质谱培训教材.ppt

ThermoScientificChina-DemoCenter-,LTQ液质联用仪培训教材,质谱基本常识,第一章,“ThebasisinMS(massspectrometry)istheproductionofions,thataresubsequentlyseparatedorfilteredaccordingtotheirmass-to-charge(m/z)ratioanddetected.Theresultingmassspectrumisaplotofthe(relative)abundanceoftheproducedionsasafunctionofthem/zratio.”（质谱的基础是产生离子，这些离子随后按质荷比大小被分离过滤并被检测。得到的质谱图是产生离子质荷比的相对丰度图谱。）,Niessen,W.M.A.;VanderGreef,J.,LiquidChromatographyMassSpectrometry:PrinciplesandApplications,1992,MarcelDekker,Inc.,NewYork,p.29.,什么是质谱？,怎样理解质谱,LC-MS垂直置于壁上气化溶剂冷却后不被凝结,所改进的不锈钢的废液排出部件,探针垂直安装液滴直接进入废液排出口，即使氮气用完，也不会在腔室内累积溶剂。,非塑料外壳,便于观看的两个视角,钛制成的新型Skimmers:直径较大，提高灵敏度钛材料更有利于保持skimmer的热平衡，不锈钢材料会逐渐冷却所以可作为加热器,IonMax源:Skimmer,APIStack装配示意图,LC-MS条件优化,第二章,Sampleconcentration样品浓度Choiceofcolumnandsolvents柱子型号和溶剂Flowratesandtheireffects流速及影响,LC/MS条件优化,样品信息你需要得到尽可能多的样品信息！,目标分析物的信息包括以下分子式,结构(官能团)分子量溶解性,pKa稳定性,储存是否有标准品浓度水平和范围基质信息:类型,状态(液体,固体)溶解性不同成份,样品预处理提高灵敏度,去除基质干扰离子抑制建立去除基质干扰的方法(SPE,萃取,过滤等)进样浓度与进样量和柱内径有关,ESI:1L/min-1mL/min最佳使用流速:200L/min一般来说,高流速需要高的毛细管温度和气体流速。APCI:200L/min-2mL/minOptimalFlowRate:500L/min一般来说，高流速需要更高的鞘气和辅助气流量，但不需要提高毛细管温度,LC建议流速,液相柱(标准装柱填料直径5.0mm)最适合的流速(线性速度),流速柱子直径1.0mL/min4.6mm0.5mL/min3.0mm0.2mL/min2.1mm50mL/min1.0mm10mL/min毛细管,使用窄内径的柱子可以提高分离效果,LC添加剂,酸不要使用无机酸(可能会导致腐蚀)推荐使用醋酸和甲酸碱不要使用碱金属碱(可能会导致腐蚀)推荐使用氢氧化铵和氨水表面活性剂清洁剂和其他表面活性剂会产生离子抑制三氟醋酸(TFA)可以提高液相的分离度，但是在质谱正负离子模式下会产生离子抑制作用三乙胺/三甲胺(TEA/TMA)有助于形成负离子,增加TFA用量(乙腈:水=50:50)对质谱信号强度的影响,本结果是两次实验的平均值.*注:不加TFA的结果是不确定的，因为在溶液无法肽段质子化。对照样品是50/50/0.1,甲醇/水/甲酸(N=6,平均信号强度=1.10 x106counts.,*S.Baldwin,K.Stoney,K.Wheeler,I.Mychreest.“LowpHSolventAlternativestoTFASolventsandTheirEffectonHPLC/ESI-MSofPeptides”,PosterPaperPresentedatASMS96.,液质联用中缓冲盐使用的注意事项(pH),当使用非挥发性的盐时,一定要使用吹扫挡锥（sweepcone）。尽量避免使用如下的非挥发性盐碱金属磷酸盐硼酸盐柠檬酸盐经常使用缓冲盐需要定期清洗金属毛细管,乙酸甲酸氢氧化铵氨水溶液三氯乙酸(0.02%v/v)三氟乙酸(0.02%v/v)三乙胺(Activation2.设定ActivationType，DefaultChargeState，IsolationWidth和NormalizedCollisionEnergy,BuildingDoublePlay:ScanEventTwo,选择ScanEventCurrentScanEvent设定Minimumsignalthreshold(counts，绝对强度)；用一级全扫描模式采集一个空白数据，在QualBrowser里查看该数据得到；确定两处均设为1；,实验总结,常用DataDependentLCQExperiments设定,Big3:步骤:一级全扫描对最强的离子，第二强的离子以及第三强的离子做数据相关DataDependent(dd)MS2优点/缺点:MS2花费时间很长能采到峰顶点位置的信号DoublePlaywithDynamicExclusion:步骤:一级全扫描启用DynamicExclusion，对最强的离子做数据相关DataDependent(dd)MS2优点/缺点:为分析共流出物提供可能可能丢失出峰的顶点位置,DynamicExclusion共流出物的MS&MS2,DynamicExclusion,1.选择GlobalDynamicExclusion2.设定Repeatcount,Repeatduration,Exclusionlistsize,Exclusionduration和Exclusionmasswidth,*以上设置导致0.2分钟内采集了三次MS/MS图谱，0.3分钟后该排除离子获得释放*ExclusionMassWidth中Low和High的设置可以是不对称的，High的设定较宽，可以包含同位素峰,DivertValve操作,方法总结,DataDependentTriggers数据相关采集系列,第九章,Xcalibur-SequenceSetup,XcaliburHomePageSequenceSetup,打开SequenceSetup,点击ViewSequenceSetupView,也可点击SequenceSetup,创建序列,1.双击添加InstrumentMethod,2.如果此路径下没有该文件夹,你可以输入文件夹名，该文件夹将会创建,3.设定FileName(无空格),Position和InjVol,如果你的样品数比较少，从SequenceSetup主页建序列更方便,运行序列需要提供的基本信息:FileName,Path,InstMeth,Position,InjVol,创建序列,热键F2，可以编辑该文本,右击并选择OpenFile可以打开InstrumentFile,用新序列模板创建序列,如果你需要运行大量的样品,使用NewSequenceTemplate创建序列会比较方便,1.点击New,新序列模板,1.选择BaseFileName,Path,&InstrumentMethod,3.选择起始的VialPosition,2.输入unknown样品的个数,4.如果你已经有ProcessingMethod,在上面指定好，你可以添加Standards,Blanks以及QCs。会自动生成包括processingmethod相关信息的序列,新序列模板,一旦你在NewSequenceTemplate界面点击OK,文件名会自动根据BaseFileName自动往下递增,新序列模板,IfyouwanttotypeanewFileName:,2.选择Edit点击FillDown,1.输入Filename,改变序列中ColumnArrangement,1.选择Change点击ColumnArrangement,2.从左边的AvailableColumns选择需要的内容,4.点击MoveUp或者Down改变显示次序,3.点击Add,改变用户标签,1.选择Change并点击UserLabels,2.改变labels,改变Tray,当前配置的自动进样器能够使用的所有进样架列表,1.选择Change点击TrayName,2.选择使用的Tray型号,将序列输出到Excel,1.选择File，点击ExportSequence,将序列输出到Excel,1.选择需要输出的内容并点击Browse,2.命名该文件,3.序列文件将输出为.csv格式,输出序列示例,确保重新将该序列导入Xcalibur,第一行必须包含文本BracketType=nwheren=1-4.每个数字代表特定的bracket类型:1=Overlapped,2=None,3=Non-overlapped,4=Open,从Excel中导入序列,2.选择你需要输入的内容，点击Browse找到输入文件,1.选择File并点击ImportSequence,运行序列,1.可以选择RunOneSample或RunSequence,运行序列,显示在InstrumentConfiguration界面配置的所有仪器,允许自动处理样品数据,如果没选,序列将不会运行，除非你点击ActionsStartAnalysis,确认这些行是待运行的,可以优先运行提交的序列,选择在序列运行前或后仪器的运行方法,信息条,AcquisitionQueue-SequenceProgress,Status,通过点击ViewanduncheckingInfoView打开或关闭InfoView,Status键显示所有配置仪器的状态,提交序列后,就会出现在AcquisitionQueue。点击Sample旁边的方框，框内打勾，键盘上再点击Delete键即可删除该样品,实时图谱查看,1.选择View，点击RealTimePlotView,如果你更改了该页面的一些设定,点击解锁键，重新监测实时数据采集,第十章,QualBrowser定性浏览器,打开QualBrowser,你可以在XcaliburHomepage右击QualBrowser,打开原始数据或序列,打开QualBrowser,QualBrowser主界面,InfoBar,放大按钮，可以放大色谱图或质谱中某段区域,主要工具,最多每个窗口一次可以显示16个cells，每个cell最多包含8个plots,右上角有Cell的标志,在QualBrowser界面打开文件,2.选择replace(当前window,cell或plot),addanewwindoworplot(默认是增加一个新窗口),选择输出的Layout,1.点击File选择Open(也可以打开序列或结果文件),TheInfoBar,TheCellInfo页面提供对应Cell中每个Plot信息,如果你打开的是序列或结果文件，将分别出现在InfoBar的第二页和第三页,当你对色谱峰进行积分时，会出现Integration页面。你可以改变积分参数获得合理的积分,TheInfoBarElementalComposition,2.设定分子式的限定条件,3.改变使用的元素,右击选择AddIsotopes，直接从元素周期表界面进行选择,1.输入质量数或在质谱图某个质量数上右击，选择GenerateFormulafromMass,4.点击Calculate，表格中即出现分子式信息,InfoBar之ElementalComposition帮助你计算最符合某个质量数（来自于质谱图）的化学分子式,IsotopeSimulator同位素拟合同位素拟合页面允许用户建立一个化学分子式同位素分布质谱图,定性浏览器信息栏,IsotopeSimulator同位素拟合allowsyoutocreateasimulatedspectrumforachemicalformulaentered,TheInfoBarIsotopeSimulator,2.设定参数,输入化学分子式,3.点击new,4.出现该化学分子式的精确质量数，拟合的图谱出现在新的窗口,InfoBarMSnBrowser页面显示并帮助你分析MSn实验数据,TheInfoBarMSnBrowser,2.点击显示隐藏信息,1.如果MSnbrowser页面不显示任何数据，激活质谱图,3.可以双击得到平均（Average）或复合的质谱图(CompositeSpectrum),4.也可以右键选择Includeindividualscans,QualBrowserLayouts,2.保存Layout或将该Layout设置为默认格式,1.根据需要设定好cells,plots,integration等等。,3.选择Layout格式打开后续文件,放大,1.激活cell,2.平行X轴或Y轴拖动鼠标或在目标区域拖动成方框,将色谱图中某个峰取平均质谱图,1.激活质谱图,2.鼠标拖过对应色谱峰得到平均质谱图,3.AV告诉你几次扫描的平均(如：AV:7=七次扫描的平均质谱图),从色谱图中提取某个离子,1.激活色谱图,2.也可以直接鼠标拖过质谱峰得到鼠标拖动质量范围的EIC或者鼠标点击质谱峰得到该质量数的提取离子流图。窗口大小根据chromatogram里Ranges中MassTolerance的设定自动调整,右击Chromatogram-PeakDetection,1.右击chromatogram选择PeakDetection,2.选择ToggleDetectioninThisPlot或inAllPlots,3.InfoBar显示积分参数,右击Chromatogram-AutoFilter,AutoFilter可以自动显示scanfilters(目标物分析有用)，第一张图(上)没有任何ScanFilter。其他图对应在方法里设定的scanfilters(最多同时显示8张图),右击Chromatogram-ChromatogramRanges,1.右击chromatogram选择Ranges,右击Chromatogram-ChromatogramRanges,点击添加plots(最多8个),点击选择文件,改变检测器,积分算法和延迟时间,ChromatogramRangesScanFilter,点击向下箭头选择任何更加特定的ScanFilter,可以在此输入ScanFilter(如，Fullms,Fullms2,Fullms3等。依次逐个显示所有MS,MS2和MS3扫描)。layout可以保存为默认格式，这样即使scanranges改变,也没有必要改变ScanFilter。如果ScanFilter处是空白,将显示采集的所有扫描，不管是MS，还是MSn),ChromatogramRangesPlotTypes,1.点击更换Plottype,TIC每次Scan所有离子叠加的色谱图BasePeak每次Scan最强离子提取的色谱图BasePeak色谱图会使Fullms数据通常看起来更好一些，因为大量的噪音被去除,ChromatogramRangesExtractedIonChromatogram,1.Scanfilter选为Fullms或者删除Scanfilter查看所有Scan,3.在Range(s)框输入质量数或质量数范围。如果需要输入多个质量数，范围将根据Automaticprocessing里masstolerance的设定来决定,2.可以选择MassRange(TIC)或BasePeak,在ChromatogramRanges界面有多种方式可以提取离子,ChromatogramRangesNeutralFragment,1.删除Scanfilter,2.选择NeutralFragment,3.输入NeutralFragment质量数,NeutralFragmentPlottype将显示所有符合你设定中性丢失的碎片离子(从MS到MS2),ChromatogramRangesAutomaticProcessing,1.对色谱图施加平滑参数,平滑点数必须是奇数,右击Chromatogram-Display选项,1.右击chromatogram并选择DisplayOptions,Display选项可以修改色谱图显示外观(如Style,Color,Labels,Axis&Normalization),Xcalibur当前设定的显示结果,右击Spectrum-SpectrumList（质谱图列表）,SpectrumList包括质谱图中每个离子的m/z,绝对强度和相对强度,右击Spectrum-ScanHeader,ScanHeader允许查看信息如scanmode,ioninjectiontime,scantime等，和色谱上的每一次Scan相关联（使用主工具栏上的箭头浏览每次Scan的信息）,右击Spectrum-TuneandInstrumentMethods,Tune和Instrument方法包含在RawFile中。当选择InstrumentMethod，首先显示的是质谱方法，点击键盘上的向下键或主工具栏键浏览液相泵和自动进样器的方法,右击Spectrum-SpectralSubtraction,1.对目标峰取平均质谱图,2.右击spectrum选择SubtractSpectra-2Ranges,3.在该峰前后拖动鼠标选择被扣除的区域,右击Spectrum-SpectrumRanges,1.右击spectrum选择Ranges,右击Spectrum-SpectrumRanges,这里同样可以设定SubtractSpectrum,在图谱中添加备注,1.添加文本,点击Display，选择Annotate,2.输入备注文本框,3.点击激活的Cell添加该文本框,Chromatogram拷贝,1.到EditCopyCell拷贝当前激活的Cell,2.Cell可以贴到其他的Office程序(MicrosoftWord,Powerpoint,Excel,etc.),第十一章,定量处理流程,定量数据处理QuantitativeProcessing,1.数据处理方法建立ProcessingSetup,输入已知化合物用来识别设定峰检测/积分参数选择校准/质量控制类型，水平，重量选择先前色谱峰处理,定量处理建立,XcaliburHomepage点击ProcessingSetup按钮开始设置定量处理方法,定量选项,1.点击Options,3.选择LC,4.选择CalibrationOptions,5.选择实验是内标法还是外标法,2.点击ChromatographyBy,打开一个原始数据帮助建立定量处理方法,1.点击File,2.点击OpenRawFile,定量处理Identification,1.选择并输入组分名,2.选择Detectortype和PeakDetectionalgorithm积分算法,3.选择scanfilter和tracetype,4.点击OK更新chromatogram,Chromatogram根据scanfilter和tracetype更新,定量处理Identification,1.输入ExpectedRT(min),Window(sec)=组分洗脱允许的RT窗口范围,如果有内标，你可以把内标作为RTReference,*注:如果你使用的内标法,ISTD必须首先设定，因为其他目标组分要参考该内标。对于其他的组分,你可以选择Adjustusing并选择ISTD名称.,2.点击OK更新色谱图,定量处理Detection,1.点击Detection,2.改变积分参数得到满意的积分效果,3.点击OK更新色谱图,定量处理-Calibration内标建立,1.点击Calibration,2.选择ISTD,3.输入内标数量和单位，也可忽略不设此项,定量处理-Calibration目标物建立,1.选择Targetcompound,如果使用ISTD,在此选择内标,2.选择校正曲线的权重,3.对于校正曲线原点的处理,定量处理Levels,1.点击Levels,2.输入每个校正Level的名称,3.输入每个校正Level的具体量,4.输入每个质控QClevel的名称name，amount和%Test,CopyingLevelstoAllTargetCompounds,Levels页面只需输入一个目标组分的信息。右击并选择CopyLevelstoAllTargetComponents可以将Level的信息拷贝到其他组分,定量批处理,点击SequenceSetup按钮打开序列文件并在批处理前添加相关信息,打开序列并添加相关项,2.添加Level,ProcMeth和SampleType到序列中,1.点击Change并选择ColumnArrangement,在序列中添加相关信息,AddLevel,ProcMethandSampleTypecolumnsintosequence,在序列中设定ProcMeth,SampleType和Level,批处理定量数据,2.点击Quan,激活PeakDetection&Integration以及Quantitation,1.点击Actions并选择BatchReprocess,3.点击OK继续,在数据采集时添加定量处理选项,2.选择Quan,1.点击Actions并选择RunSequence,定量浏览器,在Xcalibur主界面点击QuanBrowser按钮查看定量处理数据结果,定量浏览器主界面,色谱图,校正曲线,选择查看结果的组分,可以显示Standards,QCs,Blanks,Unknowns四种样品类型,结果信息栏,更改结果显示条目,1.右击结果栏可以改变结果显示条目,可以改变每栏的显示次序,选择需要显示的条目,更改峰检测/积分参数,1.右击色谱图，可以改变峰检测和积分参数,3.将改变的参数应用到某个Plot还是所有的Plot,4.IntegrationType变成UserIntegration,2.改变设置(最常用的是Identification和Integration),手动更改积分,1.用鼠标拖动蓝色正方形积分图标,2.IntegrationType变为ManualIntegration,返回原积分(MethodSettings),1.如果你想将积分参数恢复到方法设定的初始状态，点击MethodSettings,2.IntegrationType可以恢复到MethodSettings,更改校正参数,1.右击calibrationcurve，改变校正参数,排除某个校正点,在此处也可去除校正曲线上某个点,去除校正曲线上某个点,右击校正曲线,Exclude一次去除一个校正点ExclusionList一次可以去除多个校正点,显示质谱图,右击calibrationcurve选择ShowSpectrumPlot，显示质谱图,将数据输出到Excel并打印,见下一页,将结果输出到Excel,打印报告,1.点击Enable,2.选择报告模板,3.选择样品文件,选择样品文件出报告,1.SampleChoice中选择需要出报告的样品文件(CTRL或SHIFT帮助选择多个样品),2.点击Add将选择的样品文件添加到SelectedSamples,Save,Insert,Use,1.可以在提交序列的时候添加报告,2.样品运行完出报告,第十二章,仪器维护,LTQ推荐维护程序,每日:检查convectron和离子规压力，确保真空系统正常；LTQ真空参数参考如下:Convectron压力:1-1.5Torr离子规压力:0.751.5x10-5Torr如果使用的是氮气钢瓶，检查氮气压力。LTQ的推荐压力介于80到120psi之间；检查石英毛细管。确保石英毛细管没有发生溶胀；如果需要可以切割毛细管喷雾的末端；检查HPLC溶剂；确保排废管路所接的废液瓶没有过多的废液；分析结束后，将仪器设置为Stand-By状态；,LTQ推荐维护程序,每周:检查机械泵泵油；如果有必要，添加机械泵泵油；打开机械泵振气阀，机械泵过滤器中油会自动回流到泵中；更换HPLC溶剂，可以降低仪器本底噪音；清洗石英毛细管；,LTQ推荐的维护程序,每月:检查氦气压力；LTQ氦气钢瓶的压力最好置于30到50psi之间；检查氮气钢瓶压力是否符合需要；如果必要，更换石英毛细管；用MRFA溶液校正LTQ电子倍增器(每隔一到两个月校正一次)；,LTQ推荐的维护程序,每季度:校正LTQ。校正后：-清洗或更换离子传输管；-清洗APIstack；更换机械泵油；清洗仪器背部黑色的风扇过滤膜；备份数据；网上免费软件升级资源：-ThermoFisherScientificFastLCandLC/MSSupport,Notes:长期使用并运行很脏的样品需要经常清洗离子传输管和APIStack；如果更换离子传输管灵敏度也不能恢复,可以清洗APIStack；彻底清洗APIstack,用甲醇和异丙醇擦洗tubelens和skimmer；不要在酸性溶液中超声tubelens和Skimmer！清洗完APIStack调谐仪器(可选)；,LTQ推荐的维护程序,维护:APIStack清洁,首先将仪器设为StandBy状态；关闭电子开关和总电源开关；取出APIstack；依次取出skimmer和tubelens；,APIStack从后面看(skimmer和tubelens已经去除),SkimmerLensandTubeLens(FrontView),skimmerlens,tubelens,TubeLens(InAPIStack),TubeLens,Skimmer(在TubeLens之后放入APIStack),将APIstack放回仪器；打开主电源开关,等待然后打开电子开关；,Skimmer,提供前级真空(ca.1torr),支持高真空泵。低维护需要故障多数是由于泵油引起的很多样品溶解在泵油中会变成有害物,机械泵(前级泵),三抽口的分子涡轮泵（400L/s,300L/s,25L/s）提供工作真空(1mtorr到1ntorr)高速气体涡轮以及转子(转动叶片)和定子(固定的)旋转促使分子通过刀片系统有永久性的密封泵不需要更换泵油,分子涡轮泵,分子涡轮泵,低真空检测工作原理是惠斯顿电桥(Rg是电热调节器)耐用低消耗Convectrongauge用宽动态范围的运算放大器代替电阻器*Convectron是Granville-Phillips的注册商标,PiraniorConvectronGauge,IonGauge,高真空检测昂贵的Outgasing用来驱散污染物离子在灯丝处形成，被引向收集器(collector)离子撞击栅格（grid产)生电流,附录1气体和溶剂,氮气:Highpurity(99%)氮气气体压力：690140kPa(10020psi),0.40.6MPa氦气:Ultra-highpurity(99.995%)，超高纯氦气(99.995%)气体压力：13570kPa(2010psi),0.15Mpa,附录2仪器状态指示器,在质谱仪前面板上的右上角装置有6个指示灯,Power,Vacuum,Communication,System,Scan,绿色：供给真空系统和电子组件的电压,灯黄色：涡轮分子泵转速在75