（临床检验诊断学专业论文）抗人gitraa27165蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用.pdf

独创性声明 i i l u le ii ii i ii i it ii i iiil y 18 9 4 9 2 3 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中己注明引用的内容以外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包 含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均以在文中以明确的方式 表明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：欠件乏 j - 6 ，j 年多月j i 牛日 学位论文版权授予书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期 刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电 子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文 档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授 权中国科学技术信息研究所将本论文编入中国学位论文全文数据 库并向社会提供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社将 本论文编入中国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查 询。论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 本学位论文属于不保密西 学位论文作者签名：灵k d 口i j 年歹月4 日 指导教师 j d l 年g 只l 分类号r 3 窆2 = 3 3 u d c 6l2 硕士学位论文 密级坌珏 编号! q 2 窆窆墨q 墨! 垒q 1 2 抗人g i t r a a 2 7 - 1 6 5 蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定及初步应用 p i 也p a ra t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n dp r e l i m a i w a p p l i c a t i o no fm o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s th u m a n g l u c o c o i u i c o i d i n d u c e dt u m o rn e c r o s i s f ac t o rre c e p t o r 作者姓名：刘艳 指导教师：王胜军仝佳 小组成员：许化溪邵启祥 申请学位：硕士 学科专业：临床检验诊断学 论文提交日期：2 0 11 - 4 2 8 论文答辩日期：2 0 1 1 6 8 学位授予单位：江苏大学 学位授予日期：2 0 11 6 18 答辩委员会主席：陈瑜 评阅人： 江苏大学硕士学位论文 摘要 目的：制备抗人g i t 7 - 1 6 5 ( h u m a ng i t k 7 - 1 6 5 ，h g i t r m 7 - 1 6 5 ) 蛋 白单克隆抗体( m a b ) 、纯化并鉴定其特性；用生物素标记其中的一 株抗人g i t r a a 2 7 - 1 6 5 蛋白单克隆抗体，构建生物素一亲和素e l i s a 方 法，检测h g i t r 蛋白，为进一步研究h g i t r 的生物学功能及临床应 用奠定实验基础。 方法：本课题分三部分进行： 1 分泌抗人g i t r a a 2 7 - 1 6 5 蛋白单克隆抗体的杂交瘤制备 将h g i t r a a 2 7 1 6 5 蛋白与完全弗氏佐剂充分乳化后，免疫6 8 周龄 雌性b a l b c 小鼠，眼眶后静脉丛采血获得抗h g i t r 硇2 7 1 6 5 的抗血清， 间接e l i s a 法检测其效价，以健康b a l b c 小鼠血清为阴性对照。 应用杂交瘤技术，将免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞s p 2 0 融合， 并通过间接e l i s a 法筛选阳性克隆杂交瘤细胞株，扩大培养、冻存 并进行核型分析。 2 鉴定抗人g i t r 越a 7 - 1 6 5 蛋白单克隆抗体 将成功分泌抗人g i t r 缸2 7 - 1 6 5 蛋白单克隆抗体的融合细胞注射健 康b a l b c 小鼠腹腔内，1 4 天左右产生腹水。腹水经系列浓度梯度 饱和硫酸铵初步纯化、透析、p r o t e i ng 亲和层析柱进一步纯化后获 得腹水型抗体。用间接e l i s a 法测定m a b 的效价及类型，以w e s t e r n b l o t 鉴定m a b 的特异性。 抗人g i t r 。2 7 - 1 6 5 蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用 3 构建检测h g i t r 蛋白的生物素亲和素e l i s a 方法 将2 a 5 c 6m a b 与活化生物素b n h s 耦联，制备生物素化抗体 ( b i o 2 a 5 一c 6m a b ) ，并以1 8 6 d 9m a b 作为包被抗体，以 b i o 2 a 5 一c 6m a b 作为检测抗体，确定最适的抗体包被浓度和一抗稀 释倍数，构建生物素亲和素e l i s a 方法，检测原核表达蛋白 h g i t 7 - 1 6 5 ，确定检测h g i t r 蛋白的最低阈值。 结果： 1 以h g i t r a a 2 7 1 6 5 蛋白为抗原对b a l b c 小鼠进行皮下多点免 疫，将h g i t r a a 2 7 1 6 5 蛋白作为检测抗原进行包被，间接e l i s a 法检 测其抗血清效价，效价可达1 ：1 2 8x1 0 5 。杂交瘤细胞融合率为5 6 ， 经过间接e l i s a 法反复筛选，阳性率为1 8 7 5 ，其中对2 株杂交瘤 细胞进行3 次克隆化，分别命名为i b 6 d 9 和2 a 5 一c 6 。核型分析发 现，抗h g i t r a a 2 7 - 1 6 5 蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的染色体数目在1 0 0 条左右。 2 阳性杂交瘤细胞免疫小鼠后产生4 - - 5m l 的腹水，经过分离纯 化后，s d s p a g e 电泳分析表明，抗h g i t r 越a 7 1 6 5 蛋白单克隆抗体细 胞株在5 2 k d 和2 3 k d 左右处各出现一条蛋白条带，与i g g 的重链和 轻链的大小相符。经间接e l i s a 法检测2 株杂交瘤细胞诱生腹水中 的抗体效价分别为1 ：2 5 6x 1 0 5 和1 ：5 1 2x 1 0 5 ，抗体类型均为i g g 。 w e s t e r nb l o t 结果显示m a b 均能与原核表达蛋白h g i t r 。a 2 7 1 6 5 特异性 厶七 ；口口o 3 成功制备b i o 2 a 5 c 6m a b ，确定了ib 6 d 9m a b 的最佳包被 江苏大学硕士学位论文 浓度为1 0 u g m l ，b i o 2 a 5 c 6m a b 的最佳稀释倍数为1 ：5 0 0 0 ，最低 检测h g i t r 的阈值为15 7 n g ，初步建立检测h g i t r 蛋白的b a - e l i s a 法。利用该方法检测梯度稀释的原核表达蛋白h g i t r ，结果显示吸 光度随蛋白浓度呈现一定的线性变化。 结论：本研究通过杂交瘤技术获得2 株能稳定分泌抗h g i t 7 1 6 5 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株所分泌的单克隆抗体可 与h g i t r a a 2 7 1 6 5 蛋白特异性结合；利用单克隆抗体的高特异性以及生 物素一亲和素系统的放大作用，初步建立了高灵敏度的生物素亲和 素一e l i s a 方法。 关键词：h g i t r ，杂交瘤细胞株，单克隆抗体，间接e l i s a ，生物 素亲和素e l i s a 抗人g i t r 。2 7 1 6 5 蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用 i v 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h ea i mo ft h i ss t u d yi s t op r e p a r ea n dp u r i f ys p e c i f i c m o n o c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s th u m a n g i t r a a 2 7 1 6 5 ( h g i t r a a 2 7 - 1 6 5 ) p r o t e i n ， a n dt oc h a r a c t e r i z et h e s ea n t i b o d i e s p r o p e r t i e s a d d i t i o n a l l y , b a - e l i s a w a sd e v e l o p e df o rh g i t rp r o t e i nd e t e r m i n a t i o na n dt h i sm e t h o dm a y p r o v i d eat e c h n i q u ef o rd e t e c t i n gs o l u b l eh g i t rp r o t e i n m e t h o d s ：t h i sa r t i c l ei sc o m p o s e do ft h r e e p a r t s ： 1 p r e p a r a t i o n o f h y b r i d o m a c e l ll i n e s s e c r e t i n g m a b a g a i n s t h g i t r a a 2 7 16 5p r o t e i n t h ep u r i f i e d h g i t r a a 2 7 1 6 5p r o t e i n e m u l s i f i e dw i t h c o m p l e t e f r e u n d sa d j u v a n t ( c f a ) w a su s e dt oi m m u n i z et h r e e6 - 8w e e k so l d f e m a l eb a l b cm i c e t h ea n t i s e r u mw a sa t t a i n e db yr e t r o b u l b a rv e n o u s p l e x u sb l o o dl a wa n dt h e nt h e t i t e ro fp o l y c l o n a la n t i b o d i e sw a s d e t e r m i n e db yi n d i r e c te l i s a s t a n d a r dh y b r i d o m at e c h n i q u ew a s a p p l i e dt o f u s em u r i n es p 2 0c e l l sa n ds p l e e nc e l l sf r o mi m m u n i z e d m i c e f u r t h e r m o r e ，i n d i r e c te l i s a sw e r eu s e dt os c r e e nh y b r i d o m ac e l l l i n e sw h i c hc o u l d s p e c i f i c a l l y a n d s t e a d i l y s e c r e t em o n o c l o n a l a n t i b o d i e sa g a i n s th g i t r a a 2 7 1 6 5p r o t e i n i na d d i t i o n ，t h ef u s i o nc e l l s w e r ec h e c k e db yk a r y o t y p ea n a l y s i s v 抗人g i t r 。2 7 1 6 5 蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用 2 i d e n t i f i c a t i o no ft h ea n t i h g i t r a a 2 7 1 6 5m a b t h ee n r i c h m e n to ft h ea n t i h g i t r a a 2 7 - 1 6 5m a bw a sp e r f o r m e db y p e r i t o n e a li n j e c t i o no fp o s i t i v eh y b r i d o m ac e l l su p o nh e a l t h yb a l b c m i c e ，a n da f t e r14d a y s ，t h ea s c i t e sw a sc o l l e c t e da c c o r d i n g l y t h em a b i sp u r i f i e db yr e p e a t e dp r e c i p i t a t i o nu s i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f s a t u r a t e da m m o n i u ms u l f a t e m o r e o v e r , p r o t e i ngr e s i nc o l u m nw a s u s e df o rt h ep u r i f i c a t i o no fm a b sa n dt h e nt h et i t e ra n ds p e c i f i c i t yo ft h e m a b sw e r ed e t e r m i n e db yi n d i r e te l i s aa n dw e s t e r nb l o tr e s p e c t i v e l y t h ec l a s s e so ft h ei n d u c e da n t i b o d yw e r ea l s oi d e n t i f i e db yi n d i r e c t e l i s a 3 d e v e l o p m e n to f b a - e l i s a f o rh g i t r p r o t e i nd e t e c t i o n o n ec l o n eo fp r e p a r e da n t i h g i t r a a 2 7 1 6 5m a b sw a sc h o o s e nt oc o a t e l i s ap l a t e sa n da n o t h e rc l o n ew a sl a b e l e dw i t hb i o t i n t h e c o n c e n t r a t i o n so fb o t hc l o n e sw e r ed e t e r m i n e db yu s i n gs e r i a ld i l u t i o n m e t h o d s t h ec u t o f fv a l u eo fh g i t ra s s a yw a sd e f i n e dv i aa ni n t e g r a l a n a l y s i so nt h ep r o f i l eo f s o l u b l eh g i t rp r o t e i n r e s u l t s ： 1 a f t e ri m m u n i z a t i o nw i t hh g i t r 锄2 7 1 6 5p r o t e i na n dc o m p l e t ef r e u n d s a d j u v a n t ，b a l b cm i c ep r o d u c e da n t i s e r u mw i t hat i t e ra s1 ：1 2 8x10 5 t h em u r i n es p 2 0c e l l sa n ds p l e e nc e l l sf r o mi m m u n i z e dm i c ew e r e s u f f i c i e n t l yf u s e dw i t hah y b r i d o m af u s i n gr a t i oa s5 6 ，a n dc l o n i n g v l 江苏大学硕士学位论文 r a t i ow a sa b o u t18 7 5 t w oh y b r i d o m ac e l ll i n e s ，1b 6 一d 9a n d2 a 5 一c 6 ， w e r ee s t a b l i s h e d ，w h i c hc o u l ds p e c i f i c a l l yp r o d u c ea n t i - h g i t r a a 2 7 - 1 6 5 m a b sw i t hh i g ha f f i n i t y k a r y o t y p ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h en u m b e ro f c h r o m o s o m ew a sa b o u t10 0 ，a n dt h e r e f o r ep r o v e dt h a tt h eh y b r i d o m a c e l ll i n e sw e r es u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d 2 4 - 5 m la s c i t e sw a sc o l l e c t e df r o mi m m u n i z e dm i c ea n dp u r i f i e db y p r o t e i ngr e s i nc o l u m n t h ea n t i h g i t r a a 2 7 1 6 5m a bs h o w e dt w ob a n d s i nf u r t h e rs d s - p a g et e s t o n ei si n5 2 k d ；t h eo t h e ri si n2 3 k d t h e t i t e r so ft h ep u r f i e dr n a b sw e r e1 ：2 5 6 x10 5a n d1 ：5 12 x10 5r e s p e c t i v e l y a n dt h ec l a s s e so fm a b sw e r ei g g w e s t e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e ds p e c i f i c b i n d i n go f 1b 6 - d 9a n d2 a 5 - c 6w i t hr e c o m b i n a n th g i t r a a 2 7 1 6 5p r o t e i n 3 b a - e l i s aw a ss u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e db yu s i n g1b 6 一d 9a st h e c o a t i n ga n t i b o d ya n d2 a 5 一c 6a st h ef i r s ta n t i b o d y t h eo p t i m a lc o a t i n g c o n c e n t r a t i o na n db i o t i n y l a t e dm o n o c l o n a la n t i b o d yd i l u t i o n sw e r e10 u g m la n d1 ：5 0 0 0r e s p e c t i v e l y t h ec u t o f fv a l u eo fh g i t ra s s a yw a s l5 7n g b a e l i s ac o u l db eu s e da sam e t h o dt od e t e c ts o l u b l eh g i t r p r o t e i n c o n c l u s i o n s ：t h er e c o m b i n a n th g i t r a a 2 7 1 6 5 p r o t e i ni sc a p a b l e o f i n d u c i n gt h ep r o d u c t i o n o fp o l y c l o n a la n t i b o d i e si nb a l b cm i c e s t a n d a r dh y b r i d o m at e c h n i q u ei sf e a s i b l et oo b t a i np o t e n th y b r i d o m a c e l ll i n e sa n dt h em a b ss e c r e t e dc a nb i n dt oh g i t r 船2 7 16 5p r o t e i n v 抗人g i t r 。2 7 1 6 5 蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用 s p e c i f i c a l l y b a e l i s ai ss u c c e s s f u l l yd e v e l o p e dt o d e t e c th g i t r p r o t e i n ，w h i c hc o m b i n e st h eg o o ds p e c i f i c i t yo f m o n o c l o n a la n t i b o d i e s a n dt h ea m p l i f i c a t i o ne f f e c to fb a s ，g r e a t l yi m p r o v i n gt h es e n s i t i v i 坝 一 ， 一 一一 r t h u s ，b a e l i s ac o u l db es u i t a b l ef o rh g i t rd e t e c t i o n a sw e l la s l a y i n gaf o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e re x p l o r a t i o no nt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n a n dc l i n i c a la p p l i c a t i o no fg i t rm o l e c u l e s k e y w o r d s ：h g i t r ，h y b r i d o m ac e l l ，m o n o c l o n a la n t i b o d y , i n d i r e c t e l i s a ，b a e l i s a 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 目录 l 1 1 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体( g l t r ) 及其配体( g i t r l ) 。1 1 1 1 g i t r g i t r l 的发现1 1 1 2g i t r 的结构特点及分布1 1 1 3g i t r l 的结构特点及分布2 1 1 4 调节性t 细胞3 1 1 5g i t r g i t r l 在免疫调节中的作用4 1 1 6g i t 刚g i t r l 在临床疾病中的作用7 1 2 本论文研究的目的、方法、意义及实验方案的设计1 l 1 2 1研究目的1 l 1 2 2 研究方法及技术l l 1 2 3 本研究的意义1 2 1 2 4 实验方案的设计。l2 第二章分泌抗h g i t r a a 2 7 1 6 5 蛋白单克隆抗体的杂交瘤制备1 5 2 1 实验材料1 5 2 1 1 细胞系与细胞培养一l5 2 1 2 实验动物15 2 1 3主要试剂和材料l5 2 1 4 主要溶液1 6 2 1 5 主要仪器17 2 2 实验方法。1 7 2 2 1 基础免疫动物一l7 2 2 2 免疫小鼠血清的收集一l8 2 2 3间接e l i s a 法测定小鼠血清抗体效价18 2 2 4 骨髓瘤细胞复苏、筛选并鉴定1 9 2 2 5 骨髓瘤细胞悬液的制备2 0 2 2 6 饲养细胞的制备。2 0 2 2 7 免疫脾细胞悬液的制备2 0 2 2 8 细胞融合一2 1 2 2 1o 测定细胞融合率2 2 2 2 1 1 抗体阳性杂交瘤细胞的克隆化筛选、扩大培养2 3 2 2 1 2 杂交瘤细胞的冻存和复苏2 4 2 2 1 3 杂交瘤细胞株特性的鉴定2 4 2 3 实验结果。2 5 2 3 1 免疫小鼠血清效价检测2 5 2 3 2筛选阳性细胞生长孔2 6 i x 抗人g i t r 。2 7 1 6 5 蛋白单克隆抗体的制各、鉴定及初步应用 2 3 3 2 3 4 2 3 5 2 3 6 2 4 细胞克隆化2 7 单克隆抗体效价的测定2 7 杂交瘤细胞株稳定性2 7 杂交瘤细胞染色体计数2 7 讨论2 8 第三章抗人g i t r a a 2 7 1 6 5 蛋白单克隆抗体的鉴定3 l 3 1 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 1 4 3 2 3 2 1 3 2 2 3 2 - 3 3 2 4 3 2 5 3 2 6 3 2 7 3 2 8 3 2 9 3 3 3 3 1 3 3 2 3 3 3 3 3 4 3 3 5 3 4 实验材料3 1 实验动物31 主要试剂和材料3l 主要溶液31 主要仪器3 2 实验方法。3 2 腹水型单克隆抗体制备3 2 饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体3 3 蛋白g 亲和层析纯化腹水一3 3 单克隆抗体质量浓度的测定3 4 s d s p a g e 电泳检验单克隆抗体纯度3 5 单克隆抗体类型的鉴定3 5 单克隆抗体效价的测定一3 5 单克隆抗体结合抗原特异性的鉴定3 5 单克隆抗体的表位分析3 6 实验结果3 6 单克隆抗体的浓度测定3 6 单克隆抗体的纯度测定3 7 单克隆抗体的特性3 7 单克隆抗体结合抗原的特异性3 8 单克隆抗体的抗原识别位点分析3 8 讨论：i l i 第四章b a e l i s a 法检测h g i t r 方法学的建立 x 4 l 实验材料4 1 主要试剂及材料4 l 主要溶液4 l 实验方法4 l 单克隆抗体的大量制备与纯化4 1 生物素化抗体的制备与效价的测定4 1 包被抗体的效价测定4 2 最适抗体包被浓度的确定4 2 生物素标记的2 a 5 c 6 单克隆抗体最适稀释倍数的确定一4 3 b c a 法测定h g i t r a a 2 7 16 5 蛋白浓度4 3 b a e l i s a 法对h g i t r 蛋白的检测4 3 l 2 1 2 3 4 5 6 7 l l l 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 江苏大学硕士学位论文 4 2 8 4 3 4 3 1 4 3 2 4 3 4 4 3 5 4 3 6 4 4 双抗体夹心b a e l i s a 法的特异性、敏感性及重复性检测。4 4 实验结果4 4 问接法测定b i o 2 a 5 c 6m a b 和1 8 6 d 9m a b 的效价4 4 最适抗体包被浓度的确定4 4 生物素标记的2 a 5 c 6 单克隆抗体最适稀释倍数的确定4 5 b a e l i s a 法对h g i t r 蛋白的检测4 6 双抗体夹心e l i s a 法的特异性、敏感性及重复性检测结果4 6 讨论z 1 7 第五章主要结论及展望 5 1 主要结论 5 2 展望 参考文献 4 9 4 9 4 9 缩l l 各 司。5 7 致谢 攻读硕士学位期间发表的文章。 5 9 抗人g i t r 。2 7 16 5 蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用 x i i 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体( g i t r ) 及其配体 ( g i t r l ) 1 1 1g i t r g i t r l 的发现 肿瘤坏死因子受体超家族( t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o rs u p e rf a m i l y ， t n f r s f ) 是i 型跨膜糖蛋白，包括2 0 余种跨膜蛋白、多种剪接变异体及多种病 毒蛋白质，所有成员都具有一个共同的结构特征富含半胱氨酸结构域。 t n f r s f 主要参与调控包括淋巴细胞在内的多种细胞的存活和分化【 】。糖皮质 激素诱导的肿瘤坏死因子受体( g l u c o c o r t i c o i d i n d u c e dt u m o rn e c r o s i sf a c t o r r e c e p t o r ，g i t r ) 是肿瘤坏死因子受体超家族( t n f r s f ) 中的第1 8 个新成员1 4 , 1 9 】， 又被称为活化诱导的肿瘤坏死因子受体( a c t i v a t i o n i n d u c e dt u m o rn e c r o s i sf a c t o r r e c e p t o r ，a i t r ) ，是胸腺来源的c d 4 + c d 2 5 + 调节性t 细胞( r e g u l a t o r ytc e l l ， t r e g ) 上的一个重要表面分子，属i 型跨膜糖蛋白，其配体为g i t r l ( g i t rl i g a n d ， g i t r l ) 。1 9 9 7 年，n o c e n t i n i 等【4 】首次从一株受地塞米松处理过的小鼠t 细胞杂 交瘤中成功克隆得到g i t r ，1 9 9 9 年又分别由k w o n l 5 1 和g u m e y l 6 1 克隆得到与鼠 g i t r 类似的人g i t r ( h u m a ng i t r ，h g i t r ) 以及g i t r l ，2 0 0 3 年t 0 n e 【7 1 和 k i m e l 8 】等人同时发现小鼠g i t r 配体( m o u s eg i t rl i g a n d ，m g i t r l ) 。 1 1 2g i t r 的结构特点及分布 人g i t r 基因位于染色体l p 3 6 1 9 1 ，临近编码t n f r 同源物的基因簇，其开放 阅读框架包含7 2 6 b p ，编码的蛋白质由2 4 1 个氨基酸组成，其中胞质区包含4 9 个氨基酸，跨膜区有2 7 个氨基酸，胞外区由1 3 9 个氨基酸组成，另外，有2 6 个 氨基酸形成人g i t r 信号肽部分( 图1 1 ) 。g i t r 蛋白为7 0 k d 的同源二聚体的 i 型跨膜糖蛋白，与m g i t r 之问有接近6 0 的相似度，它们最大的差别是互补 决定区( c o m p l e m e n t a r i t yd e t e r m i n i n gr e g i o n ，c d r ) l 中包含的半胱氨酸数目以 及细胞外结构域( e x c e l l u l a r d o m a i n ，e c d ) 中的n 一连接糖基化位点数不同。 g i t r 组成性高表达于c d 4 十c d 2 5 + 调节性t 细胞上，如c d 4 + c d 2 5 + 和 抗人g i t r 。2 7 1 6 5 蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用 c d 8 + c d 2 5 + t 细胞，活化后表达量进一步上调【1 0 1 2 】，g i t r 在小鼠和人的静止期 效应性t 细胞表面都有基础水平的表达，c d 4 + t 细胞表面g i t r 的表达量高于 c d s + t 细膨9 ，1 1 1 。而在t 细胞受抗c d 3 单克隆抗体、p h a 、i l 2 等刺激活化后， c d 4 + 和c d 8 + t 细胞表面g i t r 表达量均明显上调 4 - 6 , 1 2 - 1 3 , 1 6 1 。k o h m 等【1 4 1 报告c d 2 8 信号可以通过i l 2 依赖性信号通路增加t r e g 细胞和c d 4 + t 细胞上的g i t r 表达。 另有报道，g i t r 在自然杀伤细胞( n a t u r a lk i l l e rc e l l ，n k ) ，嗜中性多形核 ( p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l s ，p m n ) 细胞，单核细胞( m o n o n u c l e a rc e l l ) ， 巨噬细胞( m a e r o p h a g e s ) ，b 细胞( bc e l l ) ，树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l ，d c ) 和肥大细胞( m a s tc e l l s ) 表面也有少量表达【恪1 7 1 ，当这些细胞受到刺激后，g i t r 的表达均上调。此外，在小鼠和人的一些非造血组织如皮肤和肺等同样发现g l q 3 良 m r n a 的表达【6 , 1 8 】。 1 6 l 1 2 l 1 8 1 烂必缀皴鼎蠼丛丛塑趔涵盟幽蝴嬲粥c 鲫慢叫池翻删慷c c 黼腿帽c c 妨 y 粥e e c c s 姗c m c v q p e 豫c p c c t t c r 髓p c p q g v q g q g i ( 墅殴噬三匹缝鲤三 s g g h e g h c k p w t d c t q f g f l t v f p g n k t h v a v c v p g s p p a e p 州囡! 塑墨鹜垡丛麴鲢鹫 睦s 堑l g 埔i 盟i 担盯q i - i j 剧p p s t e d a r s c q f p e e e r g e r s a e e k g r l g d l w v 图i ig i t r 的氨基酸序列分析【9 】 f i g1 1d e d u c c dg i t ra m i n oa c i ds e q u 朗c e t h ep o t e n t i a ls i g n a ls e q u e n c ei su n d e r l i n e ；t h et r a n s m e m b r a n er e g i o ni si n d i c a t e di nb o x e s ；t h e s c q u e n c eb e t w e e nt w op a r sa b o v ei se x t r a c e l l u l a rr e g i o n ；t h el a s tf r a g m e n ti si n t r a c e l l u l a rs e g m e n t 众所周知，一些体外实验证实t 细胞上g i t r 不同的表达模式取决于疾病的 状态。l i 等【1 9 】报道在非传染性葡萄膜炎患者体内，c d 4 + t 细胞上g i t r 的表达 量要明显高于健康对照组，并且g i t r 的表达情况和病程具有一定的相关性。同 样，感染h i v 的患者其c d 4 + t 细胞上g i t r 的表达量要比健康对照组具有较高 的基准表达【2 0 1 。韦格纳肉芽肿( w e g e n e r sg r a n u l o m a t o s i s ) 患者c d 4 + c d 2 5 + t 细 胞上g i t r 的表达与疾病的活动性密切相关【2 。这些实验充分说明g i t r 的表达 和功能的发挥可能取决于各自免疫效应性细胞群的活动水平。 1 1 3g i t r l 的结构特点及分布 人g i t r l ( h u m a ng i t r l ，h g i t r l ) 是t n f 超家族的成员，其胞外区与其 它t n f 家族配体有2 0 的同源性。人g i t r l 基因定位于染色体l q 2 3 ，临近编 码与t n f 同源的f a s l 基因簇，编码1 7 7 个氨基酸，分子量大约为2 0 k d 的同型 三聚体的l l 型跨膜糖蛋白【6 , 1 6 ，胞外区位于多肽链的c 端( a a 5 2 1 7 7 ) 。 小鼠g i t r l ( m o u s eg i t r l ，m g l t r l ) 基因定位于l 号染色体，邻近o x 4 0 l ， 2 江苏大学硕士学位论文 其开放阅读框架包含5 1 9 b p ，编码的蛋白由1 7 3 个氨基酸组成，分子量约为2 0 k d ， 属于t n f 家族i i 型跨膜糖蛋 6 , 1 6 , 2 4 1 ，其中胞质区包含2 1 个氨基酸，跨膜区有 2 3 个氨基酸，胞外区由1 2 9 个氨基酸组成。 g i t r l 表达在巨噬细胞、b 细胞、幼稚及成熟的树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l ， d c ) 和内皮细胞等细胞j 2 1 7 4 ，2 3 ，当促炎因子刺激激活这些细胞后表达升高，t 细胞受刺激后也可表达g i t r l 2 5 1 。其中d c 被l p s 刺激活化后，膜