（中西医结合基础专业论文）朱砂安神丸中朱砂的安全性评价.pdf

删舢棚f f f f f 舢| j f j j 舢i f f j f ey 18 3 7 1 乏岑 贵阳中医学院硕士学位论文相关声明 原创性声明 本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也不包含为获得贵阳中医学院或其他 单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 已在论文中作了明确说明。 作者： 京漭 1 日期： 2 ) 年，月) 彦日 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文；学校可根据国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文。 作者签名京辛翩躲t 门弩 日期：如炒见量日 目录 中文摘要1 英文摘要3 前言5 一日蟊 1 实验材料7 2 实验方法9 3 实验结果1 8 4 讨论3 1 5 结论3 4 参考文献3 5 附录一缩略词表3 7 附录二综述3 8 附录三图片4 3 附录四致谢4 4 贵阳中医学院硕士学位论文 中文摘要 目的：研究朱砂安神丸中所含朱砂的毒性大小，对朱砂安神丸中朱砂的安全 性进行科学评价。方法t 体外比较朱砂安神丸、朱砂与甲基汞( m e h g ) 、氯化汞 ( h g c l 。) 对大鼠嗜铬细胞瘤( p c i 2 ) 细胞、大鼠大脑皮层星形胶质细胞、人肝 h l - 7 7 0 2 细胞的半数致死浓度( l c ) 。急性毒性试验小鼠分别一次灌胃朱砂安神 丸2 5g k g ，朱砂2 0g k g ，m e h g0 1g k g ，h g c l 。0 1 5 9 k g ，观察7 天。亚急 性毒性试验小鼠分别灌胃生理盐水，朱砂安神丸( 2 0g k g d ) ，朱砂( 3g k g d ) ， h g c l ：( 0 0 3g k g d ) ，给药期间观察小鼠日常行为和体重变化，连续给药2 0 天后，检测肝肾功能，肝、肾病理学变化，肝、肾组织中汞( h g ) 蓄积量及m t 一2 m r n a 基因的表达。亚慢性毒性试验大鼠分别灌胃生理盐水，朱砂安神丸( 1 4 g k g d ) ，朱砂( 0 2g k g d ) ，h g c l 。( 0 0 2g k g d ) ，m e h g ( o 0 0 1g k g d ) ， 给药期间观察大鼠日常行为和体重变化，连续给药6 0 天后，检测肝肾功能，肝、 脑、肾病理学变化，肝、脑、肾组织中h g 蓄积量及敏感基因的表达。结果：体 外试验朱砂安神丸中所含h g 对p c i 2 细胞、大鼠星形神经胶质细胞、人肝h l 一7 7 0 2 细胞的l c 鼬远远大于m e h g 、h g c l 。急性毒性试验中朱砂组和朱砂安神丸组小鼠 均未见死亡，亦无异常表现，而m e h g 组、h g c l 。组大鼠三天内全部死亡。亚急性 毒性试验中朱砂组：朱砂安神丸组小鼠日常行为无异常，体重、肝肾功能、病理 学检测与正常对照组比较无显著差异，肝、肾组织中h g 蓄积量较正常组无明显 增高。h g c l 。组小鼠出现明显中毒症状，体重增长明显较正常组缓慢。肝、肾组 织中h g 蓄积量明显增加，m t 一2m r n a 的表达明显增高。亚慢性毒性试验中朱砂 组、朱砂安神丸组大鼠日常行为无异常，体重、肝肾功能、病理学检测与正常对 照组比较无明显改变，肝、脑、肾组织中h g 蓄积量较正常组无明显增高，脑组 织中m t 一3 、b d n fm r n a 的表达明显增高。h g c l 。组大鼠出现明显中毒表现，体重 增长较正常组明显缓慢，肾脏病理学检测见明显的肾小球炎症反应及肾小管损 伤，肝、肾组织中含量明显增加，肾脏增加尤为明显；肾组织中k i m - 1m r n a 的表达明显增高，而孵一l 、淞- 3m r n a 的表达显著降低；肝组织中g s t p im r n a 的表达明显增高。m e h g 组大鼠亦出现明显中毒表现，体重下降，血l d h 、c r e a 、 u r e a 较正常组明显升高。肾脏病理学检测见明显的肾小管损伤；肝、脑、肾组 贵阳中医学院硕壬学位论文 织中h g 蓄积量明显高于正常组；肾组织中k i m - 1m r n a 的表达明显增高，而m t 一1 、 m t 一2 、m t - 3m r n a 的表达显著降低；肝脏组织中g s t - p im r n a 的表达明显增高。 结论：朱砂与朱砂安神丸的体外细胞毒性、急性毒性、亚急性毒性、亚慢性毒性 远远小于h g c l 。、m e h g ，证明h g 的不同存在形式其毒性相差甚远，因此，以总 h g 含量来评价朱砂和朱砂安神丸的安全性不科学且不合理。 关键词朱砂安神丸：朱砂；甲基汞；氯化汞；汞蓄积量；基因；毒性对 比 2 贵阳中医学院硕士学位论文i a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oc o m p a r et h et o x i c i t yo fc i n n a b a r i nz h u s h a - a n 。s h e nw a n ( z s a s w ) ，a n dm a k eas a f e t ye v a l u a t i o n o fc i n n a b a ri nz s a s w m e t h o d ：t h e 。 ： t o x i c i t yo fm e t h y l m e r c u r y ( m e h g ) ，m e r c u r i 。cc h l o r i d e ( h g c l 2 ) ，c i n n a b a ra n d z s a s ww a sc o m p a r e di nc u l t u r e dh u m a nl i v e rh l 一7 7 0 2c e l l s ，p h e c o c h r o m o c y t o m a ( p c i 2 ) c e l l sa n dr a ta s t r o c y t e s m i c ew e r eg i v e no r a l l yc i n n a b a r ( 2 0 g k g ) ，z s a s w ( 2 5g k g ) ，m e h g ( 0 ig k g ) a n dh g c l 2 ( 0 15 9 k g ) o n c e ，a n dt h e t o x i c it yw a se x a m i n e df o r7 d a y s f o r c h r o n i ct o x i c i t y ，c i n n a b a r ( 3 g k g d ) 。z s a s w ( 2 0g k g d ) ，a n dh g c l 2 ( 0 0 3g k g d ) w e r eg i v e no r a l l yf o r 2 0d a y sa n dt o x i c i t yt ot h el i v e ra n dk i d n e yw a se x a m i n e db yp a t h o l o g y t h ea c c u m u l a t i o no fh ga n dt h ee x p r e s s i o no fm e t a l l o t h i o n e i n 一2 ( m t 一2 ) m r n a i nl i v e ra n dk i d n e yw a sd e t e r m i n e d i na n o t h e rs t u d y ，r a t sw e r eo r a l l yg i v e n c i n n a b a r ( 0 2g k g d ) ，z s a s w ( i 4g k g d ) ，a n dh g c i 。( 0 0 2g k g d ) a n d m e h g ( 0 0 0 1g k g d ) f o r6 0d a y st oe x a m i n et h et o x i c i t y r e s u l t ：t h el c t o w a r d sh u m a nl i v e rh l - 7 7 0 2c e l l s ，p c i 2c e l l so rr a ta s t r o c y t ec e l l so f z s a s o rc i n n a b a rw a sm u c hh i g e rt h a nh g c l 2o rm e h g o r a lc i n n a b a ra tad o e so f 2 0g k go rz s a s wa tad o e so f2 5g k gd i dn o tk i l lm i c e ，b u tn om i c ec o u l d s u r v i v em e h ga tad o e so f0 1g k go rh g c l 2a tad o e so f0 1 5g k g s u b a c u t e t o x i c i t ye x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a th g c l 2r e t a r d e db o d yw e i g h tg a i n ；w i t h s i g n i f i c a n ta c c u m u l a t i o no fh gi nt h el i v e r a n dk i d n e y i nc o m p a r i s o n ， m e r c u r ya c c u m u l a t i o na f t e rc i n n a b a ra n d z s a s ww a si n s i g n if i c a n t n o a p p a r e n th e p a ti ca n dr e n a ld y s f u n c ti o n sw e r ee v i d e n tu n d e re x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s ，b u tt h em t 一2m r n al e v e l sw e r em u c hh i g h e ri nh g c l 2g r o u pt h a n o t h e rg r o u p s s u b c h r o n i cs t u d y ( 6 0d a y s ) i ns dr a t ss h o w e dt h a tb o t hz s a s ( 1 4g k g ，c l i n i c a ld o s a g e ，p o ) a n dc i n n a b a r ( 0 2g k g ) w e r em u c hl e s st o x i c t h a nh g c l 2 ( 0 0 2g k g ，p o ) o rm e h g ( o 0 0 1g k g ，p o ) ，a se v i d e n c e db yb o d y w e i g h tl o s s ，s e r o l o g y ，a n dh i s t o p a t h o l o g yo fb r a i n ，l i v e ra n dk i d n e y m e r c u r y a c c u m u l a t i o ni nt h eb r a i n ，l i v e ra n dk i d n e yi nz s a s o r 3 贵阳中医学院硕士学位论文 c i n n a b a r t r e a t e dg r o u p sw a so n l ys li g h t l y ( i 0 7 0 ) b u tn o ts i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nc o n t r o l s ，w h il et h em e r c u r yc o n t e n t si nh g c l 2 一a n dm e h g t r e a t e d g r o u p sw e r e3 1 5f o l d sh i g h e r t h ee x p r e s s i o no fk i d n e yi n j u r ym o l e c u l e 一1 w a si n c r e a s e d6 0 一f o l db ym e h g ，3 一f o l db yh g c l 2 b u tw a su n c h a n g e db yz s a s o rc i n n a b a r ，c o n s i s t e n tw i t ht h eh i s t o p a t h o l o g yo b s e r v a t i o n s i na d d i t i o n ， t h ee x p r e s s i o no fk i d n e ym t 一1 ，m t 一2a n dm t 一3m r n al e v e l sw e r el o w e ri nm e h g a n dh g c l 2g r o u p st h a nz s a so rc i n n a b a r i n1 i v e r ，g s p p im r n al e v e l sw e r e m u c hh i g h e ri nm e h ga n dh g c l 2g r o u p st h a nz s a so rc i n n a b a r i nb r a i n ，t h e e x p r e s s i o no fm t 一3a n db r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ( b d n f ) m r n al e v e l s w e r em u c hh i g h e ri nz s a st h a no t h e rg r o u p s c o n c l u s i o n ：t h ev i t r oc e l l s t o x i c i t y ，a c u t et o x i c i t y ，s u b a c u t et o x i c i t yo rs u b c h r o n i ct o x i c i t yo f c i n n a b a ri nz s a s wi sm u c hl e s st h a nh g c l 2o rm e h g t h er e s u l t si n d i c a t et h a t t h e t o x i c i t y o f m e r c u r yi nd i f f e r e n tf o r m sv a r yg r e a t l y i ti s i n a p p p r o p r i a t et oe v a l u a t et h es e c u r it yo fc i n n a b a ri nz s a s wb a s e do nt o t a l m e r c u r yc o n t e n t k e yw o r d s c i n n a b a r ；z h u s h a - a n s h e nw a n ；m e t h y l m e r c u r y ：m e r c u r i c c h l o r i d e ：t o x i c i t y ：a c c u m u l a t i o n ：m e t a l l o t h i o n e i n 4 贵阳中医学院硕士学位论文 前言 我国传统医学自古就已认识到朱砂是有毒之品，如本草从新言朱砂“独 用多用，令人呆闷。 本草经疏曾指出：朱砂无毒，盖指生砂而言之，若经 伏火及一切烹炼，则毒等砒硇，服之必毙。朱砂为硫化物类辰砂族矿石辰砂，主要 成分为硫化汞( h g s ) ，2 0 0 0 年版中国药典规定炮制朱砂的h g s 含量不低于 9 8 。朱砂具有镇心安神、清热解毒之功效，主治心神不宁证，疮疡肿毒，咽喉肿 痛，口舌生疮等n 1 。朱砂和其他中药配伍应用已有两千多年的历史，延用至今的经 典复方有安宫牛黄丸、朱砂安神丸、万氏牛黄清心丸等，其中朱砂含量分别约为 1 0 、i 0 7 1 3 、1 0 1 7 。 汞( ) 是有毒重金属，在美国毒性物质列表中排在前列乜1 。各种形式的h g 包括元素汞、无机汞、有机汞均可能对人体造成不同程度的毒性损害，可产生神 经毒性、肾毒性、免疫毒性、生殖毒性、胚胎毒性等等1 ，因此国际上将h g 视为 药品严禁掺入物。目前国际上对含朱砂中成药的安全性评价均以其所含的总h g 量 为标准。如欧洲药典对药物中h g 的限量规定为1u g gd ( 其主要是遵循食 品中h g 的限量规定) ，这样含朱砂中成药中h g 含量均严重超标，这不仅影响了 其在临床的应用，也影响了含朱砂中成药的声誉，而且根本无法出口。例如复方 芦荟胶囊含有朱砂，其汞的含量是英国国家允许含量的1 1 7 万倍，治疗风湿性关 节炎的追风透骨丸汞含量也超标几百倍，均被视为毒品。 金属毒性的大小决定于其在机体中细胞水平的浓度，以及原子价态、结合的 配体等。h g 在自然界有三种存在形式：元素汞( 如汞蒸汽) 、无机汞( 如氯化汞、硫 化汞) 和有机汞( 如甲基汞) 。他们在吸收、分布、毒作用模式、排泄上均有较 大差异口j 1 。朱砂所含h g s 的毒性与其他含h g 物质的毒性是否一样? 将朱砂与其他 含h g 物质同样对待是否合理? 用总h g 含量来评价中成药中朱砂的毒性是否合 理? 特别是中药复方配伍后朱砂的毒性是否会发生改变? 针对这些问题，我们选 择了朱砂复方代表之一的朱砂安神丸进行了研究。 朱砂安神丸由朱砂、黄连、地黄、当归、甘草五味药材组成，具有清心养血， 镇惊安神之功效。多用于胸中烦热，心悸不宁，失眠多梦等。朱砂安神丸中朱砂 含量约为1 4 嘲，朱砂中9 8 以上为h g s ，这样朱砂安神丸中h g 含量达到1 1 0 5 贵阳中医学院硕士学位论文 m g g 一，超过欧洲药典对药物中h g 限量的1 1 万倍。本研究中，我们不仅将朱 砂安神丸与单味朱砂进行了毒性对比研究，并且为了与其他含汞物质的毒性进行 对比，我们还选择了h g c l 2 ( 无机汞) 和m e h g ( 有机汞) 作为对照。通过对朱砂安 神丸、朱砂与h g c l 2 、m e h g 的体外细胞毒性、急性毒性、亚急性毒性、亚慢性毒 性对比研究，对朱砂安神丸中朱砂的安全性进行评价，为朱砂安神丸和其他含朱 砂中药复方应用的安全性提供科学依据，为含朱砂中成药早日进入国际市场打下 基础。 6 i 贵阳中医学院硕士学位论文 1 实验对象 1 1 实验细胞 实验材料 人肝h l 一7 7 0 2 细胞株( 购于中国科学院上海生命科学院细胞资源中心) p c i 2 细胞( 贵州省基础药理重点实验室惠赠) 大鼠大脑皮层星形胶质细胞( 贵州省基础药理重点实验室惠赠) 1 2 实验动物 清洁级昆明种小鼠，体重1 8 9 - 2 2 9 ，雌雄各半，购于贵阳医学院实验动物中 心，许可证号：s c x k ( 黔) 2 0 0 2 0 0 0 1 。 清洁级w i s t a r 大鼠，体重1 8 0 9 2 2 0 9 ，雄性，购于贵阳医学院实验动物中心， 许可证号：s c x k ( 黔) 2 0 0 2 - 0 0 0 1 。动物饲料购于贵阳医学院动物实验中心。 2 药品与主要试剂 朱砂安神丸! 哈药集团世一堂制药厂 朱砂北京同仁堂( 毫州) 饮片有限责任公司 h g c l 2贵州省万山特区矿产公司 m e h g美国s i g m a 公司 d m e m 培养基海克隆生物化学制品有限公司 r p m i l 6 4 0 培养基海克隆生物化学制品有限公司 胰蛋白酶 ， 上海生工生物工程有限公司 胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司 m t s 试剂 一 美国p r o m e g a 公司 t r i z o l ( r n a 提取试剂)北京t i a n g e n r n a 纯化试剂盒北京t i a n g e n 逆转录试剂盒美国a b i 公司 r t - p c r 引物美国a g d i a 公司 s y b r 1 3 r e e np c r m a s t e rm ix美国a b i 公司 7 贵阳中医学院硕士学位论文 表1各药物中h g 含量 药物h g 含量( ) 朱砂( 主要成分h g s ) 朱砂安神丸( 含朱砂约1 4 ) 【9 】 氯化汞 甲基汞 约8 4 5 【8 1 约9 0 5 7 3 8 8 9 6 9 3 0 3 3 主要仪器 b s - i l o s 电子天平 a 2 - 1 0 0 型倒置显微镜 通用酶标仪 y j - 1 4 5 0 型超净工作台 3 1 3 1 型二氧化碳培养箱 f 7 3 2 - v 型冷原子吸收测汞仪 m a s t e rc y c l e rg r a d i e n tp c r 仪 i c y c l e r 荧光定量p c r 仪 生物显微图像分析仪 ( r o d i - 5 0 c h ) - r e 纯水器 x - 1 5 r 冷冻离心机 t u - 1 8 1 0 紫外可见分光光度计 e s 3 1 5 自动蒸汽消毒柜 g z x - 914 0 m b e 型电热恒温鼓风干燥箱 8 北京德赛公司 日本n i k o 美国b i o - r a d 苏州净化设备厂 美国t h e r m o 上海华光仪器仪表厂 德国o p p e n d o r f ，a g 美国b i o r a d 公司 m o t i c 公司 r e s e a r c h 科技仪器公司 i 美国b e c k m a n 北京通用分析仪器公司 基因有限公司 上海博迅 贵阳中医学院硕士学位论文 实验方法 1 体外细胞毒性试验 1 1 药物配制 将朱砂、朱砂安神丸、h g c l 2 、m e h g 分别用d m e m 和r p m l l 6 4 0 培养基溶解稀释成 不同浓度( 其中朱砂、朱砂安神丸为混悬液) 。朱砂的浓度为3 、1 0 、3 0 、5 0 、1 0 0 、 1 5 0g l 一，朱砂安神丸的浓度为3 、1 0 、3 0 、5 0 、1 0 0 、1 5 0g l ，h g c l 2 浓度分 别为0 0 1 、0 0 1 2 5 、0 0 2 5 、0 0 5 、0 0 7 5 、0 1 、0 1 2 5 、0 1 5g l - 1 ，m e h g 浓度 分别为0 0 0 7 5 、0 0 1 、0 0 1 2 5 、0 0 2 5 、0 0 5 、0 0 7 5 、0 1 、0 1 2 5 、0 1 5g l 一。 1 2 实验细胞的接种 ( 1 ) 将长满细胞的培养瓶中培养液弃去，用d - h a n k s 液洗涤3 次，去除残 存的胎牛血清。 ( 2 ) 加入l - 2 m l0 2 5 胰酶溶液，使所有细胞都能被浸入到溶液中，室温或 3 7 消化。 ( 3 ) 倒置显微镜下观察细胞的消化状况，待贴壁细胞逐渐变圆时，倒掉胰酶。 ( 4 ) 人肝h l - 7 7 0 2 细胞培养瓶中加入含1 0 胎牛血清的r p m l l 6 4 0 培养基，p c i 2 细胞、大鼠大脑皮层星形胶质细胞培养瓶中加入含1 0 胎牛血清的d m e m 培养基， 终止消化。 ( 5 ) 用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液。细胞计数，调整浓度为1 1 0 5 个m l 。 ( 6 ) 将消化好的人肝h l - 7 7 0 2 细胞、p c i 2 细胞、大鼠大脑皮层星形胶质细胞 分别接种于9 6 孔培养板中，每孔9 0pl 培养基，置于c 0 2 培养箱中( 3 7 。c 、5 c 0 2 、 饱和湿度) 培养。 1 3 细胞毒性试验 ( 1 ) 将不同浓度的m e h g 、h g c l 。、朱砂、朱砂安神丸分别加入已经接种2 4h 的人肝h l - 7 7 0 2 细胞、p c i 2 细胞、大鼠大脑皮层星形胶质细胞培养基中，每孔 1 0i ll ，每个药物浓度设2 个平行对照孔，置于c o ：培养箱中继续培养1 2h 。 ( 2 ) 在9 6 孔板中，每孔加入m t s 试剂l oul ，在3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度 条件下继续培养3h 。 9 贵阳中医学院硕士学位论文 ( 3 ) 将9 6 孔板中各孔中的培养基轻轻吸出，转移至一新的9 6 孔板中( 去除 朱砂和朱砂安神丸自身颜色对吸光度值的影响) 。 ( 4 ) 选择4 9 0n m 波长在酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值( o d 值) ，根据吸 光度值计算细胞存活率。细胞存活率( ) = ( 给药孔o d 值空白对照孔o d 值) i 0 0 2 急性毒性试验 将小鼠随机分为正常组、朱砂组、朱砂安神丸组、m e h g 和h g c l ：组，禁食8 小时后分别一次灌胃生理盐水，朱砂2 0g k g 一，朱砂安神丸2 5g k g 一，m e h g o 1 g k g ，h g c i ：0 1 5 9 k g 。染毒后各组小鼠正常饲养，观察7 天中动物体征变 化和死亡情况。用s p s s l 6 o 统计软件处理各组数据，f i s h e r 精确概率法分析进 行比较，尸 。0 5 为有显著性差异性，p o o l 为有非常显著性差异性。 表2 急性毒性试验小鼠分组、数量，给药剂量、观察时间 注：括号内为药物中汞的含量 3 亚急性毒性试验 ： 健康小鼠4 0 只，随机分成4 组，分别为正常组、朱砂组、朱砂安神丸组、h g c i 。 组，每组1 0 只。分别灌胃生理盐水，朱砂3g k g 一，朱砂安神丸2 0g k g ，h g c l 2 0 0 3g k g 一。每天给药一次，连续2 0 天后称重，断头取血，取肝、肾组织。 l o 贵阳中医学院硕士学位论文 表3 亚急性毒性试验小鼠分组、数量，给药剂量、时间 注：括号内为药物中汞的含量 3 1 小鼠肝、肾功能生化检测 取小鼠血，置于一次性试管中，离心( 10 0 0r m i n ，5m i n ，4 ) 后吸 取血清，全自动生化仪检测血中谷丙转氨酶( a l t ) 、尿素( u r e a ) 、肌酐( c r e a ) 含量( 贵州省人民医院生化检验科检测) 。 3 2 病理学检测 。 取小鼠同一部位肝脏及同侧肾脏，4 甲醛中固定，送贵阳医学院病理教研室 检测。 3 3 冷原子吸收光谱法检测小鼠肝、肾组织中汞蓄积量n k 嘲 ( 1 ) 组织样本消化：将小鼠肝、肾组织( 5 0m g 1 0 0m g ) 称重后，放入消化 灌中，每个样本加入浓h n 0 3 5m l ，移至电热鼓风干燥箱中，1 7 0 c ，放置2 小时。 取出后冷却，将样本消化液移至定容管中，每个样本用去离子水定容至2 5l i i l 。 ( 2 ) 标准曲线的制作：测汞仪通电预热3 0 m i n ，5 0n g m l l 汞标准液，依次 吸取o 、2 、4 、6 、8 、1 0 吐( 相当于0 、i 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0n gh g ) 加入还 原瓶中。加去离子水定容至l oi i l l ，分别加人i 0 0g l1 氯化亚锡溶液2i i l l ，迅 速盖紧瓶塞，待冷原子吸收测汞仪显示最大读数时记录结果，根据记录结果制作 标准曲线。 ( 3 ) 样本测定：吸取样品消化液l om l 于还原瓶中，加人1 0 0g l 。1 氯化亚锡 2i i i l ，迅速盖紧瓶塞，待冷原子吸收测汞仪显示最大读数时记录结果，根据记录 结果计算小鼠肝、肾组织中h g 的蓄积量。 3 4r e a l - t i m ep c r 检测小鼠肝、肾组织中m t 一2 基因表达 3 4 1r n a 的提取 贵阳中医学院硕士学位论文 ( 1 ) 匀浆：取5 0 - - 1 0 0m g 动物组织，加入lm lt r i z o l ，匀浆器匀浆。 ( 2 ) 萃取：匀浆液中加入2 0 0t il 氯仿，用力震荡后离心( 1 20 0 0 r m i n 一，4 c ， 1 0m i n ) 。； ( 3 ) 沉淀：取上清5 0 0ul ，加入异丙醇5 0 0i il ，混匀后离心( 1 20 0 0r m i n ， 4 c ，1 0m i n ) 。 ( 4 ) 清洗：小心弃掉上清液，加入7 5 乙醇8 0 01 1l ，轻晃后离心( 1 20 0 0r m i n ， 4 ，1 0m i n ) 。 ( 5 ) 控干：小心弃掉上清，倒置在滤纸上，控干。 ( 6 ) 溶解：加入1 0 01 tld e p c 水，溶解r n a 。 3 4 2r n a 的纯化 ( 1 ) 上柱：1 0 0plr n a 水、3 5 0 | llr p 裂解液、2 5 0l ll 乙醇混匀，加入纯 化柱中，离心，( 1 20 0 0r m i n 一，4 c ，3 0s e c o n d ) 。 ( 2 ) 冲洗：弃掉滤液，加入5 0 0l il7 5 乙醇，离心( 1 20 0 0r m i n ，4 c ， 3 0s e c o n d ) 。重复一次。 。 ( 3 ) 收集r n a 液：换新e p 管，加d e p c 水1 0 0pl ，离心( 1 20 0 0r m i n 一，4 ，lm i n ) ，收集r n a 水。 3 4 3r n a 纯度检测 5ulr n a 水加入9 9 5pld e p c 水，混匀。紫外分光光度仪检测2 6 0n m 和2 8 0 n m 处的吸光度( o d ) 值。o d 2 6 0 o d 2 8 0 在1 8 2 0 2 _ 间为r n a 纯度较好。根据0 d 2 6 0 值计算r n a 的浓度( r n a 浓度= 0 d 2 6 0 4 0 i jg m l 稀释倍数) ，用d e p c 水将r n a 配制成5 0n g ul 1 的r n a 溶液。 3 4 4c d n a 制备 按试剂盒要求，吸取2l ll 总r n a ，反转录成c d n a 。 反应体系：h ：0 1 8 5l il 2 5mm g c l 2 2 2ul 1 0 xr tb u f f e r 1i ll 1 0m md n t p 2ul 5 0m mo l i g o d t 0 5l il 2 0u 1 il - 1 r n a s e i n h i b i t o r0 2i il 1 2 贵阳中医学院硕士学位论文 5 0 u l al - 1 m u l vr t0 2 5l al 5 0n g i il - 1r n a2l il 逆转录条件：2 5 c ，1 0m i n ；4 8 0 ，6 0m i n ；9 5 c ，5r a i n ；4 ，。 3 4 5 引物序列 目的基因m t 一2 引物序列、，内参基因1 8 s 、b - a c t i n 弓l 物序列见表4 。 表4m i i 一2 、1 8 s 、b a c t i n g 物序列 3 4 6p c r 扩增 逆转录生成的e d n a 水) j h d e p c 水l ：1 稀释。 反应体系：s y b rs u p e rm i x 7 5l al d e p c t k 4pl - 。a 馘 c d n a 3 | il 模板混合液( 1 0t am 上游引物+ 1 0um 下游引物) 0 5l il 反应条件为：( 1 ) 预变性：9 5 9m i n ；( 2 ) 退火、延伸：9 5 1 5s ，6 0 1m i n ， 4 0 个循环。 3 4 7 结果分析处理( 相对定量法) 以c t 值为统计参数： ( 1 ) c ta v e r a g e = ( c t l + c t 2 ) 2 ( 2 ) d c t = c ta v e r a g e 一中间值 ( 3 ) 基因的表达= 2 ( - d c t ) ( 4 ) 相对定量= 目的基因的表达内参基因的表达。 3 5 统计学处理 数据均以均数士标准差( x4 - s ) 表示。使用s p s s l 6 0 统计软件处理各组数 据，各组间用单因素方差分析进行比较，尸如0 5 为有显著差异性，尸如0 1 为有 非常显著差异性。 1 3 贵阳中医学院硕士学位论文 4 亚慢性毒性试验 将w i s t a r 大鼠3 2 只分为5 组，分别为正常组、朱砂组、朱砂安神丸组、 h g c l ：组、m e h g 组。分别灌胃给予生理盐水，朱砂o 2g 。k 9 1 ；朱砂安神丸1 4 g k g 一，h g c l 20 0 2g k g 一，m e h g0 0 0 1g k g 。灌胃给药6 0 天后称重， 断头取血，取肝、肾、脑组织。 表5 亚慢性毒性试验大鼠分组、数量，给药剂量、时间 组别给药剂量( g k g 。1 )数量( n )给药时间( d ) 正常组 朱砂组 朱砂安神丸组 氯化汞组 甲基汞组 生理盐水 o 2( o 1 7 ) 1 4 ( 0 1 7 ) ( 临床等效剂量) o 0 2 ( 0 0 1 5 ) 0 0 0 1 ( 0 0 0 0 9 ) 6 0 6 0 6 0 6 0 6 0 注：括号内为药物所含汞的绝对量。 4 1 大鼠肝、肾功能生化检测 取大鼠血，置于试管中，离心( 10 0 0r m i n 一，5m i n ，4 ) 后吸取血清， 全自动生化分析仪测定小鼠血清中a l t 、u r e a 、c r e a 含量( 贵州省人民医院检验 科检测) 。 4 2 大鼠肝、脑、肾组织病理学检测 取大鼠同一部位肝脏、大脑皮质及同侧肾脏，4 甲醛固定后送贵阳医学院病 理教研室检测。 4 3 大鼠肝、脑、肾组织中h g 蓄积量检测 冷原子吸收光谱法检测大鼠肝、脑、肾组织中h g 蓄积量。 ( 1 ) 样本消化：将大鼠肝、脑、肾组织( 5 0g - 1 0 0g ) 称重后，放入消化 灌中，每个样本加入浓h n o 。5m l ，移至电热鼓风干燥箱中，1 7 0 ，放置2h 。 取出后冷却，将样本消化液移至定容管中，每个样本用去离子水定容至2 5i i l l 。 ( 2 ) 标准曲线的制作：测汞仪通电预热3 0 m i n ，5 0n g m l - 1 汞标准液，依次 吸取o 、2 、4 06 、8 、l om l ( 相当于0 、1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、i4 0 0 、5 0 0n gh g ) 加入还 ： 原瓶中。加去离子水定容至1 0i i l l ，分别加人1 0 0g l 。1 氯化亚锡溶液2i i l l ，迅 1 4 贵阳中医学院硕士学位论文 速盖紧瓶塞，待冷原子吸收测汞仪显示最大读数时记录结果，根据记录结果制作 标准曲线。 ( 3 ) 样本测定：吸取样品消化液l oi i l l 于还原瓶中，加人1 0 0g l1 氯化亚锡2 j n l ，迅速盖紧瓶塞，待冷原子吸收测汞仪显示最大读数时记录结果，根据记录结 果计算大鼠肝、脑、肾组织中h g 的蓄积量。 4 4r e a l - t i m ep c r 检测大鼠肝、脑、肾组织中基因的表达水平 4 4 1r n a 的提取 ( 1 ) 匀浆：取5 0 1 0 0m g 动物组织，加入1i i l lt r i z o l ，匀浆器匀浆。 ( 2 ) 萃取：匀浆液中加入2 0 0ul 氯仿，用力震荡后离心( 1 20 0 0r m i n ， 4 ，1 0m i n ) 。 ( 3 ) 沉淀：取上清5 0 0ul ，加入异丙醇5 0 0i ll ，混匀后离心( 1 20 0 0r m i n ， 4 1 0m i n ) 。 ( 4 ) 清洗：小心弃掉上清液，加入7 5 乙醇8 0 0 | ll ，轻晃后离心( 1 20 0 0r m i n ， 4 ，1 0m i n ) 。 ( 5 ) 控干：小心弃掉上清，倒置在滤纸上，控干。 ( 6 ) 溶解：加入1 0 0uld e p c 水，溶解r n a 。 4 4 2r n a 的纯化 ( 1 ) 上柱? 1 0 0l ilr n a 水、3 5 0plr p 裂解液、2 5 0l il 乙醇混匀，加入纯 化柱中，离心，( 1 20 0 0r m i n 一，4 c ，3 0s e c o n d ) 。 ( 2 ) 冲洗：弃掉滤液，加入5 0 0pl7 5 乙醇，离心( 1 20 0 0r m i n ，4 c ， 3 0s e c o n d ) 。重复一次。 ( 3 ) 收集r n a 液：换新e p 管，加d e p c 水1 0 0i il ，离心( 1 20 0 0r m i n ，4 ，lm i n ) ，收集r n a 水。 4 4 3r n a 纯度检测 5i ll r n a 水加入9 9 5 | ll d e p c 水，混匀。紫外分光光度仪检n 2 6 0n m 和2 8 0 姗 处的吸光度( o d ) 值。o d 2 6 0 o d 2 8 0 在1 8 2 0 2 ：问为r n a 纯度较好。根据0 9 2 6 0 值计算r n a 的浓( r n a 浓度= 0 9 2 6 0 4 0i ig m e 稀释倍数) ，用d e p c 水将r n a 配制 成5 0n g i il _ 的r n a 溶液。 4 4 4c d n a 制备按试剂盒要求，吸取2ul 总r n a ，反转录成c d n a 。 1 5 贵阳中医学院硕士学位论文 反应体系：h ：o1 8 5 | ll 2 5mm g c l 22 2 i il 1 0 r tb u f f e rli ll 1 0m md n t p2 1 tl 5 0m m0 1 i g o d t0 5i jl 2 0u u l l r n a s e i n h i b i t o r0 2 ”l 5 0 u u l m u l vr t 0 2 5 | ll 5 0n g u l r n a2l il 逆转录条件：2 5 c ，1 0m i n t 4 8 c ，6 0m i n ：9 5 ，5m i n t4 ，。 按3 4 1 中的方法进行。 4 4 5 引物序列 目的基因m t 一1 、m t 一2 、m t 一3 、g s t - p i 、k i m - 1 、b d n f 弓 物序列、内参基因b a c t i n 、1 8 s 、g 3 p d h 弓 物序列见表6 。 表6 基因引物序列 g e n eg e n eb a n kf o r w a r d r e v e r s e a c c e s s i o nn u m b e r 4 4 6p c r 扩增逆转录生成的c d n a 水) j i d e p c 水1 ：1 稀释。 反应体系：s y b rs u p e rm i x d e p c 水 c d n a 1 6 7 5ul 4pl 3i il 贵阳中医学院硕士学位论文 模板混合液( 1 0l lm 上游引物+ 1 0 | l m 下游引物) 反应条件为：( 1 ) 预变性：9 5 c9m i r a ( 2 ) 退火、延伸：9 5 c 4 0 个循环。 4 4 7 结果分析处理( 相对定量法) 以c t 值为统计参： ( 1 ) c ta v e r a g e = ( c t l 托t 2 ) 2 ( 2 ) d c t = c ta v e r a g e 一中间值 ( 3 ) 基因的表达= 扩( - d c t ) ( 4 ) 相对定量= 目的基因的表达内参基因的表达。 4 5 统计学处理 0 5l al 1 5s ，6 0 lm i n ， 数据均以均数士标准差( ；s ) 表示。使用s p s s l 6 0 统计软件处理各组 数据，各组间用单因素方差分析进行比较，p o 0 5 为有显著性差异性。p o 0 1 为有非常显著性差异性。 1 7 贵阳中医学院硕士学