（临床兽医学专业论文）铅、镉对SD大鼠肾脏损伤及抗氧化剂拮抗作用的研究.pdf

摘要 铅、镉均为广泛分布于自然界的环境和工业污染物，可通过环境污染和职业 性暴露进入人和动物机体，对多种器官产生毒性作用，其中肾脏是铅、镉作用的 主要靶器官之一。研究发现自由基的大量产生与其导致的氧化应激是铅、镉毒性 损伤的生化和分子机理之一。本试验通过灌服染毒s d 大鼠和对原代培养肾小管上 皮细胞的染毒，同时添加抗氧化剂( n a c 、s e - m e t ) ，探讨铅、镉对肾脏的损伤及 抗氧化剂的拮抗作用。 1 为了研究铅、镉单独或联合慢性暴露引起s d 大鼠的氧化损伤和肾脏组织结 构变化，及抗氧化剂乙酰半胱氨酸( n a c ) 的保护作用，用不同剂量的铅、镉连 续灌服大鼠4 周，试验结束后测定肾脏和血浆s o d 、g s h - p 】【活性及m d a 含量， 观察肾脏组织学和超微结构变化。结果显示，与对照组比较，铅、镉单独染毒肾 脏和血浆s o d 、o s h p x 活性及m d a 含量均显著升高( p 0 5 ) ；铅、镉联合染毒， 血浆和肾脏s o d 、g s h - p x 的活性比对照组显著下降0 0 5 ) ，m d a 含量显著升 高0 0 5 ) ；添加n a c 组与铅、镉联合染毒比其血浆g s h p x 活性显著升高 ( p o 0 5 ) 。m d a 含量显著下降( p 0 0 5 ) ；组织学观察显示，铅、镉单独或联合染 毒均可导致肾小管管腔内蛋白渗出，管腔变窄甚至闭合，肾小管上皮细胞肿胀、 浑浊等病变，添加n a c 后，有肾小管管腔亦有蛋白渗出，肾小管上皮细胞肿胀和 肾小球体积缩小现象：超微结构显示染毒组肾脏线粒体形态不规则，体积膨胀， 基质混浊，脊突断裂或缺损，添加n a c 组线粒体形态基本完好，但基质浓密不清。 由此可见，脂质过氧化作用增强是铅、镉引起肾脏损伤的主要机制之一，可能也 是铅、镉引起肾脏组织病变的原因之一，n a c 能有效缓解铅、镉引起的氧化损伤， 但对肾脏组织结构的损伤无明显的保护作用。 2 为了揭示铅、镉对肾小管上皮细胞凋亡率和细胞内活性氧水平的影响，本研 究在建立了原代培养肾小管上皮细胞的基础上，用不同浓度铅、镉染毒1 2 h ，同时 设s e m e t 拮抗组，流式细胞仪检测细胞内活性氧水平和细胞凋亡率。结果显示， 低浓度( 1 0 t t m o l l ) 的铅、镉单独染毒组细胞内活性氧水平低于对照组；中 ( 2 0 t a m o l l ) 、高( 4 0 p _ l n o l l ) 浓度组细胞活性氧水平均显著高于对照组；铅镉联 合组细胞活性氧水平均明显高于对照组；s c m e t 能明显降低低浓度铅镉( 5 t a n o f l + 5 1 j n o f l ) 联合染毒组细胞内活性氧水平，对中( 1 0 t t m o l l + 1 0 t t m o f l ) 、高 ( 2 0 9 t m o f l + 2 0 1 a n o l l ) 浓度铅镉联合组细胞活性氧水平无明显影响；铅、镉单 独染毒时，所有组细胞凋亡率均显著高于对照组，且细胞凋亡率随浓度升高而先 升高后下降，而坏死率则随浓度升高而增加。添加s e - m e t 能有效拮抗铅、镉联合 染毒细胞的凋亡率，但随着铅、镉浓度增加，拮抗的效果随之减弱。 本研究结果证实了铅、镉染毒后引起的活性氧增加和导致的氧化应激，是铅、 镉对肾脏毒性损伤的重要机理之一，抗氧化剂在一定范围内能有效拮抗铅、镉引 起的氧化应激，但对铅、镉引起的组织损伤无明显的保护作用。 关键词：镉；铅；抗氧化剂；氧化应激；细胞凋亡 a b s t r a c t l e a d ( p b ) a n dc a d m i u m ( c d ) a r cb o t hw i d e l ys p r e a de n v i r o n m e n t a la n di n d u s t r i a l p o l l u t a n t st h a ta f f e ：c - tv a r i o u so p g a l l si nh u m a n sa n da - r i m a l $ t h r o u g ho c c u p a t i o n a la n d e n v i r o n m e n t a le x p o s u r e ab o d yo fe v i d e n c ea c c u m u l a t e di m p l i c a t i n gt h ef r e er a d i c a l g e n e r a t i o nw i t hs u b s e q u e n to x i d a t i v es t r e s si s t h eb i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a r m e c h a n i s m so fp ba n dc dt o x i c i t y w bc a r r i e do u tt h i ss t u d yt oi n v e s t i g a t et h e m e c h a n i s m so f c da n dp bp o i s o n i n g ，a n dt h ep r o t e c t i v ee f f e c t so f a n t i o x i d a n t s i ne x p e r i m e n t a lr a t s ，o r a l l ya d m i n i s t r a t i o no fc da n dp bt o r a t sf o rf o u rw e e k s m e a n w h i l ec o - a d m i n i s t r a t e do f n a ca n dp b 、c da sp r o t e c t i v eg r o u p 1 1 a c t i v i t yo f s o d 、g s h - p xa n dm d ac o n t e n tw e r em e a s u r e d a n dh i s t o l o g i c a ls t r u c t u r eo fk i d n e y w a $ a n a l y s e d 1 r t 圮r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo fs o d 、g s h - p xa n dm d a c o n t e n t b o t hi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yf p o 0 5 ) i np bo rc d - t r e a t e dg r o u pc o m p a r e dw i t hc o n t r o l g r o u p ；t h ea c t i v i t yo fs o d 、g s h - p xd e c r e a s e dn o t a b l y ( p o 0 s ) ，a n dt h em d a c o n t e n t i n c r e a s e dc o n s i d e r a b l yf p o 0 5 ) i nc da n dp bc o - t r e a t e dg r o u p 。a sc o m p a r e dt oc o n t r o l g r o u p ：c o a d m i n i s t r a t e do f n a cw i t h p b 、c dl e a d st op r o n o u n c e di n c r e a s ei ng s h p x a c t i v i t y ( p 一o 0 5 ) a n dr e m a r k a b l y 妇髂ei nm d ac o n t e n t , c o m p a r e dt op ba n dc a t r e a t e dg r o u p ( p o 0 5 ) ；t h eh i s t o p a t h o l o g i c a ls t u d i e ss h o w e dt h a tp ba n dc de x p o s u r e r e s p e c t i v e l yo rc o m b i n e db o t hc a u s e ds e v e r ed a i n a g et ot h ea r c h i t e c t u r eo fr e n a la n d r e n a lc e l l s ，n a cd i d n tp r e s e r v e dt h i sl e s i o n t oe l u c i d a t et h ee f f c t so fp ba n dc do na p o p t o t i cr a t e sa n di n t r a c e l l u l a rr o sl e v e i o fr t e c s w ep r i m a r yc u l t u r e dr t e c s t h e nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fp b z + a n dc d ” i n c u b a t e dw i t hr t e c sf o r1 2 h s e - m e tc o i n c u b a t i o nw i t hp ba n dc da sp r o t e c t i v e g r o u p s a f t e ri n c u b a t i o n , f c ma s s e s s e dt h el e v e lo fi n t r a c e l l u l a rl sl e v e la n d a p o p t o f i cm 把so fr t e c s u s i n gf l u o r e s c e n tp r o b ed h r l 2 3a n da n n e x i nv - p ia s s a y l mr e s p e c t i v e l y 1 1 ”r e s u l t ss h o w e dt h a t ：l o wc o n c e n t r a t i o n so fc 酽a n dp b z + d e c r e a s e di n t r a c e l l u l a rr o sl e v e l a n dm i d e m na n dh i g hc o n c e n t r a t i o n ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e di t i np ba n dc dc o m b i n c dp o i s o n e dg r o u p s r o sl e v e la l li n c r e a s e do b v i o u s l y , c o m p a r e dt oc o n t r o lg r o u p p ba n dc db o t hp r o n o u n c e di n c r e a s e dr t e c sa p o p t o t i c r a t e sc o m p a r e dt oc o n l m lg r o u p w i t hi n c r e a s i n gp 旷o rc d 2 + c o n c e n t r a t i o n , a p o p t o t i c r a t e sf i r s ta r i s e dt h e nd e c l i n e d 。i na n t i o x i d a n tt r e a t e dg r o u p r o sl e v e la n da p o p t o t i c r a t e sb o t ha b a t e dc o m p a r e dt on oa n t i o x i d a n tp o i s o n e dg r o u p s a n dt h er e d u c e d m a g n i t u d ew a ss h o f l c n e da c c o m p a n yf i a s i n gp b 2 + a n dc c o n c e n t r a t i o n s t h i ss t u d yc o n f n m e dt h ei n c r e a s e dr o s1 e v e la n ds u b s e q u e n to x i d a t i v es t r e s sa i m p o r t a n tm e c h a n i s m so fp ba n dc dp o i s o n i n g a n t i o x i d a n t sh a v es h o w nt 0e x e r t s i g n i f i c a n tp r o t e c t i o na g a i n s tp ba n dc dt o x i c i 钾b ya m e l i o r a t eo x i d a t i v es t r e s sb o t hi n v i v oa n di nv i t r o ，b u th a v el i t t l eb e n e f i ti nr e s t o r i n gt h ec o m p r o m i s e dt i s s u e k e yw o r d s ：c a d m i u m ；l e a d ：a n t i o x i d a n t ；o x i d a t i v es t r e s s ；a p o p t o s i s 塑! 塑型堕查墼竖壁掘伤及抗氧化剂拮抗作用的研究三 鼹 a l a l k q a p a f c ( 姗 d h r l 2 3 d m s a e r k f c m g 6 p d g s h 取 j n k l a m 燃 m d a n a c n k 榴 p c d r p m r o s l i ：n 弛 s e - m e t s o d n 师吨 缩略词 a p o p t o s i s - - i n d u c i n gf a c t o r s促凋亡因子 7 - - a m i n o l e v u l i n i ca c i d r 一氨基酮戊酸 t - - a m i n o l e v u l i n i ca c i d d e h y d r a t a s e t 一氨基酮戊酸脱氢酶 a p o p t o f i cp r o t e a s ea c t i v a t i n gf a c t o r 凋亡蛋白酶激活因子 c y c l i cg u a n o s i n em o n o p h o s p h a w 环鸟苷酸环化酶 d i h y d r o r h o d a m i n e l 2 3 双氢罗丹明1 2 3 d i m e r c a p t o s u c c i n i ca c i d 二巯基琥珀酸 e x t r a c e i l u l a rs i g n a l r e g u l a t e dk i n a s e 细胞外信号调节蛋白激酶 f l o wc y t o m e t r y流式细胞仪 g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e 6 一磷酸葡萄糖脱氢酶 g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e 谷胱甘肽过氧化物酶 c - u u n n h 2 - t e n n i n a lk i n a s ec 埘 氨基末端激酶 q - l i p o i ca c i d 硫辛酸 m r o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s c 促分裂原活化蛋白激酶 m a l o n d i a l d e h y d 。 丙二醛 n - a c e t y l c y s t e i n e 肛乙酰半胱氨酸 n u c l e a rf a c t o r - k b 核转录因子l m p r o g r a m m e d c e l ld e a t h 细胞程序性死亡 r o t a t ep e rm i n u t e辏| 食铺 她咖o x y g e ns p e c i e s 活性氧 r e n a lt u b u l a re p i t h e l i ac e l l s肾小管上皮细胞 s e l e n o m e t h i o n i n e 硒代半胱氨酸 s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧化物岐化酶 1 1 1 m o tn e c r o s i sf a c t o r肿瘤坏死因子吨 扬州大学硕士学位论文 综述一：铅、镉中毒与氧化应激关系研究进展 2 由于现代工业的快速发展和人们生活水平的大幅提高，铅、镉成为最为常见的 工业和环境污染物，广泛分布于人们生活环境和生态系统的每一个角落，对人类和 动物健康构成了巨大威胁h 。3 。 铅主要通过消化道和呼吸道进入生物体，主要分布在血液、肾脏和肝脏，可破 坏多个器官和组织的正常结构和生理功能。铅可损伤红细胞膜和与血红蛋白结合而 引起贫血和点彩红细胞，对肾小管和肾小球的损伤使肾脏排泄机能受到严重影响， 铅还可导致对神经系统的损伤，引起实验动物的行为异常，听觉和认知能力下降b 】。 镉主要通过呼吸道和消化道进入生物体，镉被吸收后首先被转运至血液并和红细胞 或部分蛋白结合，再转运到其他器官，主要是肾脏和肝脏。镉可引起骨质疏松，不 可修复性肾小管损伤，贫血，和慢性关节炎等疾病或症状，同时有研究认为镉也是 一种致癌物，可导致肺脏，前列腺和肾脏的癌症h 】。人类对铅、镉中毒机理的研究 多年来从未间断，近年来众多研究显示，铅、镉能促进机体内活性氧的大量产生， 打破机体内抗氧化和亲氧化平衡，引起氧化应激，从而引起相应的组织损伤。 1 铅引起氧化应激的机理 铅导致的氧化应激作用主要包括对生物膜、d n a 、和蛋白质的破坏。但铅引起 氧化应激过程中活性氧产生的具体途径仍不很清楚，目前一般认为可能与y 一氨基 酮戊酸( 1 , - - a m i n o l e v u l i n i ca c i d ，a l a ) 有关。铅与巯基有高度的亲和力，当铅进 入血液时，丫一氨基酮戊酸脱氢酶( ? - - a m i n o l e v u l i n i ca c i d d e h y d r a t a s e , a l a d ) 的活 性被抑制，反馈性地使a l a d 的底物a i a 大量合成并积聚。h a n d eg u r e r 等研究发 现巧 ，铅作业工人的血液a l a d 活性比正常工人下降了8 0 ，同时m d a 水平升 高3 倍。n e a l 等研究发现哺1 ，a i a 能诱导中国仓鼠卵巢细胞发生氧化应激，同时 这种诱导作用能被抗氧化剂n - - 乙酰半胱氨酸阻断。另外，体外培养红细胞的脂质 过氧化反应与a l a 浓度呈正相关，在过氧化氢和超氧阴离子清除剂过氧化氢酶和 超氧化物岐化酶存在条件下，将红细胞和a i a 共同培养，能减轻由于a l a 自氧化 产生活性氧而引起的脂质过氧化。 a i a 是一种亲氧化物，在p h 7 o 一8 0 时会发生烯醇化和自氧化，酮式a l a 必 需转化为烯醇式a l a 才能发生自氧化产生超氧阴离子。m o n t e r i o 报道h 1 ，a l a o x yh b ( 氧合血红蛋白) 能通过两种途径产生活性氧，一是酮式a l a 通过异构作 用形成烯醇式a i a ；二是烯醇式地作为电子供体将电子转给分子氧，同时o x y h b 铅、锅对s d 大鼠肾脏损伤及抗氧化剂拮抗作用的研究 将电子转给氧产生正铁血红蛋白、a l a 自由基和过氧化氢。a l a 和a l a o x y l l b 共同自氧化产生过氧化氢和超氧阴离子，在过渡金属离子存在时会通过f e n t o n 反应 产生活性更强的羟自由基。因此铅中毒时a l a 的积聚是r o s 的一个重要来源。 铅对细胞膜的氧化损伤是由于细胞膜磷脂中的双键使邻近的c h 键的能量减 弱，h 原子很容易被活性氧抽提，被抽提后的多不饱和脂肪酸会发生重排，出现共 轭双烯。脂肪酸中双键数目与脂肪酸和铅作用产生的m d a 量呈正相关。羟自由基 与脂肪酸中h 结合成h 2 0 ，而脂质体( l h ) 成为l ，然后l 与0 2 反应，生成脂质 过氧基l o o 。，l 0 0 可从另一磷脂的多不饱和脂肪酸分子中抽提一个氢原子，成为 l o o h ，同时新生成l ，上述反应可重复发生，成链式传播扩增，持续进行哺】。活 性氧通过与细胞膜上生物大分子作用，也能影响与生物膜相关的生物功能，如细胞 膜上酶的活性，胞吞和胞吐作用，可溶性物质的跨膜运输和信号转导过程哼 。 报道认为，铅亦能使d n a 受到氧化应激影响，可能是a l a 诱导产生的羟自由 基对d n a 的损伤，d n a 中脱氧戊糖的碳原子和羟基上氢均能与羟自由基反应，在 碳位置上抽提氢原子，破坏糖基，另外自由基还能引起d n a 链断裂和交联。d n a 中的铁和铜离子亦能介导d n a 的损伤，当有过氧化氢产生时，铁和铜离子通过 f e n t o n 反应产生羟自由基损伤d n a 。用心长期处理大鼠，会使细胞内8 一酮基 一7 ，8 二氢- - 2 一脱氢鸟苷和5 - - 羟基- - 2 一脱氧胞苷酸含量增加，可能是由a l a 诱导的羟自由基产生的d n a 损伤 1 0 3 。有资料显示铅能影响部分基因的表达，铅能 代替锌指蛋白上的锌或直接与其结合，这些锌指蛋白大多结合在d n a 特定部位上， 作为反式作用因子对基因转录进行调控而影响基因的表达，但铅对基因表运的影响 仍有待进一步研究。 铅引起氧化应激的另一机制是铅对细胞内抗氧化系统的影响，因为铅对巯基有 高度的亲和力，所以能通过和巯基的结合而影响部分抗氧化酶的活力，如a l a d ， 超氧化物岐化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) ，谷胱甘肽过氧化物酶( g l u t a t h i o n e i m r o x i d a s e 。g s h - p x ) ，6 一磷酸葡萄糖脱氢酶( g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ， g - 6 p d ) 。g 6 p d 含有许多巯基键，通过氧化6 一磷酸葡萄糖提供线粒体所需的大部 分n a d p h 。g 6 p d 对成熟红细胞的抗氧化系统是必需的，因为红细胞没有线粒体， 必须依靠磷酸戊糖途径提供n a d p h 。当有活性氧存在时，红细胞内g s h 很快被氧 化成g s s h ，保护了红细胞膜和血红蛋白被自由基的破坏，同时g s s h 又被g s h 还 原酶利用n a d p h 提供的h 重新生成g s h ，继续发挥抗氧化作用。在体外试验发 现，铅能抑制g 6 p d 的活性。但体内研究发现，铅对g 6 p d 的作用与体外试验有所 不同，铅处理大鼠红细胞内g 6 p d 活性比对照组有明显升高3 。因此铅暴露引起 g 6 p d 的活性是升高还是降低，取决于多种因素，如铅暴露的浓度和时间长短，及 扬州大学磺士学位论文 4 细胞内氧化应激的程度。另外，g s h - p x ，c a t 和s o d 是铅发挥毒性的重要目标， 而且这些酶的正常结构和功能决定于许多微量元素，例如硒、锌、铁等，铅中毒会 相应减少硒的吸收，这更增加了机体对氧化应激的易感性。动物补硒能有效预防铅 引起的氧化应激，主要是增加了s o d 、谷胱甘肽还原酶的活性和g s h 的含量。由 此可见，铅抑制或降低了抗氧化酶活性和细胞内抗氧化物的含量，降低机体抗氧化 系统功能，使机体和细胞对氧化应激更加敏感 2 镉引起氧化应激的机理 许多研究已发现镉对机体的毒性在很大程度上是由活性氧引起的。o b r i e n 1 2 3 和g a l a nh 引分别报道镉能诱导产生羟自由基和超氧阴离子、一氧化氮、过氧化氢。 用镉处理大鼠，肝脏和肝线粒体的脂质过氧化水平较对照组显著升高 1 4 e 因为镉不是过渡金属，所以不能通过f e n t o n 反应直接产生活性氧。因而镉很可 能是通过阃接途径引起生物体氧化应激。镉能降低细胞内谷胱甘肽含量，抑制抗氧 化酶的活性，如c a t 、s o d 、和g s h p x 1 5 】。抗氧化酶活性的降低和细胞内抗氧化 成份的减少，加上机体正常代谢产生的活性氧，就不难理解锅处理动物脂质过氧化 水平的升高了。 镉能有效诱导机体金属硫蛋白的合成，金属硫蛋白不但能调节微量元素( 主要 为铜和锌) 储存、运输和代谢，还对重金属中毒的解毒和清除自由基( 特别是羟自 由基) 有明显功效。但不同种类的金属硫蛋白功效不同，锌金属硫蛋白具有保护 d n a 损伤和清除活性氧作用，而镉金属硫蛋白不但没有保护作用，一定条件下还 会加重这种损伤c 1 6 3 e 体外研究发现r 1 7 , 当金属硫蛋白上镉离子和锌离子摩尔比为 5 ：2 时，金属硫蛋白能引起d n a 链的断裂。虽然金属硫蛋白有缓解镉毒性作用， 提高机体对镉的耐受量，但金属硫蛋白不能清除镉对肾脏的毒性作用，因为镉金属 硫蛋白被肾小管溶酶体摄入后，该蛋白降解形成游离的镉而呈现毒性。因此镉诱导 金属硫蛋白合成增加是一把双刃剑，一方面能结合镉离子和清除自由基，另一方面 又能加重镉对肾脏毒性。 镉诱导活性氧增加的另一机制可能是镉从胞浆内膜蛋白上替换了铁离子和铜 离子，这样增加的铁和铜离子就能通过f e n t o n 反应产生活性氧。镉能与铁蛋白和脱 铁蛋白结合，将铁置换。k o i z u m i 1 8 3 证实大鼠接触致癌剂量的镉1 2 h 后，睾丸内铁 含量显著增加。而去铁草酰胺( 去铁敏) 能抑制镉诱导活性氧的增加和镉毒性，有 力支持了这一假设。v a l v e r d en 钾在无细胞试验中发现o 1 l a m o l 1 , 的氯化镉对d n a 的损伤不是由于镉和d n a 的相互作用，而是由氧化应激引起的。 铅、镉对s d 大鼠肾脏损伤及抗氧化剂拮抗作用的研究三 3 铅镉联合引起氧化应激 铅、镉单独染毒实验动物和铅、镉作业工人体内均能出现氧化应激，或脂质过 氧化水平升高，但关于铅镉联合引起氧化应激的研究还不多。本试验分别用铅、镉 单独和铅镉联合处理s d 大鼠，铅镉联合引起肾组织的脂质过氧化水平的升高均显 著高于铅、镉单独染毒组。王学谦等啪1 在体外检测铅镉对肾小管上皮细胞脂质过 氧化水平的影响，结果显示铅镉联合染毒有毒性协同作用。 对铅镉联合作用的机理至今还未阐明，一般认为铅镉联合作用具有协同作用， 铅进入体内后能使a l a 的积聚并通过自氧化途径生成活性氧，铅镉又均与巯基有 高度亲和力，这样可降低细胞内谷胱甘肽抗氧化的功能，抑制体内抗氧化酶的活性 多种因素综合作用，使得铅镉联合作用很可能导致机体的氧化应激加剧。 4 结论 虽然铅、镉单独或联合作用引起的氧化应激或氧化损伤只是其中毒机理的一个 方面，但仍可为我们预防和治疗铅、镉中毒提供思路或方法。大量实验表明在铅、 镉处理实验动物前、后或同时给予抗氧化剂，如v e 、硒、n - - 乙酰半胱氨酸 ( n - a c e t y l c y s t e i n e ，n a c ) 、硫辛酸( a - l i p o i ca c i d , l a ) 等，能不同程度的缓解铅、 镉引起的氧化损伤，而且抗氧化剂之间还有协同效应作用，如v e 和硒的共同使用。 但何时给予抗氧化剂能最大程度缓解铅、镉引起的氧化应激，以及哪一种或几种抗 氧化剂的功能最为有效均还待进一步研究。 尽管抗氧化剂能缓解铅、镉引起的氧化应激，但这仍是种治标不治本的方法，因为铅或 镉仍滞留在体内，在使用抗氧化剂后还可对机体产生损伤。因此可以考虑抗氧化剂和重金属螯 合剂共同使用，甚至可以寻找一种既有抗氧化功能又有螯合功能的物质。n a c 和l a 均为含巯 基的抗氧化剂，所以均有能通过其巯基螯合铅镉等重金属的功能。二巯基琥珀酸 ( d i m e r c a p t o s u c c i n i ca c i d ，d m s a ) 是经美国f d a 批准的用于治疗儿童铅中毒的螯合剂，从其 结构分析，其亦有抗氧化功能。m a n i s h ap a n d e “”研究发现l a 和d m s a 联合应用相比于单独 使用更能有效治疗铅中毒，特别是降低氧化应激和脑铅含量。由于镉进入体内后大量与金属硫 蛋白结合，因此对于如何更有效的螯合镉并捧出体外还需更深入的研究 扬州大学硕士学位论文 综述- - ：自由基与细胞凋亡关系研究进展 6 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 与自由基( f r e er a d i c a l ) 理论自上世纪九十年代建立以来， 一直受到极大关注而迅速发展，并不断得到丰富和补充，本文将对自由基与细胞凋 亡的关系做一综述。 1 细胞凋亡与自由基基本概念 细胞凋亡亦叫细胞程序性死亡( p r o g r a m m e d c e l ld e a t h ，p c d ) 是指有着一整套 形态学变化，且不同于细胞坏死( n e c r o s i s ) 的一种细胞死亡方式，主要包括细胞体 积缩小，胞浆密度升高，染色质固缩( c h r o m a t i nc o n d e n s a t i o n ) ，细胞骨架崩解 ( c y t o s k e l c t o nc o l l a p s e ) ，d n a 片段化( d n af i a g m e n t a f i o n ) ，电泳时出现梯状 ( l a d d e r ) 条带，细胞膜在凋亡前期基本保持其完整性，后期会向外突起( b l e b b i n g ) ， 形成众多凋亡小体( a p o p t o f i cb o d i e s ) ，最终被巨噬细胞和其周围细胞所吞噬m 】。 细胞凋亡对生物体的发育、生长，和维持内环境稳定等方面有着重要作用。细胞凋 亡可由多种物理( 辐射、氧化应激等) ，化学( n o 、化疗药物等) ，生物因素( 病 毒、生长因子、胂瘤抑制因子等) 诱导发生皤1 。 细胞凋亡与机体的正常生长发育、免疫、疾病密切相关，因此机体细胞凋亡的 发生受到严格调控，凋亡发生过度或细胞凋亡受到抑制对机体均是有害的，前者可 导致神经退行性疾病、a i d s 和缺血性损伤等相关疾病，后者可导致自身免疫性疾 病和肿瘤等疾病阱，。 自由基通常是指带有不成对电子的原子、分子或离子，如羟自由基( o h ) 、超 氧阴离子( 0 2 ) 等，而过氧化氢( h 2 0 2 ) 、一氧化氮等( n o ) 、有机氢过氧化物( r o o h ) ， 及其他一些含氧的活性物质，虽不含未成对电子，但均具有较氧活泼的化学活性， 广以上也属于自由基范畴眨卯。生物体不断通过非酶反应和酶反应生成自由基，适 量的自由基对正常的生理功能是必需的，如吞噬细胞的杀菌作用，肝脏的解毒作用， 自由基还可参与前列腺素和胶原蛋白的合成，以及作为信号分子参与对基因表达的 调节哳3 。过量的自由基对机体是有害的，可对d n a 、生物膜、生物大分子产生损 伤作用功。自由基与动脉粥样硬化、缺血一再灌注损伤、神经系统疾病等相关2 们。 由于生物体内存有抗氧化系统，使得自由基处于一个极低量的、无害的水平，如果 由于内源性和( 或) 外源性的刺激使机体代谢异常产生大量的自由基( 包括氧自由 基，一氧化氮) ，而此时过量的自由基量又超过机体抗氧化系统的还原能力，机体 便处于氧化应激状态，氧化应激不仅是对机体的损伤作用，更重要的是调节作用， 铅、镉对s d 大鼠肾脏损伤及抗氧化剂拮抗作用的研究 一7 如对基因及相关转录因子的调节，并通过对基因表达的调控而对细胞增值、分化和 凋亡进行全方位的调节 3 1 3 0 2 自由基对凋亡基因的调节 许多基因参与对细胞凋亡的调控，根据其对细胞凋亡调控的结果可分为两大 类，一类是促进凋亡的基因，如p 5 3 、c e d 一3 、c e 戈l - - 4 、b a x ，c 一册世、胄7 锵等， 他们的表达都能加速细胞凋亡；一类是b c l 一2 ，b c i - - x l 等，其均可以延缓细胞凋 亡。 p 5 3 蛋白主要功能是抑制肿瘤细胞的生长，阻止其转化，同时在细胞周期分裂 中扮演“分子警察”作用，“监督”染色体的完整性，如果d n a 受损，p 5 3 就会使细胞 停留在g 1 期，直至d n a 得到修复，如损伤得不到修复，则诱导细胞凋亡，使机体保 持相对自稳态3 2 3 e 据o r e n l y 报道皓钉，组织氧引起的肺上皮细胞d n a 损伤是由p 5 3 蛋白表达增加介导的，p 5 3 蛋白可通过激活半胱天氡氨酸蛋白酶( c a s p a s e ) 活性诱 导细胞凋亡。来自体内外的的各种刺激使机体产生大量氧自由基和n o ，n o 和0 2 ” 以很高的反应速率生成活性更强的过氧亚硝酸盐( 0 n o o 一) ，强氧化剂o n o o 一使体 内原有的氧化还原平衡被打破，启动p 5 3 蛋白表达，诱导细胞凋亡。另外n o 通过亚 硝酰化反应发挥信号转导作用，也可促进p 5 3 蛋白表达增加，诱导细胞凋亡。 有试验显示1 在低氧条件下抗凋亡蛋白b c l 2 含量显著升高，高氧时则急剧下 降，同时促凋亡蛋白b 瓤水平在高氧状态下显著升高，而且p 5 3 水平也相应升高，随 着氧分压升高b c l - 2 b a x 比例亦随之降低，使细胞向着凋亡的方向发展。关于b c l - 2 抗凋亡的作用有报道认为与b c l - 2 蛋白有抗氧化功能相关，增加的b c l - 2 蛋白水平能 提高细胞内谷胱甘肽含量，并向细胞核转运，改变核内氧化还原状态：下调b c l - 2 表达则使细胞内谷胱甘肽大量消耗b 卯。v e i s 等口们发现b c l 2 基因敲除( k n o c k - o r e ) 小鼠与抗氧化功能缺失引起的病理变化相似。另外，当培养细胞b c l - 2 蛋白过度表达 时，能抑制在凋亡初期活性氧的生成。有试验证实口7 】，乙酰半胱氨酸能模拟b c l 2 的保护作用，使谷胱甘肽向细胞核转移。在百草枯( p a r a q u a t ) 诱导肺泡上皮细胞 凋亡而导致的肺损伤试验中e 3 5 3 , 乙酰半胱氨酸与b c l - 2 有着相似的保护作用。b c l - 2 通过抗氧化功能抑制凋亡机理可能是b c l 2 通过谷胱甘肽改变核内氧化还原状态，使 得一些对氧化还原状态敏感的转录因子( p 5 3 、a p 1 、n f _ 融) 与d n a 的结合发生 了改变。 促分裂原活化蛋白激酶家族( m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，m a p k ) 主要包 括三个亚家族，细胞外信号调节蛋白激酶( e x a r a c e l l u l a rs i g n a l - r e g u l a t e dk i n a s e ， e r k ) ，c - d u n 氨基末端激酶( c j u n - - n h 2 - t e r m i n a ll d n a s e ，j n k ) ，亦称为应激活化 扬州大学硕士学位论文 0 蛋白激酶，和p 3 8 促分裂原活化蛋白激酶。一般认为j i l ( 和p 3 8 主要促进细胞凋亡， e r k 抑制凋亡而保证细胞的正常生长发育。在体内心脏缺血再灌注和体外培养心肌 细胞低氧再充氧试验中，由氧化应激诱导的细胞凋亡与p 3 8 和k 表达增加有关。”， 被活性氧激活的p 3 8 和j n k 可能磷酸化下游的转录因子，如核转录因子k b ( n u c l e a r f a c t o r - k b ，n k - k b ) ，导致细胞凋亡。n k - k b 与肿瘤坏死因子- 4 1 ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ， 耵师吨) 基因的启动子结合，增强它的表达并释放到细胞外，t n f - ( 1 可通过细胞表 面受体( c d 9 5 ) 结合诱导细胞凋亡。 3 自由基通过线粒体对细胞凋亡的影响 需氧生物的氧自由基的主要来源于线粒体的呼吸链和内质网。在含有不成对电 子时的氧化磷酸化，和其他病理情况下，线粒体活性氧的生成将大量增加。有研究 证实m 1 ，活性氧会在线粒体膜上形成“渗透性临时孔道”( 1 r r m m b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ， p 1 p ) ，该孔道可引起线粒体基质的膨胀，破坏线粒体膜的完整性，使得部分膜问蛋 白释放到胞浆中，其中包括促凋亡的部分蛋白，如细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ) ，凋 亡诱导因子( a p o p t o s i s - - i n d u c i n gf a c t o r s ，a i f ) ，前半胱天氡氨酸蛋白酶- 9 ( p r o c a s p a s e9 ) 。a i f 可进入细胞核活化核酸酶，活化了的核酸酶可降解d n a 。进 入胞浆的细胞色素c ，先与凋亡蛋白酶激活因子( a p o p t o t i cp r o t e a s ea c t i v a t i n gf a c t o r ， a p a f ) 和d a t p 结合在一起，再与无活性的p r o c a s p a s e 9 结合形成凋亡复合体，多个 p r o - c a s p a s e 9 可经相互活化形成其活性形式c a s p a s e 9 ，活性形式的c a s p a s e 9 又可激活无 活性的p r o - c a s p a s e 3 ，最终导致d n a 链断裂，染色质固缩，细胞最后死亡。在研究 细胞内不同氧化还原状况对细胞色素c 诱导凋亡影响的试验中，抗氧化物能抑制凋 亡的发生。 有研究认为自由基能导致细胞内钙离子出现负载现象 4 1 3 首先自由基能引起 细胞膜脂质过氧化和膜l n a + c a 2 + 通道开放，这会使细胞外钙离子流入细胞内，其 次亚细胞器储存的钙离子释放，如内质网或肌浆网。胞浆内大量钙离子聚集会使线 粒体膜出现钙离子依赖性p 1 p 开放，从而释放细胞色素c 或a 职等其他促凋亡物，导 致细胞凋亡。 由于线粒体含有少量自身d n a ，且不与组蛋白结合，无内含子，在等量活性 氧损伤条件下，线粒体d n a 损伤重于核d n a ，其修复能力也较低。因此当线粒体 内产生大量自由基时，可对线粒体d n a 造成严重损伤，此时p 5 3 蛋白表达迅速增 加，通过p 5 3 激活促凋亡因子和c a s p a s e 活性，引起细胞凋亡m 1 。 铅、镉对s d 大鼠肾脏损伤及抗氧化剂拮抗作用的研究1 4 自由基对细胞凋亡的抑制 一般认为适量的自由基会诱导细胞凋亡，但当过量自由基存在时，可诱导细胞 坏死，主要表现为细胞膜不对称性崩解，胞浆和核内容物外溢，引发炎症反应，并 对周围细胞造成损伤。因为细胞凋亡的发生和执行需要消耗a t p ，而当过量自由基 存在时的氧化应激态耗尽细胞内能量，最后细胞以坏死而结束。 一定情况下，自由基还可抑制细胞凋亡，例如当n o 含量在正常生理水平时， 可抑制细胞凋亡 4 3 3 y 关于n 0 抑制细胞凋亡的机理一般认为有三种。通过鸟苷酸 环化酶( c y c l i cg u a n o s h l em o n o p h o s p h a t e ，c o m p ) 和神经酰胺介导的抑制凋亡； n o 通过亚硝基化c a s p a s e 蛋白酶的活性位点，使c a s p a 不能被正常激活：n o 通 过对线粒体的影响抑制凋亡，n o 能抑制p 1 1 p 的开放和钙离子在线粒体的积聚。当然 n o 或其他自由基对细胞凋亡是促进还是抑制作用，不但取决予它们的含量多少， 同时与其他许多对自由基有调节作用的因子相关。这些因子之间的相互作用和不断 变化的自由基含量，使细胞向着增值、凋亡或坏死方向发展，最终维持着细胞的内 环境的稳定。 5 展望 直至今天，对细胞凋亡的研究还在不断深入和扩展，因为这不但是一个有着广 阔前景的领域，它为肿瘤和免疫缺陷症等病的治疗提供一个很好的切入口，同时又 是非常奇妙的科学现象，细胞凋亡是一个极其复杂又事先被设定好了的过程，其中 包括大量因子的相互作用，横跨细胞膜和细胞核。由于细胞凋亡机制的多样性和复 杂性，近年来从自由基角度探讨凋亡的机理越来越得到重视，而研究凋亡和自由基 关系的目的也就是为了更好对细胞凋亡进行调控，使其向着对生物体有利的方向发 展。尽管对这方面的研究已取得很大进展，但还有很多，甚至一些很基本的问题尚 未得到解决，比如虽然一般认为低含量自由基诱导凋亡，高含量自由基抑制凋亡， 但高和低还只是一个相对概念，在临床实际应用时不能很好控制以使其发挥预期的 功能。而且我们一般只考虑自由基单一因子作用，细胞内其他众多对细胞凋亡有重 要的调节功能的因子未被考虑。因此今后研究应从整体上