳癌发病率在20/10万左右，在女性恶性肿瘤中位列第三位，而且发病率也成逐年上升的趋势。在一些大城市如上海，1999年的调查显示，乳癌的发病率已经达到52.9/10万。,乳腺癌治疗新进展,新的治疗理念 剂量密度和剂量强度 新的治疗药物 蒽环类药物新的应用 以紫杉醇为代表的传统药物 以赫塞汀为代表的靶向药物,1 = 基因拷贝 2 = mRNA 转录 3 = 细胞表面受体 4 = 受体细胞外片断,正常细胞,肿瘤细胞,Cytoplasm,HER2 受体,Cytoplasmic membrane,Nucleus,HER2 DNA,HER2 mRNA,1,2,3,4,乳腺癌靶向治疗,HER-2基因扩增检测,经验性处方药物,现在和将来,药A,药C,药B,传统,综合性治疗合理处方药物,尝试、更换,确定、治疗,依据不同医师的经验而有治疗差异，化费较多时间、金钱和降低生存机会,依据医师的诊断而采用靶向性治疗，节约大量时间、金钱和获取较大生存机会,药物的选择 应用遗传药理学的原理靶向性地选择药物,1987著名杂志科学发表HER2对乳腺癌的意义,HER2 HER2是有别于肿瘤大小、淋巴结及激素受体外的乳腺癌重要预后因子 HER2是肿瘤复发和生存期长短的独立预后因子,1998 年美国FDA 批准第一个专门针对p185高表达乳腺癌的抗体治疗药物Herceptin上市,在全世界开创了单抗类分子靶向药物治疗肿瘤的新时代。,HER-2过表达与生物靶向治疗, 下调细胞表面的HER一2蛋白 减少血管内皮生长因子的产生 介导对过度表达HER一2的肿瘤细胞的抗体依 赖性细胞毒作用(ADCC) 抑制HER一2蛋白与受体酪氨酸激酶超家族的 其他成员发生交联形成异质二聚体 减弱细胞生长信号的传递 通过诱导P27kipi和RB相关蛋白P130而大量减 少s期细胞数目 增强化疗所致细胞毒性,赫赛汀(Herceptin)抗肿瘤机制,赫赛汀靶向HER2的人源化单抗,用于治疗HER2阳性乳腺癌 生存率提高达45% 疗效改善并持续 生活质量得以改善,95% 人源化, 5% 鼠抗，具有高度亲和性 (Kd=0.1nM) 和特异性，显著降低免疫原性(HAMA),HER2状态是选择赫赛汀的重要指标,Her-2的概况,Her-2: 又名C-erbB-2, Her-2/neu 属于EGFR家族成员 为原癌基因,编码跨膜型酪氨酸激酶生长因子受体 2530%的乳腺癌为 Her-2基因的扩增/过度表达 Her2基因扩增的乳腺癌被认为对内分泌治疗相对不敏感,1.00 0.75 0.50 0.25 0,累计生存率,0 24 48 72 96 120 144,无扩增,扩增,基因扩增: 10 拷贝数 无基因扩增: 3拷贝数 临界值: 不包括,死亡时间 (月数),Log rank p0.001,Ross JS, Fletcher JA. Stem Cells 1998; 16: 413428,HER-2扩增患者无病生存期缩短,淋巴结阴性,Seshadri R et al. J Clin Oncol 1993;11:193642,100 80 60 40 20 0,0 12 24 36 48 60 72,无病生存概率,死亡时间 (月数),HER2 基因 3 拷贝数,HER2基因 3 拷贝数,对数秩检验 p=0.001,淋巴结阳性,HER-2基因扩增检测,约有25%的乳腺癌病人HER2蛋白呈过度表达。 人类表皮生长因子2，是由原癌基因编码的HER2受体,HER2在调控正常细胞的生长和发育和分化中起重要作用。 HER2原癌基因扩增导致HER2受体在细胞表面过度表达。,Ross, J. S. et al. Oncologist 2003;8:307-325,分子靶向治疗,赫赛汀(Herceptin)是针对肿瘤细胞Her-2基因靶点的第一个分子靶向药物，为乳腺癌临床治疗带来了新的突破。 赫赛汀二线或三线单药治疗总有效率为19%。 一线治疗总有效率可达35 %。 中位生存期为24.4个月，且具有良好的耐受性。,HER2 阳性可以预示蒽环类治疗的获益,K.I. Pritchard 2002.,P = 0.0307,P = 0.58,HER2 阳性 HER2 阴性,MA-5 Trial (CMF vs CEF) DFS by Treatment: FISH+,MA-5 Trial (CMF vs CEF) DFS by Treatment: FISH-,Pritchard et al NEJM 2006,HER2 阴性,HER2 阳性,paclitaxel,No paclitaxel,paclitaxel,No paclitaxel,HER2阳性可以预示紫杉醇的获益-CALGB 9344研究,Hayes et al ASCO 2006,Muss, et al. NEJM 1994,HER2 低表达,HER2 过表达,Muss et al, NEJM 1995,CAF密集方案的疗效与HER2状态密切相关 CALGB 8541,HER-2/neu Predictive Therapeutic Outcome,* - Muss, H.B. et al, NEJM 330: 1260-1226, 1994.,*,*,使用高剂量的化疗药物(?)对于HER-2/neu（-）患者的病情没有明显的改善,HER-2/neu（+）的患者使用高剂量的化疗药物(?)后病情有了明显的改善,初诊时明确HER2的重要性,2000 ASCO建议 2005 St Gallen专家共识建议,Goldhirsch et al 2005,预后评估 预后差,疗效预测 从赫赛汀的治疗中最大获益 芳香化酶抑制剂的疗效优于三苯氧胺 蒽环类和紫杉类的疗效优于CMF,内分泌治疗 HER2阳性患者相对耐药 CMF方案 HER2阳性患者相对耐药 蒽环类 对大剂量蒽环类相对敏感 紫杉类药物 相对敏感,HER2阳性状态可以预示肿瘤对常规治疗的反应情况,中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2007版）,乳腺癌石蜡组织标本,FISH,IHC,0,1+,2+,3+,赫赛汀 内分泌治疗 CMF 蒽环类药物 紫杉醇,什么是乳腺癌HER-2基因扩增？,HER-2基因定位于17q11.2-q12 由于17号染色体非整倍体造成的HER-2基因增加不是HER-2基因扩增，与赫赛汀治疗效果不相关； 只有HER-2基因自身扩增才是真正的HER-2扩增,确认单细胞 在47%的乳腺癌病例中17号染色体发生倍数的变化 17号染色体非整倍性的扩增的不同提供了分类的必要依据 CSP 17探针同时也是一个内参照,为什么要同时使用CSP17？,HER-2基因扩增示例图1,HER-2基因扩增示例图2,HER-2扩增检测的临床意义,指导临床赫赛汀的使用 指导临床常规化疗药物的应用 风险预测,TOP2A基因异常检测 TOP2A Aberrations in Breast Cancer,TOP 2A拓扑异构酶,由于TOP2A基因也定位与17q染色体，并且与Her-2基因相隔很近，而且，拓扑异构酶 II 是蒽环类抗生素的靶酶，因此有推断称使用TOP2A基因状态来预测患者对含蒽环类药物治疗方案，更为准确。,什么是TOP2A基因异常?,TOP2A基因定位于17q21.1，是DNA拓扑异构酶的基因 ； TOP2A基因异常包括扩增和缺失两种情况。,蒽环类药物治疗的机制,蒽环类药物是一种拓扑异构酶抑制剂，研究表明它可能是通过抑制肿瘤细胞DNA拓扑异构酶的活性而抑制肿瘤细胞的分化发育。,检测TOP2A基因的意义,TOP2A基因异常的病人预示着更短的无复发生存期（recurrence-free survival ，RFS）但总生存期并无改变，TOP2A缺失的病人预后更差 由于TOP2A基因也定位与17q染色体，并且与Her-2基因相隔很近，而且，TOP2A基因所编码的蛋白拓扑异构酶 II 是蒽环类抗生素的靶酶，研究发现使用TOP2A基因状态来预测患者对含蒽环类药物治疗方案，更为准确；,检测TOP2A基因的意义,在对晚期乳腺癌的研究中发现,Topo 的基因表达和肿瘤细胞对拓扑异构酶抑制剂的敏感性明显相关TOP2A 基因异常的病人可以明显受益于含有拓扑异构酶抑制剂的辅助化疗方案；TOP2A扩增的病人使用CEF方案进行治疗可以降低61%的复发风险和51%的死亡风险，而没有TOP2A扩增的患者使用CEF方案只能降低6%的复发风险和10%的死亡风险。,TOP2A与HER-2的相关性,TOP2A和Her-2/neu原癌基因在染色体上的位置非常邻近，均定位于17q11.2-22区域 ； 研究证实，在乳腺癌中Her-2/neu基因扩增又与其邻近位点上的 TOP2A基因改变呈正相关； 当Her-2/neu基因在乳腺癌中过度表达时，通过多种途径参与跨膜信号的转导及促进细胞的增殖，这可能是TOP2A基因扩增的原因 ；,TOP2A与HER-2的相关性,研究表明，对于her-2扩增阳性的乳腺癌患者，使用赫赛汀后会得到更好的预后效果，并且，使用大剂量蒽环类药物的治疗效果要优于常规剂量的治疗效果 ，这可能是由于HER-2与TOP2A的正相关性原因所致； 尽管大部分her-2扩增的患者都存在TOP2A基因的扩增，但并不能使用her-2状态来预测TOP2A基因的状态；而且，并不是所有存在TOP2A基因扩增的患者都会有topo II 蛋白的高表达，如果使用topo II 蛋白对肿瘤的增生状态进行评测，结果将会收到一定的影响,预测含蒽环类药物治疗方案的疗效,Acta Oncologica,2008; 47: 725_734,TOP2A异常，使用恩环类药物的RFS和OS比使用CMF的长,CEF,CMF,CEF,CMF,TOP2A基因异常检测试剂盒临床意义(一),对患者预后进行判断,Acta Oncologica,2008; 47: 725_734,正常,扩增,缺失,正常,扩增,缺失,TOP2A基因异常检测试剂盒临床意义(二),TOP2A基因异常的患者预后差,预测含蒽环类药物治疗方案的疗效 对患者预后进行判断,TOP2A基因异常检测,在膀胱癌中的应用,概述 FISH技术 膀胱癌 FISH探针 方法学 FISH结果分析和判断,膀胱镜检查及细胞形态学检测是诊断及监测膀胱癌最重要的二种手段。然而，细胞形态学检测敏感性低，膀胱镜检查病人痛苦，难以接受。从尿液中检测与膀胱癌发生相关的抗原虽灵敏性高于细胞形态学检测，但特异性较低，不能成为可靠的诊断指标。,概述1,随着对膀胱癌遗传学改变的深入研究，人们发现9号染色体部分（如p16位点）或全部丢失是最常见遗传学改变，且这一改变与膀胱癌的早期发生密切相关。此外，膀胱癌的发展与染色体不稳定性也紧密相连，特别是与3号、7号及17号染色体的非整倍性密切相关。目前的临床研究显示，对尿液或膀胱冲洗液中细胞进行以上遗传学改变的检测对膀胱癌的早期诊断及病程监测有很大的价值，其灵敏度高于细胞形态学检测，特异性则与细胞形态学检测相当。,概述2,检测以上遗传学改变标准方法为FISH技术。故在欧美等国，由于尿液检测的非创伤性及非痛苦性FISH技术已成为排除血尿病人患膀胱癌的最有效的方法之一。 有报道,FISH检测膀胱癌的灵敏度大约 80%, 特异性大约 96%,概述3,膀胱癌检测FISH探针,膀胱癌FISH 探针组(一),膀胱癌FISH 探针组(二),2019/11/17,83,可编辑,FISH 结果分析和判断,分析方法 阈值建立 结果判断 临床意义,分析方法,检测每组探针在间期细胞中信号.确定结果是否为阳性或阴性,结果判断,如果检测值大于阈值(M+3SD),判定为阳性结果 如果检测值小于阈值(M+3SD), 判定为阴性结果 如果检测值等于阈值,增加观测样本细胞的数量,临床意义,发现一种异常,提示被检测人患膀胱癌可能性较高. 发现两种异常或同一种异常的多次出现, 提示被检测病人患膀胱癌.,在子宫颈癌早期诊断中的应用及治疗策略探讨,一、宫颈癌的概述及其病因学研究进展,内容介绍,二、宫颈癌致病原因的基础医学研究进展,四、宫颈癌的常用临床方法应用介绍,五、宫颈癌早期诊断及临床治疗策略,三、临床检测TERC基因的意义,一、宫颈癌的概述及其病因学 研究进展,宫颈癌最常见的妇科恶性肿瘤,据世界范围内统计，每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5%，其中80%的病例发生在发展中国家。我国每年宫颈癌新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的28.8% ，发病率仅次于乳腺癌位居第二。 随着筛查制度的建立，世界宫颈癌的发病率和死亡率已经大幅下降。我国由70年代的10.28/10万下降到90年代的3.25/10万，但在高发病区，死亡率仍高居不下。,生物学因素：如细菌、病毒和衣原体等各种微生物的感染。 行为危险因素：如性生活过早、多个性伴侣、多孕多产、社会经济地位低下、营养不良及性混乱等； 目前仅有少量研究表明宫颈癌可能存在着家族聚集现象。,子宫颈癌的危险因素,二、宫颈癌致病原因的 基础医学研究进展,*早在十九世纪四十年代，一位意大利医生Regoni Stern最早提出结婚与否与宫颈癌的发生可能有关； *6070年代，人们的主要研究对象是HSV,HCMV等病原体； *1974年zur Hausen首次提出HPV感染与宫颈肿瘤有密切关系； *1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）颗粒； *1995年IARC专题讨论会：高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。 - 99.7的宫颈癌患者都能发现高危型HPV感染。,宫颈癌的生物学病因研究进展,HPV的致癌机理,HPV以游离态感染上皮细胞后，可以持续存在于染色体外，不引起任何病变，或引起良性病变和低度病变，如尖锐湿疣或轻度不典型增生等。而癌变则与病毒DNA整合入宿主染色体密切相关。 高危型HPV DNA链通常在E1或E2的开放读码框内断裂，使HPV DNA整合入染色体脆弱区。E6和E7具有促进和维持整合状态的功能 HPV E6蛋白间接抑制 p53活性，阻碍细胞对DNA损伤的反应。（负向调节细胞的生长和分化） HPV E7蛋白与pRb结合后使其功能失活，改变细胞周期的正常调控,型别：已发现100多种不同的亚型（如果DNA序列同源性小于90，则定为新的亚型）。其中超过35种可以感染人类的生殖器官，约30种与肿瘤有关。 1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42、43、44 ） ； 2）高危型： 宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、 52、53、 56、58、59、66、68、73、83、MM4 ）； 分布：有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。 HPV45在非洲西部很常见，HPV39和59在美洲中部和南部常见，HPV52，58在中国常见。 在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16（占51），在腺癌和腺鳞癌中HPV18分别占56和39。,型别与分布,1995年IARC专题讨论会：高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。 - 99.7的宫颈癌患者都能发现高危型HPV感染。,正常妇女,HPV暴露,主要是性传播 感染几率：40,HPV,年龄30岁,一过性，80 平均8个月,年龄30岁,平均824个月,CIN I（组织学）,CIN II/III（组织学）,无细胞学改变/HPV消除,子宫颈浸润癌,机体免疫机制 辅助致癌因素,HPV感染与宫颈病变的自然过程,潜伏感染期 亚临床感染期 临床症状期 HPV相关肿瘤期,810年,细胞非典型性发育异常,细胞癌变,阻止细胞正常凋亡,高危型HPV持续性感染,人类染色体端粒酶基因(hTERC)扩增,致癌基因E6/E7编码的原癌蛋白表达,TERC基因的扩增可阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生,hTERC基因与宫颈癌,hTERC基因是人染色体端粒酶的编码基因 端粒酶在大多数正常体细胞中无活性，随着细胞分裂次数 的增加，端粒缩短，细胞死亡。 在宫颈癌中，端粒酶活性增加，维持端粒长度，细胞永生 化，免于凋亡，发生癌变。,子宫颈细胞hTERC位点扩增检测试剂盒,CSP3,hTERC,hTERC基因定位于3q26.3,3号染色体着丝粒信号,子宫颈细胞hTERC位点扩增检测试剂盒,三、临床检测TERC基因的意义,FISH在宫颈癌诊断中的应用,宫颈癌发生及发展阶段 正常ASCUSCIN1CIN2CIN3（原位癌）浸润癌 人类染色体端粒酶（hTERC）基因 ，GLP TERC: 3q26.3,有效进行子宫颈癌前病变的病理分级,以hTERC基因扩增阳性诊断CIN2或CIN2以上病变的 敏感度为82.17%,特异度为95.02%,辅助病理分级,以hTERC基因扩增阳性诊断HSLI以上病 变的敏感性为 92%，特异性为91%。,辅助TBS分级,卫生部多中心临床试验,FISH检测子宫颈上皮细胞hTERC基因扩增的临床应用研究：,本课题全国共86个单位参加。 共检测8443例宫颈细胞学样本。 其中7271例有病理结果。,宫颈癌FISH检测临床意义,伴有hTERC基因扩增的癌前病变的病人有52%96%的恶变可能。 可预测CIN1/CIN2 向CIN3发展的风险因素，其灵敏度是100% ， 特异性是 70%. FISH是进行筛查，早期诊断和风险预测的有效手段,(AJP April 2005, Vol. 166, No. 4),明确病理分级：将ASC-US/CIN 1(低度癌前发育异常)和CIN 2/CIN 3(高度癌前病变)进行区分，指导临床治疗方案选择 风险预测，评估癌变可能性：对于CIN 1/CIN 2患者，TERC基因扩增阳性的子宫颈病变患者发生进展/恶变的可能性超过50% 监测癌变的发生和发展：对于Ascus以上级病变的随访及经leep治疗后复发的监测,TERC基因检测的临床意义,四、宫颈癌的常用临床方法 应用介绍,临床提示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要8-10年。因此，必须采取适当的预防和筛查措施，才能够阻止宫颈癌的发生并有望最终消灭宫颈癌。在现代医学技术的支持下，妇科医生应该大有作为。,筛查是早诊早治关键,宫颈癌的常规临床检测方法,临床检查：如肉眼观察、阴道镜等 操作简便，但准确率和特异性有待提高（50-70） 细胞学检测：观察宫颈上皮细胞的变异，常见方法有：巴氏涂 片、LCT、 TCT等（70%以上） 1）长期宫颈糜烂可导致宫颈上皮细胞形态变异，但非HPV引起的细胞形态异常与宫颈癌病变没有直接联系。 2）在感染早期，细胞往往不会出现形态变化，但此时HPV对细胞内遗传物质的损伤可能已经产生。 病毒学检测：HPV DNA检测（PCR方法），常见方法有：基因芯片分型检测、HC-2、荧光PCR等 特异性强、灵敏度高，操作简便快捷 (98%) FISH检查，寻找癌变前细胞内遗传物质的改变,五、宫颈癌早期诊断及 临床治疗策略,CIN转 归,？,？,CIN （Cervical Intraepithelial Neoplasm)病变的进展,子宫颈癌筛查及诊断程序,FISH,FISH,FISH,阴道镜检查结果满意,随访（涂片、HPV）,Asc-us或HPV（+）,连续二次涂片（-）HPV（-）,合并宫颈糜烂等,阴道镜检,每年随诊,物理治疗 LEEP,CIN1持续,CIN1消退,进展CIN2/3,TERC（）,TERC（）,CIN/LSIL的处理,TERC（）,TERC（）,阴道镜不满意的CIN1患者的处理,TERC（）,TERC（）,阴道镜不满意的CIN2患者的处理,检测TERC基因结果及推荐解决方案,FISH检测技术 在产前、产后诊断中的应用,出生缺陷（birth defects）：是指胚胎或胎儿在发育过程中发生解剖学和功能上的异常。 国家人口和计划生育委员会发布: 我国每年有2000万名新生儿，出生缺陷患儿占全部出生人口的4%6%,占全世界500万出生缺陷儿的1/5。,出生缺陷现状,其中大约有2.6万个唐氏综合症患儿出生，全部治疗要花掉20多亿人民币。 大约有22万先天性心脏病患儿出生，全部治疗，要花掉160多亿人民币,出生缺陷性疾病,染色体病 ：13三体综合征、18三体综合征、唐氏综合症Turner综合征（45，X）、克氏综合症(47,XXY)等。 单基因遗传病：血友病、假性肥大性肌营养不良等。 多基因遗传病 ：神经管畸形,可以检测的疾病,唐氏综合症（21 三体） 面部扁平、发育迟缓、智力低下;2024岁,发病率1/800 Patau 综合症（13 三体） 智力严重缺陷，兔唇，易发心脏病；发病率1/8000 Edward 综合症（18 三体） 早夭，智障，残指等；发病率在1/2000到1/8000，第二大染色体疾病 Turner 综合症(45，X) 先天性卵巢发育不全；活产女性新生儿发病率大约为 1 / 2500 Klinefelter 综合症（47，XXY） 先天性睾丸发育不全,FISH检测的临床特点,FISH可以准确且快速的检测出13、18、21、 X和Y 染 色体的数目异常，24小时出结果。 FISH对样本要求比较低，不需要细胞培养 ，间期细胞即可检测。,FISH在产前诊断中的应用(一),FISH技术在欧美国家产前诊断中起重要作用，独立应用FISH检测占50%，与细胞学互补检测广泛应用。 2000年美国医学遗传学院（ACMG）宣布， FISH技术产前诊断结果可靠，与细胞染色体分析价值等同。 2004年英国国立监测委员会（UKNSC）建议唐筛高危孕妇，不需要常规核型分析，单纯应用21，18 和13的探针进行FISH诊断。,Prenat Diagn 2001; 21: 293301.,FISH在产前遗传性疾病中的应用(一),结论：FISH和核型分析相比,检测结果一致,在50多家产前诊断中心完成有效病例总计5558例。 FISH诊断成功率100%。 核型分析8例羊水细胞培养失败。 8例羊水细胞培养失败的病例，经FISH诊断，1例为21-三体，1例为47,XXY，其余6例诊断正常。两例异常病例后被核实，诊断正确。,FISH在产前遗传性疾病中的应用(一),卫生部多中心临床试验,产前染色体数目检测临床意义,针对唐氏筛查阳性结果快速检测。 核型分析和FISH检测是产前诊断的双重保险。 用于意外流产的胎儿的流产原因检测？,FISH荧光原位杂交平台,-基因检测有力工具,选择靶向治疗药物,辅助诊断癌症,预测疾病恶化风险,膀胱癌：P16基因、3、7、17号染色体数目,非小细胞肺癌：EGFR基因,乳腺癌/胃癌：Her-2基因、TOP2A基因,宫颈癌：TERC基因,多发性骨髓瘤：P53、IGH、RB1、1q21,慢淋：P53、ATM、RB1、D13S25,急 粒：AML1/ETO、ASS,淋巴瘤：、 、C-MYC,急/慢粒：BCR/ABL、 PML/RARA融合基因,基因测序技术在临床中应用,基因测序技术在癌症基因研究及临床治疗领域的应用将不但使我们能更快速可靠地对癌症进行诊断, 对其发生的内在分子机理也将有更深入的了解, 同时也将对癌症治疗药物的开发提供极大帮助。,与临床医学及病理密切相关的基因检测项目,P53 BRCA1 、 BRCA2 APC K-ras ApoE EGFR,C-kit FV YMDD HNPCC片段分析 尿路肿瘤微卫星片段分析,P53基因,P53基因定位于17号染色体短臂17p13.1，含有11个外显子和10个内含子，编码由393个氨基酸组成 ，分子量为53KD核酸蛋白，包括DNA结合、转录和激活结构域。 P53几乎参与了所有恶性肿瘤和癌变的肿瘤发生和演进过程。 P53基因病理改变主要有突变、重排、缺失等。突变是主要的致病方式，最常见的突变部位在第59外显子区域 。,临床应用,肿瘤诊断：肝癌、乳癌、膀胱癌、胃癌、肠癌、前列腺癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、脑肿瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤。 癌前及癌相关家族：萎缩性胃炎、大肠息肉、腺瘤、宫颈异型增生、乙肝和丙肝、子宫内膜不典型增生、痰、膀胱、粪便中异型细胞、乳腺囊性增生症及腺病等、骨髓异常增生综合症、低恶肉瘤、淋巴造血疾病等。,药物分子靶点和耐药基因：P53蛋白丢失，肿瘤细胞侵袭性增强，化疗凋亡作用受抑。某些肉瘤如脑肿瘤和癌的分子药物基因靶点治疗和化疗效果不佳。检出P53基因突变，有利于对昂贵且毒副作用大的治疗方案进行科学调整，有突变者用P53腺病毒（今又生）治疗更有针对性。 临床预后分析：P53基因突变癌症患者的生存预期短，易复发转移且家族血亲之间具肿瘤易感性。,BRCA1基因,BRCA1外显子约5.2KB全长序列，可分成44项完成全基因组检测。 BRCA2基因位于13q12-13，BRCA1抑癌基因位于染色体17q21，是目前极受重视与乳腺癌明确相关的易感基因，BRCA癌基因异常者在一生中患乳腺癌的理论概率为100。,临床应用,肿瘤诊断： BRCA1基因突变：主要为乳腺癌、卵巢癌，同时也有胰腺癌、胃癌、胆囊癌、恶性黑色素瘤、白血病、前列腺癌、子宫癌等。其中60为1-5bp的缺失框移，19为小插入，14为无义突变，也有大缺失或插入及剪接子突变。 伴卵巢癌的乳癌家系约有80%是由BRCA1的异常引起 BRCA2基因突变：主要与家族性乳癌和男性乳癌发病有关，另也有上述其它系统的恶性肿瘤发生概率。,癌的分化： BRCA1的突变及杂合子缺失与乳癌的中低分化生物学行为有关，临床上多表现为期及早晚期患者。 癌前及症前诊断： 主要用于乳癌、卵巢癌及消化系统癌症家族患者的基因突变检测。,APC基因,APC 基因位于第五号染色体的长臂（5q21-22），长达120KB，共有21个外显子。 APC基因突变主要位于基因中段的第9-11外显子，其中密码子第1061，1309的突变占了20%。患者可次序发生1000个以上的息肉，年龄轻，癌变早。 APC基因前、后段的基因突变与数量较少的小息肉有关，发病年龄较晚。可伴有纤维瘤病，后者与第1444位密码子突变有关。如在第386和1465位的突变，对野生型APC基因干扰弱，息肉少，发病年龄较晚。 APC基因突变分为有害（轻，中，重），多态性，和意义不明性。须结合病理形态诊断来评估基因突变的临床病理意义,临床应用,家族性腺瘤性息肉病（FAP）：APC致病基因突变，几乎100%的预示该家族成员的息肉存在（WHO资料）恶变可能，需密切复查肠镜病理检查。 Gardner 综合征： 除了肠腺瘤外，病人还有表皮样囊肿，骨瘤，牙疾和纤维瘤病。 特克综合征（Turkot syndrome）：多发性肠腺瘤伴脑髓母细胞瘤。 减性家族性腺瘤性息肉（Atteneuated FAP）:腺瘤少于100个，发病晚，癌变率较低。,其他：APC基因突变相关的疾病和肿瘤还有遗传性大肠癌组织APC基因突变率高达70% -90% 以上，散发性大肠癌组织中也有30%以上的突变率. 癌组织体细胞APC基因突变，意味着癌变的早期分子事件，肿瘤的亚克隆选择，去分化恶性演进，浸润转移耐药等生物学行为暂未发生，预后尚好。 肺癌、胃癌、食道癌、肝癌、乳腺癌等也有不同比例的APC基因突变。,注意事项：,检查材料主要是肠镜病理活检息肉或肿瘤组织，石蜡包埋病变组织，血液等。 APC基因与NHPCC微卫星不稳定都是早期癌基因检测互补项目，最好结合应用。 大肠多发性腺瘤性息肉病APC基因突变测序，也可检测胃癌，乳腺癌，胰腺癌及癌前病变和少数肉瘤的APC癌基因突变。它反映早期的癌变趋势。,Ras基因,Ras基因家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。 我们检测K-RAS最常突变第一外显子点突变常位于第12、13、59或61密码子处，不同的ras基因突变在不同的肿瘤中呈优势激活。,临床应用：,肿瘤诊断： K-ras突变：肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等为主 H-ras突变：急慢性淋巴造血系肿瘤为主 N-ras突变: 泌尿系肿瘤为主 癌前及家系检查： 癌前疾病患者ras基因突变提示细胞早期的恶性转化。 癌病家族受检者ras基因突变提示正常细胞的恶性演进和癌变。,ApoE基因,APOE（载脂蛋白E）基因位于19q，全长3.7 Kb，含有4个外显子，产生的APOE功能蛋白是低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒受体的配基。既进行脂质代谢，也活化水解脂肪的酶类。 APOE表型异常患者表现为脂质代谢疾病（高胆固醇症）、心脑血管病、高血压、肥胖、糖尿病、脑卒中和冠心病、神经再生退行性变（老年性痴呆）和免疫调节紊乱（桥本甲状腺功能低下和肿瘤易感）、它汀降脂类耐药及高血压耐药等。,APOE基因在正常人群中呈多态性表现，即人群中有不同的APOE类型，导致人类发病种类和危险频率呈明显的差异性。 APOE在同一基因座位有三个不同的等位基因（2 3 4）可编码成三个纯合子（2/2 ， 3/3、4/4）和三个杂合子（2/3 、2/ 4 3/4 ），形成6种不同的基因型，从而表现出不同的致病状态。 APOE的等位基因中3 频度最高达60-80， 4 的频度约10，2 频度小于10，这正是人类检测APOE多态性的目的意义。,临床应用：,预报老年性痴呆发病率可能概率，特别是家族性受检者。 检查高脂血症发病和分型，治疗疗效和耐药。 监测脑血管病复发性出血（脑梗塞）并作出警示性预报。 监测冠心病发病状况。 监测糖尿病和肾病发病状况。 对原发性高血压可评估家族性发病，治疗耐药及内脏器质损害现象。 对绝经和更年期妇女进行激素替代治疗。2 基因者可使总胆固醇明显升高，故需事先检测APOE基因。 评价妇女绝经期综合