（临床检验诊断学专业论文）临床常见曲霉菌体外药物敏感性及分子生物学鉴定方法研究.pdf

目录 中文摘要1 英文摘要3 前言5刖青b 第一部分菌株收集及鉴定7 第二部分抗真菌药物体外敏感性研究1 5 第三部分曲霉菌d n a 提取方法和真菌菌种保藏方法的初步探索2 3 第四部分实时荧光p c r 鉴定曲霉菌方法的建立及评价3 4 全文结论6 8 文献综述7 0 参考文献7 7 缩略词表8 5 论文列表8 6 个人简历8 7 致谢8 9 声明9 0 北京协和医学院硕士研究生学位论文 中文摘要 【目的】探讨临床常见曲霉菌( 烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉) 对经典的抗真菌药物伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素b 和新的抗真菌药物泊沙康唑、 卡泊芬净的体外敏感性：建立应用实时荧光p c r 技术将临床常见曲霉菌鉴定至种 的水平。 【方法】对所收集的真菌通过形态学和或分子生物学鉴定，采用浓度梯度法( e t e s t ) 测定伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素b 及卡泊芬净对5 种曲霉菌的最低 抑菌浓度( m i c ) ；采用液氮研磨、试剂盒纯化方法提取曲霉菌细胞核d n a ，普通 p c r 方法扩增5 种( 4 7 株) 曲霉菌的内转录间隔区( i t s ) ，测序获得i t s 区序列， 基于不同种曲霉菌的i t s 区序列对种特异性探针进行验证和改进，建立实时荧光 p c r 方法将常见曲霉菌通过特异性探针解链温度( t m ) 的差异进行区分并对该方 法的灵敏度、特异性及重复性进行评价。 【结果】形态学观察基本上能将临床常见的5 种曲霉菌鉴定到种，对于其他种属形 态学可以将其鉴定到属的水平，但是较难鉴定到种。卡泊芬净对烟曲霉、黄曲霉、 构巢曲霉的m i c 9 0 均为o 0 9 4 “g 枷，对黑曲霉的m i c 9 0 为o 1 9 p g m l ，在5 种药物中最 低；泊沙康唑对土曲霉的m i c 9 0 最低，为0 0 9 4 “咖l ；对于烟曲霉和黄曲霉，m i c 9 0 由低到高依次为卡泊芬净、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素b ；土曲霉 对两性霉素b 的m i c 均 3 2 岭m l 。m a s t e r p u r e 刑y e a s td n a p u r i f i c a t i o nk i t 提取的 d n a 量很低，固体培养+ 液氮研磨方法、液体培养+ 液氮研磨方法以及固体培养+ 液 氮研磨+ 试剂盒纯化方法提取的d n a o d 2 6 徊d 2 8 0 的均值分别为1 7 3 、1 9 6 和1 8 0 。烟 曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉种特异性探针t m 值分别为6 1 4 、5 7 4 、6 7 7 、 6 5 8 ，土曲霉特异性探针的t m 值为6 4 5 和5 5 2 。实时荧光p c r 方法对烟曲 霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉的检测下限分别为5 6 8 龟、1 1 1 0 龟、1 3 7 龟、 1 2 3 龟、7 8 0 龟。疣状瓶霉和小孢根霉能与烟曲霉特异性探针发生交叉反应。该方法 在每次重复实验中t m 值的波动在o 5 以内。 北京协和医学院硕士研究生学位论文 【结论】形态学结合r d n a i t s 区测序对真菌种的鉴定很有帮助。e t e s t 法体外药敏 结果显示，新的棘白素类抗真菌药物卡泊芬净对五种曲霉具有很好的体外抗菌活 性，唑类药物对于曲霉菌的体外抗茵活性优于两性霉素b 。采用固体培养+ 液氮研 磨法+ 试剂盒纯化法能获得高纯度的曲霉菌d n a 。实时荧光p c r 方法具有很好的灵 敏度、特异性和重复性，能将临床常见的5 种曲霉鉴定到种的水平。 【关键词】曲霉菌；鉴定：实时荧光p c r ；种特异性探针；解链曲线分析 2 北京协和医学院硕士研究生学位论文 a b s t r a c t 【o b j e c t i v e 】t 0m e s t i g a t e 恤i i lv i 仃0 枷劬g a ls u s c 印曲i l i 够o fc l a s s i c 趾de 雠r g i n g 枷丘m g a la g e 船s u c h 嬲v o r i c o n a z o l e ，i t r o c o n a z o l e ，a 叫) h o t e r i c i l lb ，p o s a c o m z o l e 锄d c a s p o 劬g i l lt 0 彳印p 喇z 如堪印弘c o m i n o i l l ye n c o u i l t e r e di nc l i i l i c a l t t i n g 龇1 dt oe 啦l b l i s h a 1 1 de v a l l u a t ear e a l t i i l l ep c r 觞s a yf o ri d e n t i f i c a t i o no f 么印p 呼刀搬互阳t 0s p e c i e sl e v e l 【m e t h o d s 】f u i l g iw e r ei d e n t i f i e db yi n 0 印h o l o g ya i l dm o l e c u l a rb i 0 1 0 盯b e f o r ei i lv i 仃0 a 1 1 t i 劬g a ls u s c e p t i b i l 时t e s t i n g e - t e s tm e 1 0 dw 嬲e m p l o y e df o rm i cd e t e m l i n a t i o no f l e5 孤t i 劬g a la g e n t si 芏1 c l u d i n gv o r i c o n a z o l e ， i 仃o c o n 鼬r o l e ，龇n 1 ) h o 钯r i c i i lb ， p o s a c o n 锄l ea n dc a s p o 劬g i n c o l l s e q u e n t l y ，i t sr e g i o i l si n 曲o s o m ed n a ( r d i n a ) o f 仕l e5 4 妒p 曙f 淞置印 ( 4 7s t r a i l l s ) 、e r e 锄p l i f i e db yc o m m o np c r弱s a y s p e c i e s s p e c i f i cp r o b e s 、r et 1 1 e n c o 砌；i r m e da 1 1 dm o d i f i e da c c o r d i n gt 0s e q u e n c e s a c q u i r e db y q u e n c i n go fi t sr e g i o 璐a f b e rn l 巩ar e a l - 劬ep c r 嬲s a yw 嬲e s t a b l i s h e d f o ri d e n t i f i c 撕o no f 彳印p 曙川嬲暖pt 0s p e c i e sl e v e lb y 廿l ep r o b e s s p e c i 丘cn l e l t i n g t e r n p e r 狐鹏s ( t m ) f i n a l l y ，吐1 es e n s i t i v i 饥s p e c i f i c i 够a i l dr 印r o d u c 时o f 廿1 er e a l - t i m e p c r a s s a y 、e r ee v a l w i t e d 【r e s u l t s 】t h e5 彳印p ，：多川淞戈mc a l lb a s i c a l l yb ei d e n t i f i e db yi n 0 讪o l o 鼢h o w e v e r ， i t sd i m c u l tt oi d e m 毋。廿1 e r 觚g it os p e c i e sl e v e l sb y 廿1 i sm e t l l o d t h em i c 9 0o f c a s p o 劬g i na g a i n s t 彳乒朋堙口觚，4 枷船a 1 1 d 么刀协z 矗瑚w a so 0 9 4 “g m lw h e r e 船t l l e m i c 9 0a g 咖s t 么，z 杠，w 嬲0 19 p g m 1 1 1 1 em i c 9 0o fc a s p o 觚g i i la g a 证s t 恤s e4s p e c i e s w a sm e1 0 w e s ta r n o n gt h e5 趾t i 劬g a la g e n t s f o r 彳甩辔p ，t h em i c 9 0o fp o s a c o i i a z o l e w a sm el o w e s t t i l em i c 9 0a g a i n s t 彳乒聊g 讲螂，彳鲫伽，讲耐a 刀i 酽，i i lo r d e ro f i r l c r e a s i n gw a sc a s p o f l 吼g 洫，p o s a c o n a z 0 1 e ，v o r i c o n a z o l e ，i 臼佻o m 屹o l e ，锄p h o t e r i c i nb t h em i co f 锄p h o t e r i c i nba g a i n s t 彳纪螂、阮sh i g l l e rt h a i l3 2 删i i la 1 17s 仃a i n s t e s t e d 1 1 1 ec o n c e n 仃a t i o no f 彳印p 呼盯淞d na 删e db ym a s t e r p u r e 聊y e a s td n a p 面f i c a t i o nk “i sl o w t h eo d 2 6 0 o d 2 8 0o fd n ae 灯a c t e db ys o l i dc u l t i 鹏谢m1 i q u i d 1 1 i 仃o g e ng 血d i n gm e t h o d ，1 i q u i dc u l t u r ew 曲l i q u i dl l i 仃o g e n 鲥n d 崦m e d ，a 1 1 ds o l i d c u l t u r e 、) l ，i 廿1l i q u i d 砷g e n 蓼i n d i l l gm e t l l o da n dp u r i j f i c a t i o ni s 1 7 3 ，1 9 6a n d1 8 0 ， r e s p e c t i v e l y t h et m v a l u eo f 4 纪玎淞s p e c i f i cp r o b e 、a s6 4 5 0 ca n d5 5 2 0 c ，觚dt 1 1 a to f 彳以聊趣弘r 螂，彳洲淞，彳聆而弦，a n d 彳刀砌z 切龉s p e c i j e i cp r o b e 、2 u s6 1 4 0 c ，5 7 4 0 c ，6 7 7 0 c a n d6 5 8 0 c ，r e s p e c t i v e l y t l l ed e t e c t i o nl m to f4 以m 桕f 螂彳枷螂，彳即谚，彳纪脚 a n d 彳玎胁肠瑚w 觞5 6 8 f g ，1 11 0 龟，1 3 7 龟，1 2 3 龟，7 8 0 龟，r e s p e c t i v e l y 砌妇蛔咖d 阳 v p “s 口册dr 办忍d p 淞所伽印d ，嚣h a dc r o s sr e a c t i o l l s 谢t 1 14 乒聊自弦n 岱s p e c i f i cp r o b e t l l et mv a l u ef l u c 删o nw a sw i t l l i i lo 5o ci nr e p e a t e dr e a c t i o n s 【c o n c l u s i o n 】m o 印h o l o g ) rc o m b m d 谢廿1s e q u e n c i i l go fi t sr e g i o nw 雒h e l p 血lf o r i d e n t i f i c a t i o no f 彳印p 捌螂町礁l e s sc o m m o m ye n c o u n t e r e d t h ei i lv i 们眦i 劬g a l s u s c e p t i b i l 毋o fe t e s tm e m o ds h o w e dt h en e wd m gc a s p o g i i l ，w m c hi sah n do f e c h i n o c a n d m s ，h a d9 0 0 da c t i v 时t o 1 e 伽es p e c i e so f 么印e 删刀螂s p p a n da ut h et e s t e d 仃i a z o l e sh a db e t t e ri i lv i 仃oa c t i v 埘t l l a l lt r a d i t i o n a la i l l p h o t e r i c i nb h i 曲q u a l 毋o f 彳印p 俘刀淞d n ac a u lb ea c q u n db ys o l i dc u l t u r ew i 廿1l i q u i di l i 仃o g e ng r i n d i n ga n d p u r i f i c a t i o n 1 kf i v es p e c i e so f 彳印p 呼刀淞互印c a nb ec l e 砌yd i s t i r 蜒m i s h e db ym e l t i n g c u n ，ea i l a l y s i si l las i n 9 1 er e a c t i o n 1 1 1 er e a l - t i n l ep c ri st i i n e s a v i n ga n dw i t hl l i 曲 s e i l s i t i v i t y ，s p e c i f i c 毋a 1 1 dr e p r o d u c 埘t h e r e f o r e ，i ti sp r o 而s i n gf o rd i a g n o s i so f i n v a s i v e 嬲p e r g i l l o s i s 【k e yw o r d s 】4 印p 删螂置m ；i d e n t i f i c a t i o n ；r e a l - t i m ep c r ；s p e c i e ss p e c i f i cp r o b e ； m e l t i n gc m v ea i l a l y s i s 4 北京协和医学院硕士研究生学位论文 前言 近年来，侵袭性真菌感染在免疫受损患者中的发病率逐年升高，念珠菌属和曲 霉菌属是导致侵袭性真菌感染的主要的机会致病菌【l 】。中性粒细胞减少病人中侵袭 性曲霉病( 队) 的发病率仅次于念珠茵感染【2 捌。i a 已经成为免疫受损患者主要的死因 f 4 】。烟曲霉是i a 患者中最常分离的条件致病菌，其次为黄曲霉、黑曲霉、土曲霉【5 1 。 由于曲霉菌感染缺乏特异性的临床表现，因此i a 的诊断很困难。据估计3 0 的i a 未被诊断【6 1 。认早期诊断并及时使用抗真菌药物治疗可以降低病死率川。近年来， 新的抗真菌药物如伏立康唑、泊沙康唑、卡泊芬净给真菌的治疗提供了更多的选择， 但是，抗真菌药物的种类与抗细菌药物相比仍很少，如何在较少的药物选择中优化 抗真菌药物的治疗是临床医生最为关注的问题，而真菌的体外药敏试验是解决这些 问题的第一步。曲霉菌的体外药敏试验旨在了解临床上常见的曲霉菌对经典的和新 出现的抗真菌药物的体外抗菌活性，从而为临床上治疗真菌感染提供一定的药敏依 据。曲霉菌的体外药敏试验方法主要有：美国临床与实验室标准化委员会( c l s i ) 推荐的肉汤稀释法( m 3 8 - a ) 、纸片扩散法( m 4 4 - a ) 、e t e s t 法，其中肉汤稀释法 重复性好，但是其操作繁琐，不适合临床常规应用；纸片扩散法目前较少采用，抗 真菌药物种类仅有氟康唑和伏立康唑：e e s t 方法操作简单、重复性好、影响因素较 少，本实验采用e t e s t 方法测试临床常见的曲霉菌对五种抗真菌药物的药敏活性。 由于不同种的曲霉菌对抗真菌药物的敏感性不同，某些曲霉菌对抗真菌药物的 敏感性降低，如唑类耐药的烟曲霉在增纠8 9 】，构巢曲霉和土曲霉常常对两性霉素耐 药【1 0 ，1 1 】，因此将曲霉菌鉴定到种可以更有针对性地选择和使用抗真菌药物。此外， 鉴定到种的水平还可以确定感染性疾病的病因，进行流行病学分析，有助于医院感 染控制【3 ，1 2 】 目前，微生物实验室诊断侵袭性曲霉菌病的方法主要有：( 1 ) 新鲜体液标本直 接镜检( 2 ) 组织标本病理学检查( 3 ) 真菌培养和鉴定( 4 ) 血清学方法。直接镜 检简便、快速、实用。在无菌体液的直接镜检中发现曲霉菌成分常可确立i a 的诊断， 但在有菌部位则只有发现大量菌丝才具有诊断意义【1 3 】。直接镜检法阳性率低，阴性 结果不能排除诊断，而且不能将真菌鉴定到种的水平。组织病理学检查是侵袭性真 菌感染诊断的金标准，但是该方法往往通过开放肺活检和经支气管肺活检获得肺组 北京协和医学院硕士研究生学位论文 织标本【1 4 1 ，严重血小板减少的病人不能进行这种侵入性检查【1 5 】，且该方法也不能将 曲霉菌鉴定到种的水平。真菌培养可以将常见的曲霉菌根据茵落特点和显微镜下产 孢特点进行观察并鉴定到种，但培养所需时间长。血液、支气管吸取物、支气管肺 泡灌洗液标本培养结果往往阴性【1 6 1 7 ，1 引。在确诊侵袭性曲霉病的患者中，只有5 0 的患者的支气管肺泡灌洗液能获得阳性培养结果【1 9 1 。血清学方法同样不能区分菌 种，曲霉菌循环抗原1 ，3 p d 葡聚糖的检测在曲霉菌感染早期诊断中的价值尚存在 争议【2 0 】，研究局限于粒细胞减少的患者中。 上述临床需要和实验室现有诊断技术之间的矛盾要求我们发展一种快速、准确 将真菌鉴定到种的诊断技术来帮助诊断、治疗侵袭性真菌感染。分子生物学技术已 经越来越多地应用于曲霉菌鉴定、分型、耐药基因检测等方面，基于p c r 技术的各 种分子生物学检测得到了广泛应用，如一步法p c r 随机扩增多态性d n a ( 砒心d ) ， 重复序列p c r ，巢式p c r ，p c r - 限制性片段长度多态性( i u l p ) ，p c r - 酶联免疫方 法( e i a ) ，实时荧光p c r ，基因芯片等1 1 2 1 。实时荧光p c r 从荧光分析所获得的数据 对p c r 产物直接进行分析，并不需要另外的繁重和费时的操作( 如凝胶电泳或d n a 杂交分析) 来对p c r 产物进行分析。对结果所进行的直接、简便的分析还减少了所 需要的样品处理步骤，因此也减少了样品被污染的危险性。 大部分关于曲霉分子鉴定的研究中通常选择不同的靶位设计曲霉属通用引物 或烟曲霉特异性引物，国内临床尚无应用实时荧光p c r 将5 种曲霉菌鉴定到种的水平 的研究。本研究首次对此进行了尝试，结果也显示该方法具有很好的临床应用前景。 6 北京协和医学院硕士研究生学位论文 一、材料 第一部分菌株收集及鉴定 材料与方法 1 实验菌株 本研究共选取北京协和医院临床微生物室2 0 0 5 2 0 0 8 年收集的曲霉菌临床分离 株5 6 株，其他少见真菌临床分离株感染性内绿霉、小孢根霉及疣状瓶霉各1 株； 其他医院( 南京军区总医院、浙江省人民医院、上海第一人民医院、江苏省人民医 院、中山大学附属一院、中山大学附属二院、中国医科大学附属二院) 收集的曲霉 菌5 1 株；中国普通微生物菌种保藏管理中心( c g m c c ) 标准菌株4 株，包括烟曲 霉c g m c c 3 7 7 2 ，黄曲霉c g m c c 3 4 4 1 0 ，黑曲霉c g m c c 3 4 5 2 3 ，土曲霉 c g m c c 3 2 8 2 2 ：美国病理学会( c a p ) 质控菌株杂色曲霉f 0 5 ，斜卧青霉f 1 0 ，链 格孢属f 0 2 ，枝孢霉属f 0 8 和疣状毛癣菌f 1 1 各1 株菌株。曲霉菌包括了烟曲霉5 1 株、黄曲霉3 6 株、黑睦霉9 株、土曲霉8 株、构巢曲霉7 株、杂色曲霉1 株。 2 主要试剂 沙保弱葡萄糖琼脂( s d a ) 干粉：美国b d 公司 土豆葡萄糖琼脂( p d a ) 干粉：英国o x o i d 公司 改良察氏琼脂( c z a ) 干粉：英国o x o i d 公司 乳酸酚棉兰：美国b d 公司 3 主要仪器设备 纯水机：北京市双峰纯水设备厂，型号g n r o 3 0 电子天平：d e n v e ri n 咖1 m e n tc o m p a n y ，型号a a - 2 5 0 微波炉：格兰仕( g a l a n z ) ，型号聊7 0 0 p 1 7 脉动真空灭菌器：北京新华灭菌，型号x g l d m x d o 3 6 恒温水箱：北京长风仪器仪表公司，型号h h w 2 1 6 0 0 定量分配器：c o l e - p a 衄e ri n s t n l l i l e n tc o m p a l l y ，型号m a s t e rf l e xl s7 5 1 8 - 1 0 ) 超净工作台：北京亚泰科隆，型号b c l 1 8 0 0 a 7 北京协和医学院硕士研究生学位论文 4 冷藏库：英国p o r k k a 公司 生物安全柜：1 kb a l 【e rc o m p a i l y ，型号s g - 6 0 3 霉菌培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂，型号m 一2 5 0 b - z 光学显微镜：日本o l y m p u s 公司，型号u m d o b 4 主要耗材 一次性无菌塑料培养皿( 环氧乙烷灭菌) ：青岛阿尔发医疗器械有限公司，规格 9 0 1 5 m m 一次性无菌塑料接种环：意大利c o p 删公司，规格1 0 m 封口膜：美国p a r a f i l m 公司，规格1 0 0 m m 3 8 m 5 真菌培养基配制 5 1 加氯霉素的s d a 培养基的配制陵订 将s d a 干粉2 6 9 溶于4 0 0 “蒸馏水中； 1 2 1 高压灭菌2 0 m i i l ： 冷却至6 0 左右时，加入氯霉素溶液0 2 “( 1 2 5 m 咖1 ) ，混匀后用定量分配器定 量( 约2 5 1 1 1 1 ) 倒入9 0 m m 无菌平皿中，凝固后放冰库备用。 5 2p d a 培养基的配制乜幻 将p d a 干粉1 5 6 9 溶于4 0 0 “蒸馏水中； 1 2 1 高压灭菌2 0 m i n ； 冷却至5 0 左右时定量( 约2 5 1 1 1 1 ) 倒入9 0 n 1 i n 无菌平皿中，凝固后放冰库备用。 5 3 改良c z a 培养基的配制乜2 3 将c z a 干粉1 8 2 9 溶于4 0 0 砌蒸馏水中； 1 2 1 高压灭菌2 0 m i i l ； 冷却至5 0 左右时定量( 约2 5 “) 倒入9 0 i 砌无菌平皿中，凝固后放冰库备用。 二、方法 1 曲霉菌的接种及培养 用一次性无菌塑料接种环挑取少量石蜡油封闭的曲霉菌，以三点式接种于s d a 、 p d a 及c z a ，将培养基用封口膜封住并将培养基倒置于2 8 霉菌培养箱中培养 r 北京协和医学院硕士研究生学位论文 3 4 d 。 2 形态学鉴定 2 1 茵落形态 直接观察菌落的生长速度、大小、颜色。 2 2 显微镜下形态 将乳酸酚棉兰适量滴于载玻片上，用透明胶条粘取培养基上2 8 生长3 - 4 d 的 菌落，压片后显微镜下观察孢子、菌丝的形态特点。 3 分子生物学鉴定( 详见第四部分) 对于形态学难以鉴别的菌株，采用p c r 方法扩增r e i n a i t s 区，之后进行测序、 序列比对。 结果 1 形态学鉴定结果 1 1 菌落形态( 图1 1 ，图1 2 ) 1 2 显微镜下形态( 图1 3 ，图1 4 ) 2 分子生物学鉴定结果( 表1 1 ) 表1 18 株真菌形态学鉴定结果和测序结果比较 9 图1 1 不同曲霉菌在s d a 上菌落形态 ( 1 6 分别为烟曲霉，黄曲霉，土曲霉，构巢曲霉，杂色曲霉，黑曲霉) 1 0 北京协和医学院硕士研究生学位论文 图1 2c a p 菌株在s d a 上菌落形态 ( f 0 2 链格孢属，f 0 8 枝孢霉属，f 1 0 斜卧青霉) 熬聂= 翟h 龟满蘸疆燃 曛 陡敞；一+ 月 k 凑溪嚣薯罗呵“弋骥豢篓瓣 霸 醚澎罄2 翁 翟黪鬻 ：一，曼，z ? ；鞫 麟鏊搂罗黔，。i l 酒 l 。 j 鬈麓鼍叠。霉侉罐糕 ，：。一 * 笺笺溷，- - 一。t 。一、j 。1 。t l 。_ s ：- _ _ 。一。：。 图1 4 不同曲霉菌光镜下形态 1 2 北京协和医学院硕士研究生学位论文 ( 1 6 分别为烟曲霉，黄曲霉，土曲霉，构巢曲霉，杂色曲霉，黑曲霉；其中1 1 0 0 0 ，2 、3 、4 、6 4 0 0 ，5 1 0 0 ) 讨论 曲霉菌的培养过程看似简单，但有很多细节值得注意。首先要防止污染。空气 中存在大量的曲霉孢子，每立方米的空气中的真菌孢子数量达到2 0 万个瞄】，若培养 基暴露于空气中则很容易被污染，所以曲霉接种必须在生物安全柜内进行。由于曲 霉菌通常用石蜡油保存，在挑取石蜡油封闭的菌落时难以避免污染接种针柄的部 位，若使用非一次性的接种针必须保证接种针柄的部位高温灭菌，以防止在接种下 一个标本时交叉污染。因此建议使用一次性接种环。其次要采用三点式接种。这是 因为石蜡油过多会抑制曲霉菌的生长，而三点式接种随着三次点种接种环上的石蜡 油会逐渐减少，因此即使初次蘸取石蜡油较多，在第二次及第三次接种的位置上也 会有曲霉菌菌落生长。第三是培养条件。培养的湿度和温度都会影响曲霉菌孢子的 产生。曲霉菌在3 5 培养较之在2 8 培养能产生更多孢子。虽然曲霉菌的生长需 要一定的湿度，但过多的水分对其生长是有害的。大多数丝状真菌在淹没培养中不 能形成孢子，同时由于淹没发生厌氧而限制生长【2 3 1 。所以曲霉菌在培养时培养基必 须倒置，防止菌落被水分浸润。 为了使显微镜下能观察到较清晰的茵丝和孢子结构，曲霉菌生长时间不能太 长。如果生长时间过长，曲霉菌产孢量太大，加上色素的影响，观察者不容易看清 菌丝和孢子的结构。对于烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和构巢曲霉，2 8 生长3 4 d 进 行镜下观察；黑曲霉产孢量大，2 8 生长2 3 d 即可。此外，在压片时要避免压得 太厚，用透明胶条缓慢、轻柔压一下即可。透明胶条缓缓贴在玻片上，避免产生 气泡。 不可否认真菌形态学观察仍然是真菌鉴定的重要手段，但是其耗时长，常常需 要数天的时间对菌落的生长速度、菌落色素的变化及发育成熟的孢子及菌丝的形态 进行观察。对于不产孢的菌株，形态学鉴定很困难【1 2 】。国内很多医院尚未开展真菌 实验室检验，因此真菌形态学鉴定很薄弱，需要有经验的实验室技术专长人员来进 行。常用的真菌培养基主要有s d a 、p d a 和c z a ，s d a 是真菌的分离培养基，p d a 是分离鉴定真菌较好的培养基，c z a 常用来分离鉴定青霉和曲霉。2 8 培养条件下， 曲霉菌在s d a 上生长最快，p d a 上次之，c z a 上生长最慢，但是c z a 上生长的 1 3 北京协和医学院硕士研究生学位论文 曲霉在光镜下形态更典型。 大部分真菌i t s 区测序的结果和形态学特点一致，但是某些菌株i t s 区测序结 果和形态学特点并不吻合或者b l a s t 比对同源性很低。这种情况首先考虑测序结果 是否准确，要到专业测序公司并且双向测序：其次若该菌株是较为少见的菌种，提 交到g e n b a i l l 【数据库中关于该菌种的序列信息不全面有时甚至是错误的，因此不能 完全依赖g e n b 锄k 【1 刁：此外文献报道i t s 区适于鉴定曲霉菌种，但是对于其他种属 的真菌i t s 可能并不是最理想的靶序列。当出现这种不一致时，还是要以形态学结 果为准，若形态学不能鉴定到种，报告至属的水平即可。 综上，真菌的形态学鉴定是真菌鉴定的传统方法，根据形态学能将临床常见的 烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉和构巢曲霉鉴定开来，但是要求实验室人员具有 一定的经验，而且形态学鉴定最大的缺点在于其耗时长，因此，亟待发展新的真菌 鉴定方法。 1 4 北京协和医学院硕士研究生学位论文 一、材料 第二部分抗真菌药物体外敏感性研究 材料与方法 1 实验菌株 药敏试验测试的菌株包括经形态学鉴定的曲霉菌1 0 7 株，分为两部分，5 6 株来 自于北京协和医院细菌室2 0 0 5 2 0 0 8 年收集的曲霉菌，其中常见曲霉菌如烟曲霉、 黄曲霉、黑曲霉选取的标准是至少具备下述三个条件之一：( 1 ) 来自于无菌部位标本 或者是来自于深部呼吸道标本的分离株，如支气管肺泡灌洗液、保护性毛刷、支气 管吸取物、纤维支气管镜痰以及肺活检组织标本；( 2 ) 标本中同一种茵生长出一个菌 落以上的分离株；( 3 ) 标本反复培养均培养出同一种菌的分离株。每份患者重复分离 菌株只选首次分离株。5 1 株来自于其他医院所收集的侵袭性感染曲霉菌，其中南京 军区总医院9 株、浙江省人民医院2 株、中国医科大学附属二院4 株、江苏省人民 医院7 株、中山大学附属一院2 株、中山大学附属二院、3 株、上海第一人民医院 2 4 株。采用常规方法鉴定，1 0 7 株受试菌株中烟曲霉5 0 株、黄曲霉3 5 株、黑曲霉 8 株、土曲霉7 株、构巢曲霉7 株。本研究采用近平滑念珠菌a t c c2 2 0 1 9 作为药 物试验质控株。 2 主要试剂 p d a 干粉：英国o x o i d 公司 r p m il6 4 0 干粉：g i b c o 刑i n v i 仃0 9 e nc o 印。洲o n 2 ( n 吗啡) 乙基磺酸( m o p s ) 干粉：北京欣经科生物技术有限公司 无水葡萄糖( 分析纯) ：国药集团化学试剂有限公司 m h 琼脂粉：英国o x o i d 公司 吐温一2 0 ( t 、e e n - 2 0 ) ：美国s i g i i l a 公司 0 9 氯化钠注射液：北京双鹤药业股份有限公司 伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素b 及卡泊芬净e t e s t 药敏条：瑞典a b b i o d i s k 公司 1 5 北京协和医学院硕士研究生学位论文 3 主要仪器设备 纯水机：北京市双峰纯水设备厂，型号g n r o 3 0 电子天平：d e i l 、，e ri n s 廿l 姐e n tc o m i ) a 1 1 y ，型号a a 一2 5 0 微波炉：格兰仕( g a l a n z ) ，型号聊7 0 0 p 1 7 脉动真空灭菌器：北京新华灭菌，型号x g l d m x d o 3 6 恒温水箱：北京长风仪器仪表公司，型号h h w 2 1 6 0 0 定量分配器：c o l e p a n i l e ri n s t m m e n tc o m p a n y ，型号m a s t c rn e xl s7 5 1 8 - 1 0 ) 超净工作台：北京亚泰科隆，型号b c l 1 8 0 0 a 4 冷藏库：英国p o r k k a 公司 生物安全柜：t h eb a l 【e rc o m p 锄y ，型号s g - 6 0 3 微量加样器：德国e p p e n d o r f 公司 漩涡振荡器：江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，型号q l 8 6 6 比浊仪：美国b d 公司，型号p h o e i l i x s p c c 电热恒温培养箱( 木门) ：a h s e c o0 8 3 6 1 4 主要耗材 一次性无菌塑料培养皿( 环氧乙烷灭菌) ：青岛阿尔发医疗器械有限公司，规格 9 0 1 5 m m 一次性无菌塑料接种环：意大利c o p a n 公司，规格1 0 山 一次性无菌塑料吸管：青岛阿尔发医疗器械有限公司，规格3 “ 一次性使用消毒棉签：北京德康卫生用品有限责任公司 微量离心管：北京欣隆福医药销售有限公司 普通吸头：北京欣隆福医药销售有限公司 封口膜：美国p a r a f i l m 公司，规格1 0 0 n 皿3 8 m 5 主要溶液及配制 5 1r p m i l 6 4 0 培养基( 广州乐通泰公司提供说明书) 将葡萄糖8g ，m o p s1 3 8g 溶于3 9 51 1 1 l 蒸馏水中，搅拌混匀后用1 nn a o h 调 节p h 为7 0 ，之后加入6g 琼脂粉； 1 2 1 高压灭菌2 0 商n ； 1 6 北京协和医学院硕士研究生学位论文 冷却至6 0 左右时加入4 1 6gr p 营养粉( 含l 谷氨酰胺) ，混匀后 导入9 0i l 珊无菌平皿中，使其厚度为4i 姗左右，于4 保存一周。 5 2 p d a 斜面培养基配制2 2 】 将p d a 干粉1 5 6g 溶于4 0 0i i l l 蒸馏水中； 1 2 1 高压灭菌2 0i i 血l ； 冷却至5 0 左右时分装至已高压的玻璃试管中，每管约2n d 摆放成斜 面，于4 保存一周。 5 3 含o 5 吐温2 0 盐水 将0 5 “吐温2 0 加入到1 0 0 血o 9 的氯化钠注射液中； 1 1 5 高压灭菌2 0 m i n ，备用。 二、方法 1 e t e s t 法药敏试验 用无菌吸管吸取1 “含0 5 吐温2 0 盐水于p d a 上生长7d 的曲霉菌 落，并轻轻吹打使之形成菌丝和孢子悬液； 将菌悬液转移到微量离心管中，漩涡振荡混匀后静置15i i l i n ； 吸取静置后的上清液，用o 9 氯化钠注射液将其调整为0 5 麦氏浊度( m c f ) ； 用无菌棉签蘸取o 5m c f 的茵悬液，将棉签在试管壁上轻轻挤压除去多余水分， 在r p 1 6 4 0 培养基上沿三个方向密涂： 将涂上菌液的培养基置于生物安全柜中151 1 1 i n 左右，待其表面干燥； 用无菌镊子将e t e s t 药敏条小心贴于培养基表面，9 0i 砌平皿贴1 2 条，用封口 膜将培养基封口； 将培养基置于塑料袋中，3 5 孵育2 4 4 8 h 读取结果。质控菌株a t c c 2 2 0 1 9 于 3 5 孵育2 4 读取结果； 读数原则：抑菌圈和e t e s t 条相交处的刻度即为最低抑菌浓度( m i c ) 。 2 数据分析 将所有测试的曲霉菌对5 种抗真菌药物的m i c 值输入药敏分析软件 w h o n e t 5 4 ，通过软件计算m i c 5 0 、m i c 9 0 、m i c 范围等参数。 1 7 北京协和医学院硕士研究生学位论文 结果 1 e t e s t 法曲霉菌体外药敏m i c 的判读方法( 图2 1 2 5 ) 2 质控菌株药敏结果( 表2 1 ) 表2 1 a t c c 2 2 0 1 9 质控菌株的m i c 允许范围及质控菌株药敏结果 3 曲霉菌体外药敏试验结果( 表2 2 ) 表2 2e t e s t 法伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素b 、 卡泊芬净对曲霉菌的m i c s m i c s 菌种( 菌株数) 抗真菌药 m i c 范围( p g m 1 ) m i c 5 0m i c 9 0 g e o m m e a n 烟曲霉( 5 0 ) v o r i c o n a z o l e0 0 9 4 0 3 8o 1 9o 2 5 o 1 7 8 黄曲霉( 3 5 ) 黑瞳霉( 8 ) 土曲霉( 7 ) 构巢曲霉( 7 ) i t r a c o n a z 0 1 eo 0 6 4 6 41 1 51 0 3 1 p o s a c o n a z 0 1 eo 0 1 6 1 50 0 9 40 1 9o 0 9 7 a m p h o t e r i c i nb o 0 0 6 612 0 7 2 4 c a s p o f u n g i n 0 0 3 2 0 1 2 5o 0 9 40 0 9 4o 0 6 8 v o r i c o n a z 0 1 e0 0 9 4 一o 5o 2 5o 3 8 o 2 5 i t r a c o n a z 0 1 e 0 0 4 7 4o 7 51 5o 5 8 2 p o s a c o n a z o l e0 0 0 1 一o 7 5o 0 9 40 2 50 1 a m p h o t e r i c i nb 1 6 4 6 46 42 5 2 3 c a s p o f u n g i n o 0 1 6 一o 1 9o 0 4 70 0 9 4o 0 4 2 v o r i c o n a z o l eo 2 5 0 7 50 3 8o 7 5o 3 7 9 i t r a c o n a z 0 1 e1 6 4 6 46 43 8 0 5 5 p o s a c o n a z 0 1 eo 1 2 5 1o 3 81 0 3 4 8 a m p h o t e r i c i nbo 0 4 7 6 4o 1 2 56 4o 3 0 7 c a s p o f u n g i n 0 0 2 3 0 1 9o 1 2 5o 1 9 o 0 8 2 v o r i c o n a z 0 1 e o 2 5 一o 5o 3 80 5o 3 4 3 i t r a c o n a z o l eo 0 4 7 0 1 2 5o 0 9 40 1 2 50 0 8 7 p o s a c o n a z 0 1 e0 0 3 2 一o 0 9 4o 0 6 4 0 0 9 40 0 6 5 a m d h o t e r i c i nb6 4 6 46 46 46 4 c a s p o f u n g i no 0 1 6 一o 1 90 0 6 40 1 9o 0 6 2 v o r i c o n a z 0 1 e0 0 9 4 一o 1 2 5o 1 2 50 1 2 50 1 1 1 i t r a c o n a z o l e0 1 9 0 7 5o 50 7 5 0 3 7 1 p o s a c o n a z 0 1 e 0 0 6 4 一o 1 2 5o 0 9 40 1 2 5o 0 9 3 a m p h o t e r i c i nb 0 3 8 212o 8 8 6 鱼兰巳q 垒卫g i 卫q ：q 垒z = q ：q 2 垒q ：q 鱼垒q ：q 2 垒 q ：q 鱼墨一一 1 8 2 12 2 2 3 2 42 5 1 9 北京协和医学院硕士研究生学位论文 图2 1 ：伊曲康唑对黄曲霉的m i c = 0 3 8 “ 图2 2 ：两性霉素b 对黄曲霉的m i c 3 2 斗鲋【i l l 图2 3 ：伏立康唑对烟曲霉的m i c = o 1 2 5 删 图2 4 ：泊沙康唑对烟曲霉的m i c = o 0 9 4 “幽m 图2 5 ：伊曲康唑对黑曲霉的c 3 2 删 表2 2 数据显示，两性霉素b 对五种曲霉的m i c 在五种抗真菌药物中最高。 对于烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉，卡泊芬净在五种抗真菌药物中的m i c 9 0 最 低，卡泊芬净对烟曲霉、黄曲霉、构巢曲霉的m i c 9 0 均为0 0 9 4 p g 枷，对黑曲霉的 m i c 9 0 为o 1 9 p g 枷。泊沙康唑对土曲霉的m i c 9 0 最低。对于烟曲霉、黄曲霉，m i c 9 0 由低到高为卡泊芬净 泊沙康唑 伏立康唑 伊曲康唑 两性霉素b 。对于黑曲霉， m i c 9 0 由低到高排列为卡泊芬净 伏立康唑 泊沙康唑 3 2 嵋1 1 1 l 。对 于土曲霉，m i c 9 0 由低到高排列为泊沙康唑 伊曲康唑 卡泊芬净 伏立康唑 3 2