细胞生物学-3细胞生物学研究方法.ppt

1,基因敲除,2,基因敲除示意图（1）,3,基因敲除示意图（2）,4,基因敲除原理,5,Knockout Mice,6,7,未来的生物技术,8,Caenorhabditis elegans,Drosophila melanogaster,Arabidopsis thaliana,C. elegans,Zebrafish,9,10,免疫胶体金技术,基本原理： 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶状溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。,11,吸附机理：因胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。 应用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等结合，因而在基础研究和临床试验中成为非常有用的工具。,12,免疫胶体金标定(Immunogold labeling),利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以观察蛋白质的分布区域。,13,在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。,细胞培养,14,人的细胞培养,15,细胞系: 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有无限的传代能力。 细胞株: 通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的传代能力。,原代培养：是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质,16,植物组织培养,17,植物原生质体培养,18,植物组织培养,外植体,愈伤组织,新植株,19,20,来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需 的物质(如供能系统和酶反应体系等)组成的体系即为非细胞体系 近年来非细胞体系在研究DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制以反细胞核装配(包括染色质装配、核膜装配及核骨架的装配)等。,21,概念,流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 原理： 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。,22,23,24,细胞分选,25,细胞标记,26,染色体分选,27,染色体标记,28,FACSAria,科研型,特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板） 适用于高速分选和多色分析,29,流式细胞仪检测范围,细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量,细胞结构,特异性抗原 （细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性 激素结合位点 细胞受体,细胞功能,30,流式细胞仪的工作原理,光学系统 激光光源 光收集系统 液流系统 流动室 液流驱动系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统,31,细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。,细胞工程,32,在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。,细胞融合,33,聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程,34,显微镜下细胞融合过程,35,36,37,BHK-21细胞用核骨架蛋白抗体进行免疫胶体金标记的结果 IF：中间纤维；g:金颗粒；N:核区,38,外周血血细胞扫描电镜标本的制备,取血-PBS洗三次-滴片(有Formvar膜)-冷的 1%戊二醛4度固定2小时-PBS-1%四氧化锇， 30分-PBS-50、70、90%丙酮各一次，100% 两次-50、70、90%醋酸异戊酯丙酮溶液各一次，100%醋酸异戊酯两次-临界点干燥-喷碳、金观察,39,人类血细胞SEM照片,40,41,GFP是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现的。在蛋白质编号lema中可以看到GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响 GFP的纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳光下时，它会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸收紫外光，然后以能量较低的绿光形式发射出来。,42,绿色荧光蛋白的应用,绿色荧光蛋白是当代科学和医学领域最重要的工具之一，它从显微水平上照亮了生命 。,43,随着病毒在宿主体内不断扩散，你就可以通过跟踪发出的绿光来观察病毒的扩散途径，或者你把它接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动,44,科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑神经细胞的发育过程。,45,46,绿色荧光蛋白的发现下村修,1962年首先从水母中分离绿色荧光蛋白的科学家，他发现这种蛋白在紫外线光中呈现亮色。,47,1992年，道格拉斯普瑞金拿到了绿色荧光蛋白的基因。,48,绿色荧光蛋白的推广马丁-查尔菲,1993年，马丁查尔菲成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物(如大肠杆菌等)也能产生绿色荧光蛋白，证实了绿色荧光蛋白与活体生物的相容性。,49,绿色荧光蛋白的改造钱永健,进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。,50,绿色荧光蛋白质在科学研究和艺术领域发挥作用的美丽而令人惊讶的例子。,3位诺贝尔奖得主第一次分离出的荧光基因，就是从上面照片中的这种水晶水母体内获得的。,水晶水母,51,图片中的小老鼠是1997年7月在大阪大学降生的，它们是第一种能够在夜里发光的哺乳动物。研究人员可利用荧光老鼠研究胎儿发育。,会发光的老鼠,52,杰夫利希曼(Jeff Lichtman)之手，展现了大脑内的连接，图片中美丽的“彩虹”就是神经系统网络。,脑内连接,53,这两只荧光猪诞生于中国黑龙江省哈尔滨东北农业大学的实验室。它们的发光本领并不是转基因技术的直接产物，而是从其经过基因改造的母亲那里遗传而来。,两只荧光猪,54,发红光的猫,左侧的猫由韩国研究人员2007年晚些时候打造，能够在紫外线下发出红光。某些情况下，这些荧光蛋白基因可用作一种分子开关，触发其它细胞活动,55,GFP宾尼兔,荧光兔“阿尔巴”(Alba)。阿尔巴是在转基因技术帮助下拥有这种荧光基因的。GFP宾尼兔的问世在世界上引发不小争议。,56,蝌蚪也发光,57,荧光鱼,在约克镇科技公司将荧光鱼引入市场后不久，荧光蛋白便迅速在商业上得到应用。,58,绿色荧光蛋白质可以帮助科学家了解细胞机制如何工作。利用转基因技术，所有细胞和动物都可以产生荧光蛋白质。,康涅狄格学院化学家、发光基因作者马克齐默(Mark Zimmer)将绿色荧光蛋白质称之为“21世纪的显微镜”。通过让基因携带绿色荧光蛋白质与瘤转移或大脑功能有关的基因科学家只需通过寻找荧光便可知道基因何时以及为什么“开启”。,59,细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞 骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等 细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术） 细胞内氧自由基活性 细胞内钙离子浓度变化 膜电位,共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用,60,Drosophila embryo stained with a fluorescent probe for actin filaments,Conventional,Confocal,61,62,GFP tagging: Arabidopsis leaves,SEM,Confocal:talin-GFP,63,