第十章_花粉培养

第三章植物主要组织培养方法,第一节植物离体无性繁殖第二节无病毒植物培养第三节植物花药和花粉培养第四节植物胚胎培养,第三节植物花药和花粉培养,思考：,蜜蜂采蜜采的是雄蕊还是雌蕊，为什么？为什么自然界代单倍体的产生方式是以孤雌生殖为主，而离体培养产生单倍体则是以“孤雄生殖”为主？,本节内容,一、植物花药（粉）培养的概念及意义二、培养材料的选取与制备三、花粉植株再生四、单倍体植株鉴定和染色体加倍,一、植物花药（粉）培养的概念及意义,（一）单倍体及其在育种中的应用1.单倍体的概念2.单倍体在育种中的应用3.单倍体产生的途径（二）花药（粉）培养的概念（本节重点）,在体细胞中只有配子染色体数目的个体称为单倍体。（2nn）1）eg:正常个体单倍体水稻2n2x24n12马铃薯2n4x48n24小麦2n6x42n21区别：单倍体一倍体,1、单倍体：,单倍体育种,利用单性生殖或诱变等方法，获得植物单倍体个体，再通过染色体加倍，形成纯合的二倍体，再根据育种目标育成新品种的育种方法。,2.单倍体在育种中的应用：（1）缩短育种年限,加快育种进程,大大缩短育种周期。,eg：a高产B抗旱ABaBAABBAaBBaaBBAABBaaBB1:2:11：1,A,a,B,B,单倍体诱导,有性繁育,杂交育种固定性状，获得等基因纯系若采用单倍体培养加速杂合体纯合化,以水稻为例：,810年,23年,eg:F1AaBb,（2）提高目标基因型的频率：,Ab,aB,ab,Ab,aB,ab,AAbb,AB,AB,AaBb,Aabb,AABb,AaBb,aaBB,aaBb,AaBB,Aabb,aaBb,aabb,AaBb,AABb,AaBB,AaBb,AABB,以水稻为例：2n=24,则纯合基因的频率如下：杂交育种单倍体育种1/167777161/4096,2n,n,如：F1(Aa)自交1/4AA+1/2Aa+1/4aaF1(Aa)单倍体加倍1/2AA+1/2aa,3.单倍体产生的途径,自然产生单倍体人工诱发产生单倍体,（1）自发形成的单倍体：（频率1010）i、孤雌生殖：未受精卵细胞单倍体ii、孤雄生殖：eg：金鱼草、烟草iii、无融合生殖：助细胞单倍体反足细胞单倍体,-5,-4,蜜蜂、蚜虫的卵细胞可以直接发育成新个体（孤雌生殖）,蜜蜂比较特殊，雌性蜜蜂是受精卵孵化成的，而雄蜂则是未受精卵孵化成的，也就是说需要有雄蜂才能生出雌蜂，而只有雌蜂本身就能生出雄蜂来。雌蜂则根据喂养的方式分别长成蜂王和工蜂。,在自然界，动物的孤雄生殖几乎是不存在的。主要是植物的孤雄生殖。,（2）人工诱导单倍体：,辐射诱导：利用放射性同位素、离子束（X、射线）和紫外线照射处理花粉后授粉，诱导雌核发育成单倍体，如甜瓜单倍体。另，太空育种。化学诱导：用二甲亚砜，萘乙酸、马来酰肼、秋水仙素等可诱导孤雌生殖而产生单倍体。去雄后延迟授粉也能提高单倍体的发生频率。,远缘杂交：授以异种、属的远缘花粉，虽其不能与卵受精，但可刺激卵细胞开始分裂并发育成胚，进一步形成单倍体植株。利用杂交后亲本配子无法融合的现象淘汰一个亲本；使染色体有选择地消失，获得单倍体。（普通大麦x球茎大麦、小麦x玉米）剥离未受精子房及胚珠培养；花药培养及花粉粒培养,太空育种：,也称空间诱变育种，就是将农作物种子或试管种苗送到太空，利用太空特殊的、地面无法模拟的环境(高真空，宇宙高能离子辐射，宇宙磁场、高洁净)的诱变作用，使种子产生变异，再返回地面选育新种子、新材料，培育新品种的作物育种新技术。太空育种具有有益的变异多、变幅大、稳定快，以及高产、优质、早熟、抗病力强等特点。其变异率较普通诱变育种高3-4倍，育种周期较杂交育种缩短约1倍，由8年左右缩短至4年左右。,太空育种是集航天技术、生物技术和农业育种技术于一体的农业育种新途径。是当今世界农业领域中最尖端的科学技术课题之一，通过已进行的太空农业试验，植物、动物等生物体的许多特性奥秘被揭示。目前，世界上只有美国、俄罗斯、中国三个国家拥有返回式卫星技术。在这方面，中国走在世界前列。太空育种成果自1987年以来，我国利用返回式卫星和神舟飞船，先后进行了10多次搭载，有1000多个品种的种子和生物材料上天。,由于植物种子体积小，携带方便，在选育新品种方面具有较大的选择空间。已进行搭载的有粮食作物类：小麦、水稻、大豆、玉米、绿豆、豌豆、高粱等；蔬菜类：西红柿、辣椒、黄瓜、甜菜、茄子、萝卜等；经济作物有棉花、烟草等；花卉有万寿菊、鸡冠花、三色槿、龙葵、荷花、百合等；中草药材有黄芪、甘草；树木种子有油松、白皮松及石刁柏，还有草坪种子。,在高等植物中，所有单倍体几乎都是由于生殖过程不正常产生的，如孤雌生殖、孤雄生殖等。在自然界，大部分单倍体是孤雌生殖形成的，人工单倍体多数是通过花药的离体培养而得到的。,花粉和花药培养,指离体培养花药和花粉，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株并使之二倍化的细胞工程技术。,植物的世代交替Alternationofgeneration,无性世代,有性世代,明确几个概念,配子体世代（有性世代）、配子体孢子体世代（无性世代）、孢子体花粉孢子体（花粉）孢子体的第一个原始细胞（花粉）孢子体的第一次有丝分裂,形成配子并进行繁殖的世代称为配子世代，配子世代的生物体称为配子体。一般来说，植物配子体为单倍体（n）。,花粉原来的发育途径（配子体途径）,幼嫩细胞,孢原细胞,初生周缘层,造孢细胞,花粉母细胞,纤维层（药室内壁）,中层（逐渐消失）,绒毡层（逐渐消失）,平周分裂,1,1,花粉母细胞（小孢子母细胞）,花粉母细胞减数分裂过程（单子叶植物）,花粉母细胞,四分体,减数分裂,单核花粉粒,1,4,1花粉母细胞,4个小孢子,减数,有丝,4个花粉管细胞核,4个生殖细胞核,有丝分裂,8个精子,分裂,分裂,孢子体,产生孢子进行无性生殖的世代称为孢子体世代，这个世代的生物体称为孢子体。合子胚幼小植株（孢子体）花粉花粉胚花粉植株（花粉孢子体）花粉愈伤,合子是产生孢子体的第一个原始细胞花粉是产生花粉孢子体的第一个原始细胞,花粉形成花粉胚或花粉愈伤组织的第一次有丝分裂称为花粉孢子体第一次有丝分裂。花粉形成花粉植株的途径即花粉孢子体途径。,二、培养材料的选取与制备,（一）材料选择（二）预处理（三）外植体制备及接种,（一）材料选择,基因型的选择（表61）水稻花药培养力（愈伤组织诱导和绿苗分化率）糯型（粳籼）杂种粳型籼型杂交稻籼型2.花粉发育时期的选择（表62、63）并不是任何发育时期的花粉都可直接诱导产生愈伤组织或胚状体，选择发育到特定时期花粉的材料进行培养是成功的关键。,确定取材时间选择大致处于所需要花粉发育时期的花蕾。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。,在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜，在外部形态上可根据叶枕距为5-15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件鉴定。,3.生理状态的选择,花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率也有直接影响。比如大田栽培还是温室栽培植株的花药；是主茎穗还是分蘖穗的花药。水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高。,选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝的花蕾发育良好，数量大，发育同步。操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。,低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率以1-5预低温处理小麦小穗，能提高花粉愈伤组织的产量。在4下冷冻石刁柏花蕾，预处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。各种植物要求预处理的温度和时间不同。,（二）预处理,（三）外植体制备及接种,花药和花粉培养中的表面灭菌通常先用70乙醇浸润花蕾30S左右，然后在饱和漂白粉溶液（上清液）中浸泡1020min，或在0.1氯化汞溶液中处理510分钟，之后用无菌水漂洗35次。,花药材料的选取关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。,花粉培养,选幼年树花蕾,三、花粉植株再生,1.在离体培养条件下，小孢子发生脱分化，改变原来的发育途径，通过器官发生型和胚状体发生型再生成完整植株。2.离体小孢子发育途径（A、B、C)3.花粉的脱分化培养方法,1.花粉植株的再生途径,器官发生途径胚状体发生途径,花粉孢子体起始于花粉营养细胞（营养核）；营养核第一次有丝分裂即花粉孢子体第一次有丝分裂。,1.小孢子细胞途径A发育示意图,2.小孢子细胞途径B发育示意图,花粉孢子体起始于花粉营养细胞（营养核）,3.小孢子细胞途径C发育示意图,花粉孢子体起始于花粉营养营养核和生殖核。,3.花粉的脱分化培养方法,液体培养双层培养分步培养（花粉自然散落）条件培养基培养（培养过花药的液体）看护培养微室培养,四、单倍体植株鉴定和染色体加倍,花药和花粉培养的主要目的是制备单倍体，但其再生植株并不都是单倍体，有单倍体、二倍体、多倍体和非整倍体，因此，必须对获得的花药和花粉植株进行倍性鉴定。,鉴定方法,1.形态鉴定2.结实性鉴定3.染色体数目鉴定4.遗传标记鉴定129,花药（粉）单倍体植株的染色体加倍,秋水仙素加倍的原理：秋水仙是从百合科植物秋水仙的种子和其它器官中提取出来的一种生物碱。溶于水、酒精、甲醛等。当秋水仙素渗入植物正在分裂的细胞时，能抑制纺锤体的形成，导致染色体不分离，从而引起染色体加倍。染色体数目加倍的细胞继续进行正常的有丝分裂，将来就可以发育成多倍体植株。典型的例子有三倍体无子西瓜和甜菜，八倍体黑小麦等。,秋水仙素加倍方法（禾本科）,用0.020.4秋水仙素处理花药和花粉单倍体植株，处理方式和部位随植物种类而异，禾本科植物的处理应在分蘖期进行，将分蘖节以下部分浸泡在0.1左右秋水仙素溶液中23天。处理后用流水冲洗半小时，然后栽入土中，以后从结实获得的植株中鉴定出加倍材料。,秋水仙素加倍方法（木本）,用浸透0.10