细菌接种实验报告

1 / 12 细菌接种实验报告 环工综合实验 细菌的分离纯化和接种实验 实验报告 环境科学与工程学院实验中心 动物微生物及免疫学实验报告 一、实验目的 掌握一般培养基的制备原理及要求，掌握培养基酸碱度的测定，熟悉一 般培养基的制备过程和各种器皿灭菌方法。 掌握细菌分离培养的基本要领和方法，掌握细菌抹片的制备方法和革兰 氏染色法及油镜的使用方法，并认识革兰氏染色的反应特性。 掌握学习用 微生物学原理诊断疾病的一般方法及步骤。 二、实验用品 器材 量筒、烧杯、电子天平、漏斗、三角烧瓶、空试剂瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、 pH 试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试剂瓶瓶塞、扎绳、放大镜、包装纸、洗耳球、酒精灯、载玻片、火柴、吸水纸、剪刀、记号笔、接种环、2 / 12 注射器、镊子、钳子、毫米尺、培养箱、水浴培养箱、高压蒸汽灭菌锅、油镜 试剂及材料 肘胨、蛋白胨、猪胆盐、氯化钠、琼脂、乳糖、 %结晶紫水溶液、 %中性红水溶液、血清、胰化蛋白胨、酵母提取物、 氢氧化钠、盐酸、牛血清、革兰氏染色液、蒸馏水、小白鼠、病猪内脏 三、实验步骤 培养基的制备 1、麦康凯培养基 组成：蛋白胨 17g、肘胨 3g、猪胆盐 5g、氯化钠 5g、琼脂 17g、乳糖 10g、 %结晶紫水溶液 10ml、 %中性红水溶液 5ml、蒸馏水 1000ml 方法：将蛋白胨、肘胨、猪胆盐和氯化钠溶解于 400ml蒸馏水中，调节 pH 至。将琼脂加入 600ml 蒸馏水中，并加入乳糖，加热熔化。将两 液混合，分装于烧瓶内，用纱 布、扎绳等捆好后，121高压灭菌 1530min。待冷却至 50 55时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后 3 / 12 倾注平板。 注：结晶紫和中性红水溶液配好后需经高压灭菌。 2、血清平板 组成：营养琼脂、牛血清 方法：将灭菌的营养琼脂加热熔化，冷却至 4550时，加入牛血清，并 混匀，倾注平板。 注：不得将牛血清一并加入后再灭菌。 3、 LB 培养基 组成：胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、氯 化钠 10g、琼脂 15g 方法：在 950ml 蒸馏水中加入胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂和氯化钠， 调节 pH 至，加热熔化，分装于瓶中，用纱布、扎绳等捆好后， 121高压灭菌 1530min。待冷却至 50 55时，倾注平板。 4、液体培养基 病料取材 在病猪死亡后，首先用显微镜检查其末梢血液膜片中是否有炭疽杆菌存在，未发现，则立即用消毒的器械对其进行生理解剖，观察其病理特征现象，取出病猪的十二指肠、胃、肝脏三处的组织物，并注意组织的完整性，用储物袋密4 / 12 封保 存。 细菌粗培养 1、消毒灭菌：操作人员先用消毒水清洗手或戴好实验手套，再用消毒水对无菌操作台内桌面及用酒精灯外焰对待用器械进行火焰灭菌。 2、接种 在无菌操作台酒精灯旁打开用储物袋密封保存的病料，先左手持镊子右 手持剪刀，把病料剪出一个小口。 右手持灭过菌的接种环，左手持平板，并用拇指、食指及中指将平皿揭 开约 20 左右，然后将接种环前端插入小口旋转一下后，再用划线接种的方法接种到一个血清平板上。 用记号笔在平板 底部作好日期、操作人员、部位等标记，并将平板倒放。 以此方法，分别接种十二指肠、胃粘膜、肝脏于血清平板上，各接种 2 个血清平板。 3、培养：将接种好的血清平板倒扣放入 37培养箱中，反向培养 24 小时。 注：划线接种时尽量划开，以保证长出单个菌落，且划线时接种环应尽量倾斜，以免划破培养基；待接种完毕后熄灭无菌操作台内酒精灯，关闭好无菌操作台窗口，打开无菌操作台内的紫外灯。 。 5 / 12 细菌纯培养 1、菌落特征判断 待粗培养的细菌培养 24 小时后，取出用放大镜观察记录单个小菌落的形态特征并用实验报告纸记录好，并在平板底部上做好观察标记，其形态特征包括大小、形状、菌落边缘、表面构造、隆起度、湿润度、透明度、颜色等。 2、取单个菌落进行革兰氏染色镜检 取干净的载玻片，用记号笔在其一面做好正反面标记，再在载玻片另一 面中央滴上一小滴蒸馏水。 将接种环在火焰上灭菌，待冷却后，在酒精灯旁从标记的单个小菌落中 取少许细菌置于蒸馏水中混匀，用接种环涂成直径约的菌膜，再在酒精灯火焰上方以钟摆速度通过固定好细菌，待冷却进行染色 。 先滴加草酸结晶紫溶液染色 12min，再水洗；然后滴加革兰氏碘液溶液 染色 12min，再水洗；随后滴加 95%的酒精脱色3060s，再水洗；最后滴加稀释的品红进行复染 3060s，再水洗；待干燥或吸水纸吸干后镜检。 将干燥的载玻片放在 1000 倍油镜下，滴加一滴松柏油进行镜检，观察其 6 / 12 形态特征，判断细菌的种属。 3、细菌接种培养 消毒灭菌：操作人员先用消毒水清洗手或戴好实验手套，再用消毒水对 无菌操作台内桌面及用酒精灯外 焰对待用器械进行火焰灭菌。 接种：右手持灭过菌的接种环，左手持平板，并用拇指、食指及中指将 平皿揭开约 20 左右，然后将接种环插入揭开的平板口内蘸去一下镜检标记的小菌落，再用划线接种的方法接种到一个血清平板、 LB 平板或麦康凯平板上。并用记号笔在平板底部作好日期、操作人员、菌种、部位等标记，将平板倒放。 将接种好的平板倒扣放入 37培养箱中，反向培养24 小时。 注：油镜用完后应立即清理物镜上的松柏油；划线接种时尽量划开，以保证长出单个菌落；待接种完毕后熄灭无菌操作 台内酒精灯，关闭好无菌操作台窗口，打开无菌操作台内的紫外灯。 。 菌液的制备 1、镜检：用革兰氏染色法在 1000 倍油镜下镜检，观察并记录是否为纯培养的细菌。 7 / 12 2、分装液体培养基：先对无菌操作台及需要使用的器械进行消毒灭菌，然后用钳子揭开一个空试剂瓶，用倾倒的方法在酒精灯旁从液体培养基大试剂瓶中分装于空试剂瓶内，并立即盖上液体培养基大试剂瓶瓶塞。 3、接种：右手持接种环，用火焰对其进行灭菌，待冷却后，取出纯培养的平板，在无菌操作台内酒精灯旁，蘸去少许细菌，左手倾斜液体培养基，将接种环，伸入液体培养基内搅动，然后取出对接种火焰环灭菌，并用灭菌的包装纸捆绑好后，用记号笔做好相应标记，置于一旁。 4、培养摇菌：将接种好的液体培养基置于水浴培养箱中培养 24 小时。 注：分装一个培养基就接种一个培养基，不得全部分装完后再一个一个接种。 小鼠致病性实验 1、保定：选择健康的青壮年小白鼠，先用右手抓住尾巴，旋转数周让其眩晕，然后用左 手的拇指和食指捏住两耳及头部皮肤，并翻转左手，使其头部朝下，以达到内脏前移的目的。 2、接种：先用酒精棉球蘸取酒精对注射部位擦洗消毒，再用注射器注射吸取菌液注射于小白鼠腹腔中。 3、观察：将接种的小白鼠放在适宜的环境下生活，并在鼠笼处用记号笔标记好接种时间、菌种等。 4、再培养鉴定：待小白鼠死亡后，对其进行解剖，8 / 12 观察其内脏病变情况，并取肝脏直接涂在相应培养基上，在适宜条件下反向培养 24 小时后，取菌落细菌进行镜检观察判断。 注：在注射小白鼠 2 小时候需要观察小白鼠 是否因注射时伤害到内脏而死亡。 生化试验 2016 级制药专业 工业微生物学实验报告 姓名 : 刘甜甜学号 : 2016304090 班级 : 制药 12-2 班 指导老师：王健 日期： 一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌 K-B 药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌 Gram s stain 染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 9 / 12 实验原理：染色原理： G+菌与 G 菌细胞壁不同， G+菌比 G 菌细胞内核糖核酸镁盐含量高， G+ 菌比 G 等电点低。 实验步骤： 制片： 1 涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混 匀，均匀涂布约 1cm2 大小，自然干燥； 固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 染色：初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持 30 40 ,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； 媒染：取卢氏碘液 12 滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持 30 40 ,用上法细流水冲洗； 脱色：取 95%酒精 23 滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可 , 用上法细流水冲洗； 复染：取 1： 10 稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水 冲洗； 吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜下。 三、分离培养 1 实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面10 / 12 通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这 些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。 2 实验步骤 示教：观察普通平板、麦 康凯平板、血平板、四区分离划线平板，手机摄像。 分离划线培养： 预实验：以灭菌接种环与普通平板背面做四区分离划线； 正式试验： 1 以灭菌接种环取细菌少许，在普通平板上划线，划线区域约占整个平板的 1/101/5,划线间不能有交叉现象； 2 以灭菌接种环自第一区 23 个交叉，然后依次分离划线，约占整个区域的 1/31/4； 3 依上法进行 3、 4 区分离划线； 4 倒置平皿置 37温箱培养 24h，观察记录实验结果，手机摄像。 四、细菌初步生化反应： 1 实验原理：具有的细菌，能催化过 氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。 2 实验步骤 色素试验：取滤纸条，两次对折，以折角小心取菌落少许，小心展开，观察记录，手机拍照； 氧化酶试验：取上述含菌滤纸条，滴加氧化酶试剂一滴，观察记录，手机拍照； 触酶试验：以灭菌接种环取细菌少许，置一洁净玻片表面，另设 NS 对照，各加一滴新11 / 12 制的 3%H2O2, 观察记录，手机拍照； 五、细菌药敏试验： 1 实验原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取平板中的水分溶解后并不 断先向纸片周围扩散，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反应测试细菌对测定药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的 MIC 呈负相关。 2 实验步骤： 2. 1 以灭菌接种环取细菌少许，与普通平板做密集划线； 以无齿镊小心夹取定量药效纸片，按六边形贴于培养及表面，倒置平皿置 37温箱培养 24h，观察记录实验结果，手机拍照。 3 实验结果： 六实验分析与讨论 1 无菌操作：所有取菌种前都要将接种环灭菌，取菌时培养基 也不能开太大的口，取完以后应及时盖好并放好，以防止菌种被污染。操作应当在火焰旁做。 2 冷却操作：加热灭菌接种环后，应室温下冷却，否则会因高温杀死细菌。 3 接种操作时应当执笔式握接种环，轻轻触碰菌种，再接种到有生理盐水的玻