细胞分选技术指南.ppt

StemCell Technologies Inc. 细胞分选产品,细胞分选和基本原理,细胞分选是把一种细胞从多细胞样品中分离出来 用抗体标记细胞，同时被用的抗体被萤光标记或连接免疫磁珠或其它 利用萤光和免疫磁珠的特性来分离细胞,细胞分选常用方法,密度梯度离心(Ficoll)离心 抗体标记分离 免疫密度离心 免疫磁珠 流式,正选 和 负选,正选 只需要一种抗体 分离出的细胞纯度高 对于比例小的细胞群，正选容易得到高纯度,正选和负选的比较,优点,负选 需要的细胞没有被抗体等标记 对需要的细胞，不需要特异性的细胞标记,缺点,需要多种抗体标记不需要的细胞,需要特异性的靶细胞标记 可能引起细胞活化,细胞分选产品,StemCell Technologies Inc. 的细胞分选原理,利用抗体四聚体(Tetrameric Antibody Complex, TAC)来分选细胞,适用于人的全血细胞样品 是一种负选方法 基本原理：抗体标记和免疫密度离心法 需要的仪器：离心机,Direct Labeling of Human Cells,不需要的细胞,离心,把细胞样品置于密度分离液上,分选的过程,收集,的密度分离液DM-L,为了最大限度回收淋巴细胞，StemCell专门研制了一种适合RosetteSep的密度分离液 DM-L DM-L 的密度：1.081 g / mL DM-L 的渗透压与人外周血的渗透压相同(iso-osmolar) 适用于以下的淋巴细胞分选: CD3+ T cells - CD8+ T cells CD4+ T cells - B cells,Density of Fresh Leukocytes,From: “Centrifugation Techniques III”, Nycomed Amersham,Monocytes Lymphocytes Basophils Neutrophils Eosinophils Erythrocytes,1.060 1.070 1.080 1.090 1.100 Density in g/mL,DM-L: 1.081 g/mL Ficoll: 1.077 g/mL,低温冷藏的外周血单个核细胞,人 和 小鼠,脾细胞,负选, 只需要离心机 可以同时分选多份样品 取决于离心机的容量 分选的细胞量在 106 cells in Eppendorf - 109 cells in 50 mL tube 适用于低温冷藏的人外周血单个核细胞(PBMC)和小鼠脾细胞,的特点 Sep,直接标记人的细胞,Anti-cell Anti- particle,Tetrameric Antibody Complex (TAC),Dense Particle(1mm),Unwanted Cell,间接标记小鼠的细胞,Tetrameric Antibody Complex (TAC),Biotinylated Antibody Anti- Anti- Biotin Particle,Dense Particle(1mm),Unwanted Cell,SpinSep 的分选过程,Label Layer & Spin Collect,Antibody Cocktail Anti-Biotin TAC (mouse only) Dense Particles,4. Layer over SpinSep Density Medium Spin 10-20min at 1200xg,Collect almost entire volume 7. Wash to remove Density Medium,的细胞分选资料,人的外周血细胞(PBMC),小鼠的脾细胞,Values are the mean SD,新型，高效，易行的免疫磁珠分选技术 新：不用柱子，只需用磁极，所用的磁珠很小 高效：效率-分选过程不用洗细胞(省时省力); 效果-分选的细胞纯度高 易：操作过程简单易行 广：可做正选和负选 适应性强：在理论上可以分选任何一种细胞,Anti- Anti- Cell Particle,Tetrameric Antibody Complex (TAC),Magnetic Nanoparticle (160 nm),直接标记人的细胞,Cell,Magnetic Nanoparticle (160 nm),Tetrameric Antibody Complex (TAC),Biotin/Fluo Antibody Anti- Anti- biotin/Fluo Particle,间接标记小鼠细胞,Cell,Relative Sizes of Magnetic Particles used in Cell Separation,Cell,的细胞分选过程,正选资料,人的外周血细胞(PBMC),小鼠脾或骨髓细胞,负选资料,人的外周血细胞(PBMC),小鼠脾细胞,可正选或去除任何一种细胞,PE 标记的抗体分选Kit FITC 标记的抗体分选Kit Biotin 标记的抗体分选Kit,Cell,细胞分选常见的问题,分选方法的选择 样品种类 样品数量 每次需要分选的细胞数,常见问题,样品的前处理 Ficoll 离心机 全血和单采的细胞 细胞计数 稀释液 细胞数,常见问题,分选过程中 细胞浓度 缓冲液 细胞混匀动作要点,Calculating Purity and Recovery,% Purity = # desired cells in enriched fraction x 100 # total nucleated cells in enriched fraction = % of total events in the desired cell gate (FACS profile) % Recovery = # desired cells in enriched fraction x 100 # desired cells in start = (% purity in enriched) x (total nucleated cells in enriched) x 100 (% purity in start) x (total nucleated cells in start),FACS Gate,panNK+ Selected from Mo Spleen,Start,NK+ Selected,Data analysis,的技术要领,细胞稀释后，用吸管混匀细胞（不要倒置试管） 倒出未标记的细胞时，让液体连续流淌，试管