活性维生素D3对UUO大鼠肾间质TGFβ1Smads信号轴核酸表达的影响

学校代码：10114 分 类 号： 硕 士 学 位 论 文 活性维生素D3对UUO大鼠肾间质TGF-1/Smads 信号轴核酸表达的影响 研 究 生：李 素 仙 指导教师：马 宏 专业名称：儿 科 学 研究方向：小儿肾脏病 学位类型：科学学位 所在学院：第一临床医学院 中国 山西 二一三年四月 山西医科大学硕士学位论文 2 分类号： 单位代码10114 密 级： 学 号：201010194 活性维生素D3对UUO大鼠肾间质 TGF-1/Smads信号轴核酸表达的影响 研 究 生： 李 素 仙 指 导 教 师： 马 宏 学 位 类 型： 科学学位 专 业 名 称： 儿 科 学 研 究 方 向： 小儿肾脏病 所 在 学 院： 第一临床医学院 二一三年四月学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本文独立完成的研究成果。文中任何引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： 1、交回学校授予的学位证书； 2、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉。 4、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 日期： 年 月 日 指导教师签名： 日期： 年 月 日 （本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用） 目 录 缩略词简表1 中文摘要2 英文摘要4 前 言7 正 文9 1.材料方法9 2.结 果15 3.讨 论24 4.结 论30 5.参考文献31 综 述33 1.正 文33 2.参考文献44 发表文章48 个人情况49 致 谢50山西医科大学硕士学位论文 1 缩 略 词 简 表 缩写 英文全称 中文全称 RIF renal interstitial fibrosis 肾间质纤维化 1,25-(OH)2D3 1,25-dihydroxyvitamin D3 活性维生素D3 UUO unilateral ureteral obstruction 单侧输尿管梗阻 TGF-1 Transforming growth factor-1 转化生长因子1 VDR Vitamin D Receptor 维生素D受体 ESRD End stage of renal disease 终末期肾脏疾病 ECM extracellular matrix 细胞外基质 RAS renin-angiotensin system 肾素-血管紧张素系统 EMT epithelial-mesenchymal transformation 上皮细胞间充质细胞转变 HGF hepatocyte growth factor 肝细胞生长因子 IGF-1 insulin-like growth factor 胰岛素样生长因子-1 BMP-7 bone morphogenetic protein-7 骨形态发生蛋白-7 CTGF connective tissue growth factor 结缔组织生长因子 PDGF platelet-derived growth factor 促血小板源性生长因子 TNF- tumour necrosis factor 肿瘤坏死因子 VEGF vascular endothelial growth factor 血管内皮生长因子 LN laminin 层粘连蛋白 NF-B nuclear factor-B 核因子-B MMP-9 matrix metallo proteinase-9 基质金属蛋白酶-9 山西医科大学硕士学位论文 2 活性维生素D3对UUO大鼠肾间质 TGF-1/Smads信号轴核酸表达的影响 摘要 目的：肾小管间质纤维化是大多数肾脏疾病发展致终末期肾衰的共同病理特征之一。转化生长因子-1(TGF-1)作为重要的致纤维化因子，在肾小球疾病和肾小管间质病变发生和发展过程中发挥着重要的作用。1,25-(OH)2D3是体内维生素D分别经过肝、肾羟化作用后的活性形式，除具有经典的调节钙磷代谢和骨矿化作用外，其在肾组织中还具有阻止上皮细胞向间质转分化、抑制炎症反应、抑制肾素血管紧张素系统和改善胰岛素抵抗等作用。本实验通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法，检测单侧输尿管结扎所致的幼年大鼠肾间质纤维化（UUO）模型中TGF-1、Smad3、Smad7的mRNA表达趋势及所测各指标间的相关性，以及应用活性维生素D3干预后各指标的变化情况，并评价活性维生素D3对肾间质纤维化的保护作用。 方法：选取3-4周龄幼年SD雄性大鼠54只，随机均分为三组，分别为假手术组、UUO模型组、活性维生素D3干预组，每组各18只，模型组和干预组采用单侧输尿管结扎法制备肾间质纤维化模型，假手术组只分离不结扎输尿管。术后第一天起，干预组给予活性维生素D3(0.1ug/kgd)溶于0.2ml花生油中灌胃，假手术组和模型组给予等量花生油灌胃，灌胃满3、7、14天后每组随机选取6只大鼠处死，留取左肾组织，采用RT-PCR法检测各组肾组织中TGF-1、Smad3、Smad7的mRNA表达趋势，所有实验数据以Xs表示，采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。 结果: 1.采用单侧输尿管结扎术制备肾间质纤维化模型成功，结扎侧肾脏体积明显变大，皮质变薄。2.采用RT-PCR法检测各组各时间点肾组织中TGF-1、Smad3、Smad7的mRNA表达情况：假手术组：TGF-1 和Smad3 mRNA仅有少量基础山西医科大学硕士学位论文 3 表达，Smad7 mRNA 有丰富的表达，各时间点组内比较差异均无统计学意义（P0.05）。UUO模型组：随着梗阻时间的延长，肾组织中TGF-1 和Smad3 mRNA表达显著性增加，Smad7 mRNA表达逐渐减少，组内各时间点比较差异有显著性（P0.01）；与假手术组相比，肾组织TGF-1和Smad3 mRNA的表达有所增加，Smad7 mRNA 的表达有所减少，同时间点组间比较差异有显著性（P0.01）。活性维生素D3干预组：随着梗阻时间的延长，TGF-1 mRNA、Smad3 mRNA的表达逐渐减少，而Smad7 mRNA的表达呈增高趋势，组内各时间点比较差异有显著性（P0.01）；TGF-1 mRNA、Smad3 mRNA的表达仍高于假手术组，低于UUO模型组，而Smad7 mRNA的表达低于假手术组，高于UUO模型组，组间同时间点相比差异有显著性(P0.01)。3.相关性分析：UUO模型组中Smad3 与 TGF-1成正相关关系（r=0.927）；Smad7 与 TGF-1比成负相关关系（r=-0.960）；Smad3与Smad7成负相关关系（r=-0.924）。 结论：1.在幼年大鼠肾间质损伤过程中，TGF-1/Smads 信号通路可能具有重要调控作用，其中TGF-1、Smad3起促进损伤作用，而Smad7具有损伤保护作用。2.活性维生素D3可能从核酸水平通过下调肾组织中Smad3和同时上调Smad7的表达，抑制TGF-1的产生，缓解肾间质纤维化的进展。 关键词：活性维生素D3；转化生长因子-1；肾间质纤维化；单侧输尿管梗阻； Smads 山西医科大学硕士学位论文 4 Effects of 1,25-dihydroxy vitamin D3 on TGF-1/Smads signaling axis mRNA expression in rats with renal interstitial obstruction ABSTRACT Objective Renal tubular interstitial fibrosis process is one of the common pathological features in end-stage renal failure of the most kidney disease. TGF-1, the important cause of fibrosis factor, plays an important role in the occurrence and development of glomerular disease and renal tubular interstitial lesions. 1,25-dihydroxyvitamin D3, the biologically active metabolite of vitamin D3 after liver and kidney metabolism activity, not only regulates calcium and phosphorus metabolism, but also has other important biological effects in the kidney. This is a research to investigate the expression and correlation of mRNA in the course of tubulointerstitial fibrosis in kidneys of young rats with unilateral ureteral obstruction (UUO) about TGF-1, Smad3 and Smad7, meanwhile to determine the renal potential mechanisms of 1,25-dihydroxyvitamin D3 after the treatment. Methods A total of fifty-four male SD rats aged 3 to 4 weeks were served as experiment models. They were randomly divided into three groups: the sham operation group (n=18), the model group after UUO (n=18) and 1,25-dihydroxyvitamin D3-treated group after UUO(n=18), in the latter of two of which the left urethral ligation was performed to construct unilateral ureteral obstruction model (UUO). In addition, rats in the 1,25-dihydroxyvitamin D3-treated group received 1,25-dihydroxyvitamin D3 intragastric feeding (0.1ug/kgd) which was dissolved in peanut oil, while the sham operation group and model group after UUO were given the same amount of peanut 山西医科大学硕士学位论文 5 oil. The expression level of TGF-1 mRNA, Smad3 mRNA and Smad7 mRNA were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) at the 3rd, 7th and 14th days after experiments. All the datas of experiment were analyzed by statistics software SPSS17.0. Results (1) All production models with unilateral ureteral ligation were successful. The volume of obstruction side kidney was increased obviously, and the renal cortical was thinner than the right kidney. (2) The mRNA expression of TGF-1, Smad3 and Smad7 in renal tissues of rats in different groups: In the sham group, TGF-1 mRNA and Smad3 mRNA were expressed slightly, while Smad7 mRNA was rich in expression. There was no difference in all time points. In UUO model untreated group, along with the extension of the times, the expression of TGF-1 mRNA and Smad3 mRNA were dramatically increased, while Smad7 mRNA was decreased. Compared with the sham operation group, that had shown the more marked expression of TGF-1 mRNA and Smad3 mRNA yet attenuated Smad7 express in the sa